СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, к производству препаратов для иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата, описанный в статье Наумовой Ю.К. и др. “Дополнительное извлечение иммуноглобулина спирто-риванольным методом из осадков “Б” в условиях производства” (Сб. “Иммуноглобулины и другие препараты крови”, Л., 1976, с.15-21)

Недостатком способа является то, что полученный препарат содержит не менее 5% примесей белков неиммуноглобулиновой природы. Наличие в препарате остаточных количеств активированного угля, не удаляющихся при фильтрации, обуславливает формирование коллоидного осадка, отрицательно влияя на стабильность препарата при хранении.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата из осадка Б (III фракции Кона) - патент RU 2158137, опубл. 27.10.2000.

Способ предусматривает разведение осадка Б в 0,9% растворе хлорида натрия. Очистку экстракта осадка Б проводят добавлением хлороформа до 10% по объему с последующим отделением балластного осадка центрифугированием. Выделение иммуноглобулиновой фракции проводят и использованием этилового спирта при рН раствора 6,4-7,4 проточно-зональным центрифугированием. Полученный осадок целевого продукта разводят в 0,9% растворе хлорида натрия с добавлением 1,5-2,5 глюкозы и 2-3% глицина. Раствор целевого продукта фильтруют через пористый стеклянный фильтр, затем подвергают стерилизующей фильтрации.

Недостатком способа является то, что суммарное содержание иммуноглобулинов классов А и М в получаемых препаратах не превышает 30% от общего количества иммуноглобулинов. Однократное проведение спиртового осаждения не обеспечивает полного удаления примесей липопротеидов, ухудшающих качество препарата после лиофилизации. Наличие в готовом продукте хлорида натрия способствует денатурации белков в процессе лиофилизации, а присутствие глюкозы иногда вызывает карамелизацию готового продукта.

Наиболее близким техническим решением является способ получения иммуноглобулинового препарата путем разведения спиртового осадка сыворотки крови человека, очистки его от липопротеидов с использованием хлороформа, выделения целевого продукта спиртовым осаждением при центрифугировании, разведения осадка иммуноглобулинов в растворе, содержащем хлорид натрия, глюкозу и глицин, стерилизующей фильтрации и лиофилизации разведение спиртового осадка плазмы крови человека проводят с использованием раствора хлорида натрия и ионной силой 0,01-0,015, 10-20 объемов по отношению к весу осадка, выделяют осадок иммуноглобулинов добавлением этилового спирта до конечной концентрации 13-17% и центрифугированием, разводят в 10-15 раз с использованием 0,05-0,07 М буферного раствора с рН 3,8-3,9, добавляют к полученному раствору хлорид натрия до конечной концентрации 0,075-0,1 М и хлороформ до 13-15%, отделяют полученный осадок липопротеидов центрифугированием, проводя эту процедуру не менее двух раз, к полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия до рН 4,9-5,0 и этиловый спирт до конечной концентрации 4-6%, отделяют полученный балластный осадок центрифугированием, фильтруют центрифугат, осадок целевого продукта разводят в 2-3% растворе глицина, не содержащем хлорида натрия и глюкозы, устанавливают рН 4,0-4,5 (патент RU 2199343, опубл. 20.07.2001).

Недостатком данного способа является нестабильность препарата при хранении и наличие нежелательных примесей.

Задачей настоящего изобретения является совершенствование способа получения иммуноглобулинового препарата из плазмы крови с учетом устранения вышеназванных недостатков и повышения качества целевого продукта.

Указанный результат достигается тем, что из плазмы крови фракционированием выделяют фибрин, альбумин, β-глобулины и липиды путем неоднократной обработки 50% этиловым спиртом, а также хлоридом натрия и хлороформом, после отделения центрифугированием β-глобулинов и липидов, центрифугат, содержащий целевой продукт, фильтруют под давлением 0,2-0,3 ати (избыточное давление над атмосферным) и удельной пропускной способности не выше 80 л/м² час, охлаждают до 0-4°С, для осаждения иммуноглобулинов к фильтрату со скоростью 10-12 л/час добавляют 50% полиэтиленгликоль в 0,9% растворе натрия хлорида при температуре 0-4°С, далее смесь перемешивают не менее 2 часов, центрифугируют, осадок, содержащий иммуноглобулины, отделяют, растворяют в воде для инъекций при температуре 2-6°С в соотношении 1:4-5 в течение 1-1,5 часа, к полученному раствору добавляют глицин до конечной концентрации его в препарате 2,5 до 6%, доводят рН раствора до 4,0-5,5 и осуществляют стерилизующую фильтрацию.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут плазму, имеющую отрицательную реакцию на антитела ВИЧ, вирус гепатита С, возбудитель сифилиса и HBs-антиген. Данную плазму хранят в замороженном состоянии в холодильных камерах, холодильниках при температуре не выше -20°С вместе с каронтинизацией не более 6 месяцев. Накопленную плазму в полном объеме 200 л передают на фракционирование.

Размороженную плазму для удаления выпавшего фибрина предварительно профильтровывают в сборник через сито и двухслойный марлевый фильтр. Включают мешалку реактора и охлаждают плазму до температуры 0,5-0°С.

Приготовленный 50% этиловый спирт в объеме 35,4 (0,177 мл 50% спирта на 1 л плазмы) загружают под вакуумом в мерник. Спирт охлаждают до температуры (-15)-(-20)°С. Осаждение фракции производят путем медленного добавления охлажденного 50% спирта (от 12 до 20 л в час) к плазме при непрерывном перемешивании в реакторе. В процессе осаждения контролируют температуру смеси и по окончании осаждения смесь перемешивают в течение 1 часа при температуре (-2)-(-3)°С для формирования осадка. Центрифугируют и по окончании центрифугирования осадок извлекают из центрифуги. Выход осадка составляет из 200 л плазмы 1,7-2,0 кг. Из него могут быть получены фибринные пленки.

Центрифугирование смеси проводят неоднократно, подбирают скорость поступления смеси таким образом, чтобы получить прозрачный центрифугат при температуре от -5,0 до -7,0°С.

Выход осадка фракции из 200 л сырья составляет 10,0-12,0 кг. Осадок можно хранить при температуре не выше -20°С не более 30 дней. Центрифугат используют для получения 5, 10, 20% раствора альбумина.

Осадок фракции суспендируют при 0-4°С в гомогенизаторе в охлажденном 5% этиловом спирте и 0,15 М растворе хлорида натрия, который берут в соотношении 18,0 л на 1 кг осадка. Полученную суспензию передают в реактор, перемешивают и охлаждают до 0-+1°С. Далее 50% этиловый спирт загружают в реактор из расчета 0,744 кг на каждый литр суспензии. Спирт охлаждают до температуры (-15)-(-20)°С. Осаждение фракции проводят в реакторе путем медленного добавления охлажденного 50% спирта к суспензии при непрерывном помешивании. По окончании осаждения смесь перемешивают в течение 1 часа при температуре (-7)-(-8)°С. Осадок фракции отделяют центрифугированием, для чего смесь подают на центрифуги непосредственно из реактора под давлением от 0,1 до 0,2 атм.

Отмытый осадок фракции суспендируют при температуре (1-3)°С в гомогенизаторе в равном объеме 0,15 М растворе хлорида натрия. Включают мешалку и добавляют к полученной суспензии охлажденную до (0-1)°С воду для инъекций из расчета 6,75 л на 1 кг осадка фракции.

Осаждение фракции β-глобулинов и липоидов проводят путем медленного добавления охлажденного 50% раствора спирта к суспензии в реакторе. Смесь перемешивают 1 час и выдерживают не менее 12 часов при температуре (-3)-(-5)°С. Далее смесь центрифугируют. Осадок фракции извлекают из роторов. Выход осадка из 200 л плазмы составляет 4,0-6,0 кг.

4,0-6,0 кг осадка фракции суспендируют при температуре (0-+4)°С в гомогенизаторе в десятикратном (40,0-60,0 л) объеме воды для инъекций. В полученной суспензии определяют:

белок, рН суспензии, контроль за отсутствием поверхностного антигена вируса гепатита В, контроль за отсутствием поверхностного антитела к вирусам иммунодефицита человека.

Далее включают мешалку, подают рассол и полученную суспензию перемешивают в течение 1 часа при температуре (0-+4)°С. К суспензии добавляют при перемешивании охлажденный до (0-+4)°С хлороформ в количестве 10% по объему (6,6 л) хлороформа. Смесь перемешивают 2 часа при температуре (0-+4)°С.

Добавление раствора натрия хлорида к суспензии проводят в реакторе путем медленного прикапывания 1 л охлажденного раствора натрия хлорида из расчета 9 г на 1 л суспензии (до конечной концентрации 0,9%). Суспензию перемешивают в течение 30 минут при температуре (0-+4)°С.

Хлороформ, оседший на дно реактора, сливают через нижний вентиль в закрытую емкость. Смесь центрифугируют. Центрифугат собирают в сборник. Осадок отделяют. Выход осадка фракции из 200 л плазмы от 11,0 до 14,0 кг. Осадок обеззараживают и выбрасывают.

Центрифугат перемешивают и подают на фильтр под давлением 0,2-0,3 ати. Температура фильтрата должна быть (0-+4)°С. Чтобы фильтрация была эффективной, удельная пропускная способность не должна превышать 80 л/м² в час.

Осаждение иммуноглобулинов проводят путем медленного (10-12 л/час) добавления охлажденного 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) к фильтрату в реакторе, при этом температуру, находящуюся в реакторе, поддерживают (0-+4)°С. По окончании охлаждения смесь перемешивают при температуре (0-+2)°C не менее 2 часов.

Смесь центрифугируют. По окончании осадок иммуноглобулинов извлекают из ротора. Выход фракции из 200 л плазмы составляет от 0,5 до 0,6 кг.

Осадок фракции должен содержать не менее 97% иммуноглобулинов.

Хранить при температуре не выше -20°С и не более 30 суток от момента получения до начала сублимационной сушки.

К осадку иммуноглобулинов добавляют воду для инъекций из расчета на 1 кг осадка от 4,0 до 5,0 л воды с температурой от 2 до 6°С. Содержание белка после растворения должно быть от 5,5 до 6,5%.

Растворение осадка проводят в гомогенизаторе в течение 1-1,5 ч. К полученному раствору добавляют глицин из расчета 22,5 г на 1 л раствора (до конечной концентрации в готовом препарате от 2,5 до 6,0%).

В готовом препарате устанавливают рН от 4,0 до 5,5

Стерилизующую фильтрацию проводят при давлении не выше 0,04 МПа.

Готовый продукт обеспечивает качество, соответствующее требованию Фармакопейной статьи по наличию примесей. Полученный данным способ продукт стабилен при хранении и нетоксичен.