БАКТЕРИЦИДНЫЙ РАСТВОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к получению дисперсий наноструктурных металлических частиц в воде, обладающих бактерицидными и микробиологическими свойствами и используемых в различных областях медицины, фармакологии, промышленности и экологии.

Известно, что частицы вещества в диапазоне нанометрового размера 1-100 нм меняют свои химические, физические и биологические свойства, параметры которых имеют важное прикладное значение.

В патенте RU 2259871 описан коллоидный раствор наночастиц металлов, который может быть использован при изготовлении противобактериальных и стерилизующих средств. Коллоидный раствор наночастиц металла получают растворением соли металла и водорастворимого полимера в воде и/или в неводном растворителе, затем реакционную емкость с полученным раствором продувают газообразным азотом или аргоном и облучают радиоактивным излучением. В этом способе восстановителем является сольватированный электрон, генерируемый ионизирующим излучением в растворе. В качестве соли металла можно использовать соль серебра, например нитрат, перхлорат, сульфат или ацетат. Можно также использовать соли металлов никеля, меди, палладия или платины. В качестве полимера берут поливинилпирролидон, сополимеры 1-винилпирролидона с акриловой или винилуксусной кислотами, со стиролом или с виниловым спиртом. В качестве неводного растворителя можно использовать метанол, этанол, изопропиловый спирт или этиленгликоль. В случае получения эмульсии дополнительно вводят в реакционную емкость поверхностно-активное вещество. Коллоидный раствор стабилен в течение 10 месяцев с сохранением формы частиц и незначительным увеличением их размера. Свежеприготовленный коллоидный раствор содержит наночастицы металла размером не более 8 нм. Вместе с тем известный способ является достаточно сложным и дорогостоящим, так как синтез, с целью предотвращения побочных реакций, проводится в атмосфере инертного газа и с использованием источника ионизирующего излучения.

Известно использование солей серебра в качестве антибактериального средства, эффективность которого увеличивают добавками аммиака. В патенте RU 2182129 для этого предварительно в отдельной емкости готовят 0,1-1,0%-ный раствор Ag₂SO₄ или AgNO₃, в который при перемешивании вводят газообразный аммиак или аммиачную воду до достижения массового соотношения Ag⁺:NH₃, равного 2,8-3,0, затем полученный раствор аммиачного комплексного соединения серебра при помощи дозатора вводят в обеззараженную предварительно хлором воду до достижения в ней концентрации серебра, равной 0,005-0,05 мг/л.

Сочетание хлорирования воды и ее обработки комплексными ионами серебра исключает необходимость повторного хлорирования, а значит количество используемого хлора уменьшается и, соответственно, повышается экологическая безопасность метода. Введение аммиака в растворы солей серебра повышает их растворимость за счет образования комплексных соединений Ag(NH₃)₂NO₃ или [Ag(NH₃)₂]₂SO₄. Предложенное массовое соотношение между ионами серебра и аммиаком превосходит приблизительно на 5% стехиометрическое и необходимо для получения максимально стабильного соединения. Указанный диапазон концентрации растворов солей серебра, используемых для приготовления комплексов, является оптимальным для хранения этих реагентов. Аммиачные комплексы серебра обладают высокой бактерицидной активностью при концентрации ионов Ag⁺ даже ниже, чем их ПДК в воде. Восстановление комплексов происходит медленнее, чем Ag⁺, следовательно максимальный бактерицидный эффект проявляется в течение большего промежутка времени - до трех месяцев. Сравнение бактерицидной активности раствора Ag₂SO₄ и раствора аммиачного комплекса [Ag(NH₃)₂]₂SO₄ показало, что снижение бактерицидной активности раствора Ag₂SO₄ происходит быстрее, чем раствора [Ag(NH₃)₂]₂SO₄, при этом последний даже через 50 суток теряет всего лишь треть своей активности, что свидетельствует о стабилизирующей роли аммиака. Кроме того, обнаружено, что растворимость соли серебра в аммиачной воде повышается по сравнению с чистой водой.

В патенте RU 2281107 описан бактерицидный раствор на основе ионизированного серебра, который получают с использованием серебряных электродов и водного раствора, содержащего аминокислоту, преимущественно глицин, и аммиак в соотношении компонентов, мас.%: 0,1-5,0 к 0,002-0,055, остальное - вода.

Присутствие аммиака увеличивает рН раствора и, как следствие, повышается бактерицидность композиции, благодаря получению высококонцентрированного раствора ионов серебра, который для получения значительного антибактериального эффекта может быть значительно разбавлен. Значение рН получаемого раствора находится в пределах от 7,9 до 9,2. При необходимости препарат нейтрализуют до рН 6,9-7,1 разбавленной кислотой, например 2%-ной уксусной кислотой.

Однако необходимо отметить, что в вышеприведенных технических решениях речь идет только об ионизированном серебре. В то же время хорошо известно (патенты RU 2130964, RU 2197270), что бактерицидная активность ионов серебра зависит от качественного состава обеззараживаемой воды и прежде всего от наличия в ней хлоридных и сульфатных анионов, а также органических веществ, связывающих катионы серебра в малоактивные нерастворимые соединения. Авторами там же отмечается зависимость в сторону снижения дезинфирующей активности ионных растворов серебра при понижении рН и температуры воды.

В последнее время внимание исследователей привлекают серебросодержащие ультрадисперсные и коллоидные системы, обеспечивающие высокую бактерицидную активность во времени [Благитко Е.М. и др. Серебро в медицине. Новосибирск: Наука-центр, 2004, 256 с.].

Известен способ получения наноструктурных металлических частиц путем восстановления ионов металла в водном растворе [Бутенко А.В. и др. Ц. Физ. Д. Атомы, молекулы и кластеры, 1990, т.17, с.283]. В известном способе в качестве восстановителя используют гидразин и водород.

Основным недостатком известного способа является малая стабильность получаемых с его помощью наночастиц, из-за чего необходимо использовать органические стабилизаторы, что усложняет структуру частиц, а также затрудняет их практическое применение. Кроме того, получение наноструктурных металлических частиц указанным способом необходимо производить в атмосфере инертного газа или при вакуумировании, что удорожает конечный продукт.

Известны лекарственные бактерицидные препараты на основе неионированного металлического серебра (колларгол, повиаргол) и оксида серебра (протаргол), получаемые химическим методом и стабилизированные гидролизатами казеина (колларгол), гидролизатами желатины (протаргол), поливинилпирролидоном (повиаргол), природным полисахаридом арабиногалактаном. Препараты хранятся в сухом порошкообразном состоянии и используются в виде коллоидных растворов, получаемых после их диспергирования в воде. Повиаргол [патент РФ №2088234. 1997. БИ №24] - водорастворимая бактерицидная композиция содержит в своем составе нанокластеры нуль-валентного металлического серебра с размерами 2-4 нм. Поли-N-винилпирроолидон-2 выступает в заявленном способе не только как стабилизатор коллоидного серебра, но и как реагент, участвующий в восстановлении за счет своих концевых альдегидных групп. При этом ионное серебро дополнительно восстанавливается до молекулярного действием этилового спирта на ионы серебра, координированные с поли-N-поливинилпирролидоном-2. В отсутствии последнего нитрат серебра не реагирует с этанолом. Препарат легко растворяется в воде с образованием коллоидного раствора, сохраняющего агрегативную устойчивость в течение 2 недель - 6 месяцев. Препарат разрешен к серийному производству и медицинскому применению в качестве бактерицидного средства. Однако способ получения этого средства трудоемок и требует больших энергозатрат, поскольку технология производства предусматривает распылительную сушку, имеет ограничение сырьевой базы, синтетический полимер увеличивает стоимость препарата, препарат быстро выводится почками (до 80% за 4 часа) из организма.

Известно изобретение [патент RU 2278669], которое состоит в том, что водные растворы солей серебра с содержанием от 0,0011 до 0,40 г (от 0,007 до 2 ммоль) добавляют к водному раствору арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляют при комнатной температуре в течение 30-90 мин. После этого приливают 30%-ный гидроксид аммония или натрия до рН 10-11. Полученные смеси выдерживают при температуре 20-90°С в течение 5-60 мин. Раствор фильтруют и целевые продукты выделяют высаживанием фильтрата в этанол, осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Содержание серебра в полученных образцах, определенное методом атомно-абсорбционного анализа, в зависимости от условий реакции варьируется в пределах 3,3-19,9%. По данным рентгено-дифракционного анализа серебро находится в нуль-валентном состоянии. Также как и в предыдущем изобретении особенностью данного является использование стабилизатора - природного полисахарида арабиногалактана, в качестве восстановителя ионов серебра до нуль-валентного состояния, а также одновременно в качестве реакционной дисперсионной среды.

Серебросодержащие производные сформированы в виде наноразмерных частиц 10-30 нм, частицы являются водорастворимыми, а также могут быть выделены в твердом виде, они агрегативно устойчивы и сохраняют свои свойства в течение 12 месяцев.

Недостатки этих препаратов связаны с трудоемкими процедурами их химического получения и сравнительно низкой стабильностью водных дисперсий.

Наиболее близким к заявляемому изобретению являются мицеллярные растворы металлических наночастиц, в данном случае - серебра, проявляющие бактерицидные свойства при внесении в различные жидкофазные материалы (Вестник МГУ, сер.2. Химия. 2001. Т.42. №5. с.332). Растворы наночастиц серебра получаются по способу, описанному этими же авторами в патенте РФ 2147487. Способ основан на восстановлении ионов металлов в системе обратных мицелл и включает приготовление обратномицеллярной дисперсии восстановителя на основе раствора поверхностно-активного вещества в неполярном растворителе. В качестве восстановителя применяется вещество из группы флавоноидов, в качестве ПАВ используют бис-2-этилгексил сульфосукцинат (АОТ) натрия, а в качестве неполярного растворителя применяют предельные углеводороды. В подготовленный мицеллярный раствор восстановителя (система кверцетин - АОТ - углеводород) вводят водный раствор соли металла - AgNO₃. Концентрация соли серебра составляла 3,0 мМ. Начало формирования наночастиц Ag обнаруживалось уже через 1-2 мин по появлению интенсивной окраски раствора. Исследование размеров и распределения образовавшихся частиц в мицеллярных растворах показало значительное преобладание (более 85%) малых однородных частиц серебра диаметром порядка не более 3 нм. Время жизни этих частиц составляло от нескольких месяцев до года.

Исследование вододисперсионной краски с полученными наночастицами серебра показало их антимикробную активность по отношению к различным видам бактерий (кишечной палочки, сальмонеллы, стафилококка и др.). Установлен выраженный биоцидный эффект в опытах на колифагах, моделирующих загрязнение поверхности наиболее распространенными вирусами (гриппа А и Б, гепатита А).

Технической задачей изобретения является создание высокоэффективного бактерицидного средства на основе высокодисперсных частиц серебра в водном растворе. При этом раствор имеет высокую биологическую активность по отношению к микроорганизмам и сохраняет ее в течение длительного времени.

Технической задачей изобретения является также создание простого способа получения дисперсии биохимически-восстановленных наночастиц серебра в воде, обладающей бактерицидными свойствами.

Техническим результатом изобретения является получение препарата в виде долгоживущей биологически активной стабильной системы из наночастиц серебра в водных растворах за счет подобранного диапазона их дисперсности.

Поставленная задача достигается обработкой солей серебра аммиачным раствором с последующим восстановлением комплексных ионов и получением в результате из мицеллярного раствора водно-дисперсионного раствора, включающего (мас.%) наночастицы серебра 0,01-0,11, поверхностно-активного вещества 1,5-5,0, вода - остальное и содержащего набор наночастиц серебра с распределением их по фракциям с определенными размерами следующим образом: частицы размером меньше 5 нм, с размерами 5-16 нм и размером выше 16 нм в отношении 0,5-1:25-30:1-5 соответственно.

В отличие от аналогов и прототипа микробиологическую активность в заявленном растворе проявляют не ионы серебра и не его однородные незаряженные частицы размера порядка 3-4 нм, а полидисперсная система, состоящая из набора частиц с распределением по размерам с его основной частью в диапазоне 5-16 нм.

В предложенном способе получения заявленного бактерицидного средства используют добавление раствора аммиака к растворам солей. Добавка аммиака в описанных ранее системах как технический прием известен и используется во многих вышеприведенных работах для увеличения бактерицидных свойств препаратов как за счет этих свойств самого аммиака или аммиачного раствора, так и его влияния на рН системы реагентов, растворимость солей и процессы комплексообразования ионов металлов в растворах. Однако в известном уровне техники не выявлены решения, использующие отличительный признак заявляемого способа, а именно протекание в образующихся под воздействием аммиака комплексных соединениях биохимического восстановления ионов металлов. Частичное или полное восстановление ионов серебра при взаимодействии с флавоноидами приводит к образованию дисперсий частиц, ответственных за проявление на уровне, по крайней мере, не меньшем чем у ионов металлов, микробиологической активности, с ее сохранением в течение длительного времени.

Сущность изобретения состоит в том, что химическому взаимодействию водного раствора соли серебра с обратномицеллярной дисперсией органического восстановителя на основе флавоноидов в растворе ПАВ с неполярным растворителем предшествует обработка раствора соли серебра аммиачным раствором NH₄ОН концентрации 10-20%. В результате происходящих в данной системе превращений получается неоднородная по размерам полидисперсия из наночастиц серебра в водно-органической среде. Полученная двухфазная система отстаивается с последующим расслаиванием и отделением от органического слоя целевого водного раствора наночастиц серебра.

Полученные растворы наночастиц серебра обладают повышенной по сравнению с растворами из наночастиц, полученных из необработанных аммиаком солей, бактерицидной, антимикробной и антивирусной активностью и подтверждена на широком классе микроорганизмов: микробах, вирусах, грибках. При этом биологическая активность препаратов сохранялась в течение длительного срока - не менее двух лет.

Одним из возможных объяснений полученного эффекта является «архитектура» получаемых кластеров в стадии перехода от однородных частиц сферической формы, описанных известной «теорией Ми», близких по размерам ионам металлов, в образовании сложной геометрической формы, состоящим помимо ионов одно- и двухвалетного серебра, также из его незаряженных частиц, их различных комплексов, к тому же стабилизированными молекулами ПАВ. Подобные наночастицы, составляющие кластерные фракции в воде, еще сравнительно небольших размеров (5-16 нм), могут легко взаимодействовать с микроорганизмами, являясь при этом стабильными источниками заряженных ионов, постоянно генерируемых в раствор. Вследствие сложной внешней формы, неровностей своей поверхности и однополярного заряда, они практически не слипаются, что влияет на их температурную устойчивость во времени и отсутствие значительной потери активности при длительном хранении.

Способ получения заявленного раствора наноструктурных металлических частиц включает следующие основные операции: приготовление раствора поверхностно-активного вещества (ПАВ) в неполярном растворителе; приготовление обратномицеллярной дисперсии флавоноида (восстановителя); приготовление водного раствора соли металла; обработка водного раствора соли металла раствором аммиака; смешивание двух: органического и водного раствора и получение дисперсии наноструктурных металлических частиц в системе обратных мицелл. Затем полученная двухфазная система либо отстаивается либо центрифугируется с последующим расслаиванием и отделением от органического слоя целевого водного раствора наночастиц серебра. В случае отстаивания в двухфазную систему добавляют при перемешивании дистиллированную воду в пропорции 1:0,8-2, полученную смесь переносят в разделительную колонну, процесс отстаивания проводят в течение от нескольких часов до 2-х суток до получения слоя водного раствора наночастиц серебра, который сливают из нижней части колонны.

В качестве растворителя используют различные предельные углеводороды (н-гексан, н-гептан, н-октан, н-декан, циклогексан, изооктан и др.).

Концентрацию соли металла в обратномицеллярной дисперсии варьируют в пределах от 0,05 до 0,5 моль в зависимости от поставленной прикладной задачи.

В качестве соли металла используют соли серебра, например нитрат, перхлорат, сульфат или ацетат. По предлагаемой технологии можно также использовать соли других металлов.

При концентрации соли металла, меньшей 0,05 М, не удается полностью осуществить реакцию восстановления, что снижает выход конечного продукта. Повышение концентрации сверх 0,5 М нецелесообразно, т.к. оно не сопровождается ростом выхода конечного продукта и приводит лишь к непроизводительным затратам солей металла.

Концентрация раствора NH₄OH в воде изменяется от 10 до 20%. При выходе за эти пределы: менее 5% - снижается биоактивность препарата, а более 20% - биоактивность, по крайней мере, не увеличивается.

Концентрация раствора ПАВ в предельном углеводороде варьируется в пределах 0.04-0.25 М. Выход за пределы указанного диапазона понижает стабильность получаемых наночастиц. При завышенных количествах ПАВ меняется механизм растворения исходных веществ. В качестве ПАВ используют Aerosol ОТ (АОТ), возможно также использование n-(трет-октил) фенилового эфира полиэтиленгликоля (Triton Х-100).

Соотношение молярных концентраций воды и ПАВ в обратномицеллярной дисперсии соли металла (степень гидратации, w=(H₂O)/ПАВ) выбирают из диапазона от 0.9 до 12.

Повышение степени гидратации более 12 приводит к нежелательному увеличению среднего размера получаемых наноструктурных частиц. Уменьшение степени гидратации менее 0,9 нецелесообразно вследствие замедления формирования наночастиц.

Молярную концентрацию вещества из группы флавоноидов - кверцетина, в обратномицеллярной дисперсии восстановителя выбирают из диапазона от 4,0×10^-5 до 22×10^-5 М. Уменьшение молярной концентрации кверцетина, менее 4,0×10^-5 М не позволяет получить заметную концентрацию наночастиц.

Верхний предел концентрации флавоноидов определяется возможностью солюбилизировать эти соединения в предельных углеводородах при максимально используемой концентрации ПАВ (0,25 М).

рН реакционной системы находится в пределах 8-12.

Разбавление двухфазной системы осуществляют дистиллированной водой в пропорции 1:0,8-2, где количество воды влияет на конечную концентрацию целевого раствора, определяемую прикладной задачей.

Общий состав раствора, в мас.%:

наночастиц серебра 0,01-0,11, поверхностно-активного вещества 1,5-5,0, вода - остальное.

При выходе за эти параметры происходит либо значительная биологическая дезактивация препарата для концентраций наночастиц серебра ниже 0,01 и ПАВ выше 5,0, либо он не образуется вообще (для концентрации ПАВ ниже 1,5). Концентрация наночастиц серебра выше 0,11 приводит к перерасходу металла, заметно не влияя на биоактивность раствора, а при длительном хранении к коагуляции частиц и их выпадению в осадок.

Контроль за формированием наночастиц и оценку их стабильности осуществляют спектрофотометрически по изменениям основных характеристик спектров оптического поглощения (положения максимума полосы поглощения, оптической плотности в максимуме и полуширины полосы).

Примеры опытной реализации изобретения:

Приготовление мицеллярного раствора наночастиц серебра.

1. Готовят раствор поверхностно-активного вещества: АОТ (диоктилсульфосукцинат натрия (бис(2-этилгексил) сульфосукцинат натрия) (CAS №577-11-7) чистота 96% фирмы Sigma-Aldrich (по каталогу 2005 г. № D201170) или Acros (№11710) в изооктане 0,06 моль/литр.

2. Добавляют восстановитель: кверцетин по каталогу (№174071000) фирмы Acros Organics (USA) из расчета 200-250 мг на 1 литр раствора АОТ в изооктане.

3. Готовят водный раствор 0,25 М AgNO₃ азотнокислое серебро марки ОСЧ ГОСТ 1277-75 на биводе (вода дистиллированная, двукратной перегонки ГОСТ 6709-72).

4. Берут AgNO₃ 0,25 М и добавляют 20% р-р аммиака марки ОСЧ.

5. Добавляют к р-ру (кверцетин/АОТ/изооктан), взятому в количестве 1 литр, 10 мл AgNO₃ 0,25 М (обработанных аммиаком).

Все действия необходимо проводить в банках темного стекла, плотно закрывая их крышкой с прокладкой при интенсивном встряхивании.

Жидкость окрашивается в темно-бурый свет в течение нескольких минут - начало процесса образования наночастиц серебра.

6. Добавляют в полученную двухфазную систему при перемешивании дистиллированную воду в пропорции 1:1.

7. Переносят приготовленную смесь в разделительную колонну и отстаивают в течение 20 часов до получения слоя водного раствора наночастиц серебра, который сливают из нижней части колонны.

Процесс получения готового раствора контролируют спектрофотометрически по изменению характерного пика серебра в области 440 нм.

Общий состав препарата по примеру 1: Ag/ПАВ/H₂O в (мас.%) 0,03/2,45/97,52 и в следовых количествах также присутствовали кверцетин и аммиак.

В примере 2 по сравнению с примером 1 концентрация соли серебра соответствовала 0,1 М; концентрация NH₄OH - 15%. Общий состав: Ag/ПАВ/Н₂О (мас.%) 0,02/2,45/97,53.

В примере 3 концентрация соли серебра - 0,1 М концентрация NH₄OH - 10%. Общий состав: Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,02/2,45/97,53.

В примере 4 концентрация соли серебра - 0,05 М, концентрация NH₄OH - 10%. Общий состав: Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,01/4,30/95,69.

В примере 5 концентрация соли серебра - 0,05 М, концентрация NH₄OH - 5%. Общий состав: Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,01/2,45/97,64.

В примере 6 концентрация соли серебра - 0,5 М, концентрация NH₄OH - 25%. Общий состав: Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,12/2,45/97,53.

В примере 7 неполярный растворитель - циклогексан, молярная концентрация восстановителя-кверцетина равнялась 4×10^-5, АОТ - 0,04 М, нитрата серебра 0,05 М, был взят 10% раствор аммиака. Общий состав Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,01/1,50/98,49.

В примере 8 неполярный растворитель - гексан, молярная концентрация восстановителя-кверцетина равнялась 22×10^-5, АОТ был взят из расчета 0,2-0,25 М, перхлората серебра - 0,5 М, обработка велась 20% раствором аммиака. Общий состав Ag/ПАВ/Н₂O (мас.%) 0,11/5,00/94,89.

По составу и спектральным характеристикам раствор соответствует показателям, приведенным в таблицах 1 и 2.

Распределение наночастиц серебра по размерам было получено при помощи программы анализа оптических изображений UTHSCSA Image Tool 3.00.

Предварительное редактирование микрофотографий было проведено с использованием программы Photoshop 6.

Для примера 1 по микрофотографии обработано 1395 объектов. Выборку следует считать представительной. Средняя удлиненность наночастиц (отношение большого размера частицы к малому) для основного диапазона частиц от 5 до 16 нм составляет величину 1,2-1,4, тогда как для частиц «закрылков»: (меньше 5 нм) эта величина 1,0-1,1; а для размера более 16 нм эта величина выше 1,7. На гистограммах распределение частиц по размерам носило выраженный гаусовский характер. Рассчитанное распределение частиц по примеру 1: частицы размером менее 5 нм, от 5 до 16 нм, более 16 нм соотносились как 1,0:30:2,0.

Рассчитанное по микрофотографиям и гистограммам распределение частиц по размерам: менее 5 нм/5 - 16 нм/более 16 нм составляло для примеров 2 - 8 соответственно соотношение, прим.2: 0,8:28:3,0; прим.3: 0,6:28:4,0; прим.4: 0,5:25:5,0; прим.5: 0,5:20:5,0; прим.6: 1,2:30:8,0; прим.7: 0,5:25:1,0; прим.8: 1:30:5,0 (Фиг.1).

Анализ полученных данных показал, что распределение наночастиц серебра в водном растворе общего состава, включающего (мас.%) наночастицы серебра 0,01-0,11, поверхностно-активное вещество 1,5-5,0, вода - остальное, осуществляется по размерам следующим образом: частицы размером меньше 5 нм, с размерами 5-16 нм и размером выше 16 нм в отношении: 0,5-1:25-30:1-5 соответственно.

Приведенные данные показывают, что при переходе с водно-органического раствора в чисто водный происходит «вымывание» ионов в воде. При этом часть больших по размерам частиц остается в органической фазе, все это приводит к концентрированию частиц средних размеров с небольшим сдвигом в сторону частиц большего размера.

Раствор может быть разведен до 100 раз. Предлагаемый раствор может быть использован в качестве биоцидного препарата при любой концентрации, подобранной для конкретной практической задачи.

Проведенные биологические испытания препарата проведено в двух вариантах:

а) наложением пропитанных раствором с наночастицами серебра дисков из фильтровальной бумаги на поверхность питательной среды, которую предварительно «засевали» взвесью микроорганизмов в концентрациях 10⁸, 10⁶, 10⁴ и 10² КОЕ/мл;

б) культивированием микроорганизмов, взятых в концентрации 10² и 10⁴ КОЕ/мл, в растворе наночастиц серебра в течение 24 часов.

При изучении антимикробных свойств использовали стандартные методики.

В работе использовали штаммы микроорганизмов из коллекции ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и Международной коллекции АТСС. Изучено антимикробное действие заявленного объекта на следующие микроорганизмы: Staphylococcus aureus (АТСС 6538), E.coli (АТСС 11229), Pseudomonas aeruginisae (АТСС 15442), Klebsiella pneumoniae, Candida albicans (АТСС 10231), Salmonella spp., Acinetobacter spp., Enterobacter spp. Американское общество инфекционных болезней (АОИБ) опубликовало список самых опасных инфекций (ttp://www.utro.ru/articles/2006/03/03/526896.shtmh), с которыми врачи постоянно сталкиваются в мировой практике, пять из них подвергалось воздействию заявляемого средства: в первую очередь, метициллин-резистентный золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), затем, бактерия Acinetobacter spp, также в список вошли кишечная палочка (Escherichia coli), клебсиела (Klebsiella) и синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa).

Для культивирования микроорганизмов были взяты питательные среды фирмы Becton, Dickinson and Company, USA и Hi Media (Индия): SS-agar и среда Эндо (для E.coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Enterobacter spp.), Staph-agar (для S.aureus), Saburo и Biggi-agar (для Candida albicans), 5% кровяной агар (для Acinetobacter spp,) и Cetrimide agar base (для Pseudomonas aeruginisae). Посевы культивировали при температуре 37°С и 25°С Candida albicans в течение 24 часов, затем подсчитывали количество выросших микроорганизмов. Полученные результаты для состава растворов по вышеприведенным примерам (прим.1 для E.coli и S.aureus, прим.2 для Klebsiella spp., Enterobacter spp., Acinetobacter spp. и Pseudomonas aeruginisae, прим.7 для Candida albicans и прим.8 для Salmonella spp.) приведены в таблицах 3 и 4.

Учет результатов производили по отсутствию роста тест-микроорганизмов (в мм от края диска, пропитанного в течение 20 минут раствором, содержащим наночастицы серебра), по Методическим Указаниям исследуемый препарат обладает бактерицидными свойствами, если зона отсутствия роста составляет 4 и более мм. Зона отсутствия роста от 1 до 3 мм означает бактериостатическое воздействие на тест-микроорганизмы.

Таким образом, заявленный раствор с наночастицами серебра обладает бактерицидным действием в отношении концентраций тест-микроорганизмов 10⁴ и 10² КОЕ; бактерицидным действием по отношению к энтеробактеру (концентрации с 10² до 10⁸); также бактерицидное действие выражено на все тест-микроорганизмы, кроме S.aureus, взятые в концентрации 10⁶ КОЕ. При использованной концентрации микробов 10⁸ бактерицидное действие оказано на Acinetobacter spp., Candida albicans, Pseudomonas aeruginisae. Бактериостатическое воздействие при дозе 10⁸ КОЕ оказано на E.coli, S.aureus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp.

Для более тщательного определения влияния раствора наносеребра на тест-микроорганизмы в дозах 10⁴ и 10² КОЕ применили культивирование данных микробов непосредственно в растворе наначастиц серебра, поскольку при низких концентрациях бактерий на плотных питательных средах зоны подавления роста выражены недостаточно четко (таблица 5).

Учет результатов проводился после 18-часового культивирования тест-микробов в растворе и дальнейшего высева из раствора на плотные питательные среды.

Условные обозначения: - (abs) - отсутствие роста; + наличие роста.

Таким образом, исследованный раствор проявил биологическое действие по отношению ко всем испытуемым тест-микроорганизмам, взятым в дозах 10⁶, 10², 10⁴, являясь универсальным препаратом биомедицинского назначения.

В таблице 6 приведена биологическая активность заявленного раствора (взят состав прим.2) для ряда микроорганизмов, которая в ряде случаев даже возрастает по сравнению с чисто ионными растворами серебра.

Наибольшую эффективность растворам придает обработка солей серебра в заявляемых условиях (взят состав прим.2) водным раствором аммиака при концентрации 10-20 мас.% (таблица 7).

Проведенные испытания вирулентности микроорганизмов в зависимости от соотношения размеров наночастиц в заявленном растворе (таблица 8) показали их наибольшую биоактивность в пределах следующих соотношений: размером менее 5 нм, размером от 5 до 16 нм и размером более 16 нм, как 0,5-1:25-30:1-5 в водно-дисперсионном состоянии.

Для таблиц 3, 4, 6, 7, 8 приведенные значения - зоны подавления роста микроорганизмов в мм.

При этом была исследована зависимость бактерицидной активности заявляемых растворов от времени их использования (срока хранения). Высокая биологическая активность по отношению к Pseudomonas aeruginisae, Acinetobacter spp. и Enterobacter spp. (для концентрации в КОЕ/мл·10⁶) сохранялась для растворов не менее двух лет и имела для составов по примерам 1-3, 7, 8 линейный характер. Причем для составов по прим. 1-3 по отношению к первоначальной активность изменилась через год всего на 5-6%, а через два года на 10-12%, для составов 7-8 биоактивность уменьшилась на 7-9% через год и до 12-15% через два года. Эти данные указывают на стабильность в бактерицидности заявляемых водно-дисперсионных растворов в течение длительного времени.