СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для создания растений подсолнечника, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, а также с измененным составом жирных кислот или запасных белков.

Подсолнечник принадлежит к четырем главным масличным культурам мира, а для России является главной масличной культурой, обеспечивающей в питании населения до 30% потребляемых энергокалорий в виде растительного масла, маргаринов и жиров, произведенных на основе подсолнечного масла.

Высокоурожайные и высокомасличные сорта и линии подсолнечника в настоящее время могут быть созданы методами традиционной селекции. Однако потери урожая от неблагоприятных климатических факторов, поражения фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми все еще очень велики. Поэтому имеется настоятельная необходимость в радикальном улучшении созданных сортов подсолнечника, увеличении их продуктивности в условиях разнообразных биотических и абиотических стрессов.

В отношении многих важных сельскохозяйственных культур задача получения растений, устойчивых к стрессовым факторам или с измененным качеством продукта, успешно решается путем использования генно-инженерных технологий. Например, в настоящее время трансгенные сорта картофеля, хлопка, риса, гибриды кукурузы, устойчивые к насекомым и гербицидам, а также сорта рапса и сои с измененным составом жирных кислот занимают десятки миллионов гектаров в США, Аргентине, Канаде и Китае. Трансгенные сорта кукурузы, устойчивые к насекомым, начинают распространяться в Европе. Хотя самые первые работы по генетической трансформации клеток растений были осуществлены именно на подсолнечнике, развитие генно-инженерных работ с подсолнечником отстает. Так, на сегодняшний день в США и странах Европы зарегистрировано 2870 полевых испытаний трансгенной кукурузы, а подсолнечника - только 29. Для России подсолнечник является наиболее рентабельной и основной масличной культурой, поэтому создание растений подсолнечника, устойчивых к разнообразным неблагоприятным условиям среды, представляется весьма важной экономической задачей.

Ограниченность полевых испытаний, проводимых с подсолнечником, объясняется недостаточными успехами в разработке эффективных методов генетической трансформации этой масличной культуры. Воспроизводимая технология генетической трансформации подсолнечника была получена значительно позже, чем для других важнейших сельскохозяйственных культур, а первые полевые испытания его трансгенных линий были начаты только в 1991 г.

Многочисленные попытки повторить первую методику трансформации подсолнечника, о которой сообщалось Everette с сотр. (Bio/Technology, 5:1201; 1987), не увенчались успехом.

Впервые воспроизводимый способ получения трансгенного подсолнечника был опубликован в 1990 г. (В. Schrammeijer et al., Plant Cell Report, 9: 55-60, 1990), в котором использовалась методика агробактериального переноса генов в апикальную меристему проростков. Эффективность трансформации в этом методе составляла всего лишь сотые доли процента.

В дальнейшем методика, основанная на агробактериальной инфекции, была улучшена (D. Bidney et al., Plant Mol. Biol., 18: 301-303, 1992) за счет того, что перед сокультивацией с агробактерией эксплант подвергался поранению бомбардированием микроскопическими частицами металла. Эффективность трансформации была доведена до 2-4%.

В 1994 году были опубликованы данные о достижении в отдельном случае, при использовании метода D. Bidney до 7% эффективности трансформации, при невысокой химерности трансформантов (N.Knittel et al, Plant Cell Report, 14: 81-86, 1994). Такой эффективности не удалось повторить никому, даже в лаборатории, в которой была проделана эта работа.

Также в начале девяностых годов R. Peerbolt из "Van der Have Research" была создана методика трансформации подсолнечника и получено несколько десятков трансгенных растений, устойчивых к гербицидам. Однако эта методика не запатентована, ее протокол сохранен авторами в тайне. Именно компаниями Van der Have и Pioneer в настоящее время ведется наиболее успешная работа по созданию трансгенных растений подсолнечника. Полевые испытания трансгенных линий, гибридов и сортов подсолнечника, устойчивых к глифосату и другим гербицидам, в течение нескольких лет проводятся этими компаниями, а в последние два года также компанией "Monsanto", в Аргентине и США. Над разработкой методов генно-инженерного улучшения подсолнечника также работают лаборатории в Страсбурге (Франция), Университете Северной Дакоты, Фарго (США), а также лаборатория клеточной инженерии растений Центра "Биоинженерия" Российской Академии Наук.

Опубликованный в научной печати метод D.Bidney et al., помимо его невысокой эффективности, имеет еще один существенный недостаток: вследствие многоклеточности апекса семянки, а также недостатков применяемых способов селекции и регенерации трансформантов, часть полученных этим способом трансформантов имеет химерную природу, что означает, что наряду с истинно трансформированными тканями, полученные растения имеют также ткани, не несущие вводимых гетеролочных генов, что существенно затрудняет отбор в потомстве истинных трансформантов.

Как уже упоминалось выше, работа с подсолнечником как объектом культуры клеток связана со значительными трудностями и регенерация растений подсолнечника in vitro была осуществлена впервые в конце восьмидесятых - начале девяностых годов. Один из способов такой регенерации был разработан автором с сотр. в 1990 г. (SU 1720596 А1, МКИ 5 С 12 N 5/04, 1992). Согласно этому способу получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с использованием модифицированной среды MS (Murashige T., Skoog F., Phisiol Plant 15:473-497, 1962).

В предлагаемом по данному изобретению способе получения трансгенного растения подсолнечника решается задача снижения возможности формирования химерных трансформантов, а также увеличения частоты желаемой трансформации.

Указанная задача решается тем, что в способе получения трансгенных растений подсолнечника, включающем обработку клеток меристематической ткани подсолнечника, способной к регенерации целых растений, бомбардированием их микрочастицами твердого вещества, трансформацию указанных клеток меристематической ткани сокультивированием с агробактерией, которая содержит вектор, несущий полезный или маркерный гены, а также ген устойчивости к антибиотику или гербициду, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них целых растений, используют индукцию апикальных меристем, способных к регенерации целого растения, вызванную воздействием модифицированной среды MS (Murashige & Skoog) в культивируемых in vitro гипокотилях подсолнечника тем, что модифицированная среда MS для индуцирования клеток апикальных меристем дополнительно содержит 5 г на 1 л KNO₃ и 500 мг на 1 л гидролизата казеина, а также 0,5-1,0 БАП на 1 л среды в качестве цитокинина.

Указанная задача также решается тем, что бомбардирование клеток индуцированных апикальных меристем осуществляют частицами размером 0,7 - 2,5 мкм, при этом используют линии Agrobacterium, которые содержат вектор, несущий селективный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам - канамицину nptll или к гигромицину hph, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, а также маркерный ген uidA (GUS) или GFP и какой-либо чужеродный ген, выделенный из растения, бактерии или другого организма, полезный для производства подсолнечника или получаемого из него продукта, например ген Gly 1 - глиоксалазы 1, который повышает устойчивость трансгенных растений к стрессам (Veena et al, 1999, Plant J..17, 385- 396 □ □□□□□□□□□ □ □□□□□□□□□ NaCl.

Далее изобретение раскрывается более подробно со ссылками на чертежи.

На фиг. 1а и 1б показана иллюстрация индукции апексов в культивируемых сегментах гипокотиля и регенерации из них побегов; на фиг. 2а и 2б - экспрессия uidA (GUS) гена в тканях и семенах второго поколения трансгенного подсолнечника сорта Передовик улучшенный.

Далее в примерах раскрыт оптимальный вариант изобретения.

Пример 1. Получение асептических растений подсолнечника в культуре in vitro
Семена подсолнечника (Helianthus annuus L.)помещают в марлевые мешочки. В нестерильных условиях семена тщательно промывают мыльной водой. Все дальнейшие операции выполняют в условиях ламинарного бокса, обеспечивающего асептические условия. Семена помещают в 70%-ный этанол на 3 мин. Промывают стерильной водой 3-5 мин. После этого семена помещают на 30 мин в 30%-ный раствор NaOCl, который приготовляют разбавлением 30 мл коммерческого отбеливателя 70 мл стерильной дистиллированной воды, добавляя 3-4 капли Twen-80. Далее 3 раза по 5 мин семена промывают стерильной водой. Семена оставляют на 30 мин в стерильной воде. Очищают семена. Очищенные семена стерилизуют в 20%-ном растворе гипохлорита в течение 3-5 мин. Трижды промывают стерильной водой, время промывок 5, 5 и 10 мин. Высаживают простерилизованные семена в пробирки, содержащие 1/2 по концентрации солей среду MS, содержащую 10% сахарозы и 0.8% агар-агара, среда имеет pH 5.7 до автоклавирования. Выращивают при освещении люминесцентными лампами, фотопериод 16/8 час при 27^oC.

Пример 2. Изоляция сегментов гипокотиля для культивирование in vitro
После 5-7 дней выращивания проростки, достигшие 4-6 см, используют для получения сегментов гипокотиля. Проростки помещают в чашку Петри и скальпелем отсекают апекс побега с семядолями, нарезая низлежащую область гипокотиля на 2-3 мм сегменты, по 3-4 сегмента от каждого проростка, помещают в чашки Петри, содержащую среду SIM. В каждую чашку помещают по 30-40 сегментов. Чашки помещают под люминесцентные лампы, культивируют при 27^oC при фотопериоде 16/8 ч.

Пример 3. Индукции апикальных меристем.

Апикальные меристемы индуцировали из сегментов гипокотиля на среде SIM (Shoot Induction Media) следующего состава: макросоли, микросоли и витамины среды MS, 3% сахарозы, 0.7% агара, 500 мг/л гидролизата казеина, 6.95 г/л нитрата калия, 0.5-1.0 мг/л БАП (6фурфураминопурин). Перед автоклавированием доводили pH до 5.7 раствором NaOH. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при 1.11 атмосферы в течение 25 мин. После охлаждения среды добавляли витамины и гормоны, которые стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Среду разливали в чашки Петри диаметром 9 см по 25 мл в каждую. Затем в каждую чашку помещали по 36 сегментов гипокотиля и инкубировали при люминесцентном освещении, при фотопериоде 16/8 ч и температуре 26-28^oC в течение 1-3 дней.

В табл. 1 представлены данные частоты индукции апексов у различных генотипов подсолнечника, в зависимости от концентрации ВАП.

Пример 4. Бомбардирование индуцированных апексов вольфрамовыми частицами
После 2-4 дней культивирования сегментов гипокотиля, когда визуально можно определить появление развивающихся апексов, последние рассекают на две части и помещают в чашки Петри на агаризированную среду MS. Апексы подвергают двукратному бомбардированию частицами вольфрама размера 0.7-2.5 мкм, используя PIG (Finer et al 1992). Для разгона частиц используются давление 6 атмосфер, вакуум в камере 0.1-0.3 атм, расстояние от источника частиц до поверхности апексов 12 см. Частицы предварительно стерилизуют 5 мин в 96%-ном этиловом спирте, трижды промывают в стерильной воде и ресуспензируют (50 мг на 500 мкл в среде SIM, используемой для индукции апексов).

Пример 5. Сокультивирование эксплантов с Agrobacterium
Трансформацию осуществляли методом сокультивирования тканей апекса с ночной культурой штамма агробактерии ЕНА101, несущей вектор V035. Ночную культуру выращивали на среде LB с канамицином (50 мг/л) при 28^oC, осаждали на центрифуге при 5000 об/мин, дважды промывали, рессуспендировали в жидкой безгормональной среде до плотности OD660=0.8-1.0. На фиг. 3 представлена карта вектора V035.

Пример 6. Селекция на среде с гигромицином
Селекцию трансформантов осуществляли в течение 3-4 недель на среде, содержащей 15 мг/л гигромицина В, пересаживая ткани на свежую среду каждые 7-10 дней. После селекции тканей с развивающимися побегами, устойчивых к гигромицину, последние переносили на среду SIM для регенерации проростков.

Пример 7. Укоренение на среде для укоренения или методом прививки на побеги подсолнечника.

У побегов, достигших размера 2-3 см, индуцировали образования корней на среде для укоренения, в состав которой входят макро- и микросоли среды В5 (Gamborg et al., 1976), индолил масличная кислота (ИМК) в концентрации 2.0 мг/л, сахароза в концентрации 10 г/л. Культивируемые побеги в течение 1-2 недель подвергали холодному шоку, понижая температуру культивирования до 14^oC. Данные, полученные для сорта Передовик представлены в табл. 2.

Второй путь получения взрослых фертильных растений - это метод прививания 3-5 мм побегов на 7-дневные проростки подсолнечника в культуре in vitro. Частота выживания прививок достигает 80%.

Пример 8. Частота трансформации
Частота трансформации, полученная при использовании разработанного метода, вычислялась как отношение количества использованных эксплантов к количеству полученных трансгенных побегов, экспрессирующих маркерный ген и для которых показано встраивание гетерологинного гена в геном методами PCR и Southern блотинга. Данные ряда независимых опытов представлены в табл. 3.