Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ STENOTROPHOMONAS SP. ВКМ В-2818D - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный), в диапазоне температур от +8 до +37±1°C.

Уровень техники.

Известен штамм Stenotrophomonas maltophilia В-7520 (1. Патент RU №2566554. Штамм Stenotrophomonas maltophilia В-7520, используемый для получения антигена для определения антител к Stenotrophomonas maltophilia в биологических средах. C1, C12R 1/01, C12N 1/20. Заявка: 2015100762/10, 12.01.2015. Опубликовано: 27.10.2015. Патентообладатели: ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии. Авторы: Голошва Е.В., Яговкин Э.А., Алешукина А.В., Вачаев Б.Ф., Юрьева И.Л.), обеспечивающий стабильно высокий рост при культивировании на твердых питательных средах при сохранении всех свойств, что позволяет использовать его для получения соматического антигена для определения антител к Stenotrophomonas maltophilia в биологических средах.

Недостатком известного штамма бактерий является не изученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известны штаммы: Serratia odorifera А 36 (2. Патент RU №2157839. Штамм бактерий Serratia odorifera А 36 ГКМ ВИЗР N 100 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, B09C 1/10 C12N 1/26, C12R1:425. Заявка: 99111625/13, 31.05.1999. Опубликовано: 20.10.2000. Патентообладатели: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К. Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И., Чумакова А.Я., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К.); Kurthia zopfii 7-204 (3. Патент RU №2270063. Штамм бактерий Kurthia zopfii, обладающий свойством утилизировать нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды. С2, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/01. Заявка: 2003106326/13, 07.03.2003. Опубликовано: 20.01.2005. Патентообладатель: ООО ПКФ "БИГОР". Авторы: Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Гайтан В.И., Лобов Ю.А., Стехновская Л.Д., Разживин А.В., Барбот B.C., Васильев В.Н.); Pseudomonas putida 36 (4. Авторское свидетельство СССР №1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известны штаммы: Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 (5. Патент RU 2482179. Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57. Заявка №2012114907/10 от 04.2012 г. Опубликовано 20.05.2013 г. Бюллетень №14. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (6. Патент РФ №2525930. Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017- деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2013113813/10, 27.03.2013. Дата подачи заявки: 27.03.2013. Опубликовано: 20.04.14 г. Бюл. №11. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Недостатком известных штаммов является то, что для наращивания биомассы клеток штаммов Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, не известна их способность утилизировать бензин и керосин авиационный.

В качестве прототипа служит штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (7. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), кроме того, не выявлена его способность утилизировать нефть и нефтепродукты в диапазоне температур от +8 до +37±1°C.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +8 до +37±1°C, которые могут быть использованы для очистки объектов окружающей среды, как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Поставленная задача решена тем, что получен новый бактериальный штамм бактерий Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в диапазоне температур от +8 до +37±1°C), в относительно короткие сроки (7-60 суток).

Заявляемый штамм бактерий Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D (авторский номер LER-10.2), выделен с площадки ДТ, АИ-92, загрязненной бензином, дизельным топливом и др. нефтепродуктами, расположенной на территории ОАО «ЯТЭК» №7, Окружное шоссе 4 км, 1а, г. Якутск, Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ B-2818D.

Полученный штамм Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул.

Кулътуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует мелкие округлой формы бежевые колонии, диаметром 1 мм.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза - 40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует бежевые мелкие колонии.

На агаризованной среде Мюнца (8. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, растет в виде сероватых мелких колоний диаметром 1 мм.

В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует равномерную муть.

Отношение к кислороду: аэробы.

Растет в диапазоне pH 5,5-8,5, при температуре от +10 до +37±1°C.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, не активный в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с В-галактозидазой - отрицательный.

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Stenotrophomonas.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°C.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D

Штамм бактерий Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D выделен методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА, из проб почвенных частиц, загрязненных нефтепродуктами.

Для этого, соблюдая правила асептики, 1 г отобранного материала, растирают в ступке и вносят в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, pH 7,2.

В качестве источника углерода и энергии используют нефть, которую вносят в среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводится в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C.

Рост бактерий наблюдают через 7 суток инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+8, +20, +30 и +37 (±1)°C).

Через 72 ч., при культивировании штамма при температурах от +8 до +37°C, на поверхности МПА наблюдали появление мелких бежевых колоний округлой формы диаметром 1 мм., которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpРНК и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.). идентифицированы, как штамм Stenotrophomonas sp.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°C.

Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°C, при 200 об/мин.

Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D

Клетки штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).

Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +8°C; +20°C; +30°C; +37±1°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (10. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D на 7-е сутки культивирования в условиях постоянной аэрации утилизирует от 13,37 до 17,46% - нефти и нефтепродуктов при температуре +8°C; от 45,60 до 48,78% - при температуре +20°C; от 58,58 до 59,68% - при температуре +30°C; от 69,21 до 69,80% - при температуре +37°C (таблица 2).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.

В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти (нефтепродукта) и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°C.

Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Stenotrophomonas sp. ВКМ B-2818D за 60 суток составила 67,92% для нефти и 68,0% для дизельного топлива.

Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась (таблица 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).