Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения средств, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур из сообщества микроорганизмов, выделенных из корней жень-шеня.
Известно сообщество микроорганизмов для получения биорегулятора роста растений, включающее грибы-эндофиты, выделенные из корней жень-шеня, облепихи (1-2). Недостатком известных сообществ является неопределенный состав микроорганизмов, входящих в сообщество.
Известно сообщество микроорганизмов для получения регулятора роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU У-411, Rhodotorula glutinis UHMU У-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp UHMU B-29 (3).
Известны способы получения регуляторов роста растений путем культивирования одного из вышеуказанных сообществ на питательной среде, содержащей источник углерода, минеральные соли, аминокислоты с последующим выделением из биомассы биологически активных веществ, стимулирующих рост растений (1-4).
Известными способами получали препараты Симбионт - 1(1), Симбионт-Универсал (3). Данные препараты представляют собой спиртовые экстракты из биомассы сообществ микроорганизмов. Целью изобретения является расширение источников сырья из новых сообществ микроорганизмов и повышение эффективности и стабильности препаратов.
Цель достигается тем, что из корней жень-шеня выделено новое сообщество микроорганизмов, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodotorula glutinis, и бактерий вида Enterobacter agglomerans и Azotobacter beijerinckii. Микроорганизмы в сообществе находятся в соотношении 90:2:1:1. Сообщество хранится в коллекции МГУ под номером 452.
Входящие в сообщество микроорганизмы имеют следующие характеристики.
Культурально-морфологические признаки бактерий Enterobacter agglomerans. При выращивании на МПА и БСА образуют колонии белого цвета, слизистые, гладкие до 3-4 мм в диаметре. На среде Сабуро с высоким содержанием глюкозы образует экзополисахариды. Культура на жидкой среде представляет собой одиночные подвижные палочки иногда в парах. Клетки, растущие на твердой среде, через сутки образуют короткие цепочки, пары или представлены одиночными формами разной длины. Размеры палочек 1,2-3 мкм, в диаметре ~1 мкм. Эндоспор не образуют. Культура относится к группе "Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки". Оптимальная температура роста 25-30oC, наблюдается рост как при 37oC, так и при 15oC. Желатину разжижает, казеин гидролизует, крахмал не гидролизует, пигментов не образует. Использует в качестве источника азота соли аммония, органические соединения и нитрат. Восстанавливает нитрат в нитрит. Хорошо растет на цитрате, уреазу не синтезирует (рост на среде с мочевиной отсутствует). Сероводород из цистина и индол из триптофана не образует. Хорошо растет на среде Эшби и жидкой безазотистой среде Федорова. Культура обладает способностью к азотофиксации. Использует следующие углеводы с образованием кислоты: глюкозу, глицерин, Д-маннозу, Д-ксилозу, мальтозу, мелибиозу, рафинозу, арабинозу, L-рамнозу, Д-сорбит и сахарозу. Из многих указанных углеводов образует газ. Идентификация вида бактерий проведена на основании определителя Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (in four volumes), 1984, Baltimore /London.
Культурально - морфологическая характеристика дрожжей Rhodotorula glutinis.
При выращивании дрожжей на твердой агаризованной среде, содержащей 10o Б сусло, и глюкозо-пептонной среде с добавлением дрожжевого экстракта образуются мелкие колонии розового цвета диаметром 2-3 мм. Колонии округлые, края розовые, центр колонии приподнят, поверхность матовая, с возрастом заметны кольцевые бороздки. Штрих ярко-розового цвета, гладкий, блестящий. Псевдомицелия культура не образует. Клетки овальные или продолговатой формы, размером 1,5·2,0-3,0 мкм. Размножаются дрожжи почкованием. Спор не образуют. В качестве источника азота для роста использует как органические, так и неорганические формы азота. В качестве единственного источника углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, рафинозу, маннит, этанол и сукцинат. Не ассимилирует лактозу, мелибиозу, инулин, растворимый крахмал, рамнозу, цитрат, метанол. Слабый рост наблюдается на арабинозе, ксилозе, глицерине, лактате. В витаминах не нуждается. Температурный диапазон роста 10-40oC. Оптимум 15 - 28oC.
Идентификацию культуры дрожжей осуществляли на основании определителя под редакцией Бабьева И.П, Голубев В.И. "Методы выделения и идентификации дрожжей", М.: Пищевая промышленность, 1979 г. The Yeasts/ A taxonomic stady/ Sec cd/ by у Lodder, Amsterdam-London, 1970.
Культурально-морфологические признаки микромицета Acremonium sp. При выращивании микромицета Acremonium sp на агаризованной среде Чапека образуются колонии белого цвета, через несколько дней колонии приобретают кремовую окраску, а в старых культурах темно-коричневую, вплоть до черной. Мицелий обильный ватообразный. Плохо снимается с агара. С возрастом обратная сторона колонии становится коричневой. А в старых культурах черной. На воздушном мицелии образуются конидиеносцы одиночные, иногда в мутовках. Конидии образуются на вершине конидиеносца, одиночные и/или в ложных головках. Конидии бесцветные, в основном цилиндрические с закругленными концами. Длина конидии достигает 17 мкм, толщина 5 мкм. Встречаются конидиеспоры с перегородкой. Наряду с крупными цилиндрическими конидиями встречаются мелкие от овальных до шаровидных. На жидкой среде мицелий гриба представлен септированными гифами с множеством тяжей, окруженных толстым слизистым чехлом, инкрустированным бактериальными клетками. Рост в жидкой культуре сопровождается образованием хламидоспор. Оптимальная температура роста 20oC. Чистая культура микромицета поддерживается и хранится на агаризованной среде Чапека и на сусло-агаре. Микромицет хранится в коллекции микроорганизмов МГУ под N 441.
Идентификацию микромицета осуществляли на основании нижеприведенных источников: Литвинов М.А. "Определитель микроскопических почвенных грибов", Л. : Наука, 1967 г. Пидопличко Н.М. "Грибы-паразиты культурных растений", Киев, "Наукова Думка", 1977 г., том 2, Gilmal J.C. "A manial of soil fungi" Second ed. The Iowa State Univ. Press. Ames. Lowa, USA, 1984.
Культурально-морфологические и физиолого-бихимические признаки Azotobacter beijerinckii.
При культивировании бактерий Azotobacter beijerinckii на мясо-пептонном агаре (МПА) образует плотные белые и гладкие, слегка выпуклые колонии, при старении приобретающие бежеватый оттенок. Колонии диаметром 1-2 мм, с возрастом приобретающие волнистый край. Колонии мягкие и легко снимаются с агара. Клетки не менее 1,5 мкм в диаметре, кокковидные, располагаются парами, образуя как бы восьмерки. Клетки суточной культуры как на твердой, так и на жидкой средах неподвижные. При негативном окрашивании тушью хорошо видна слизистая капсула, окружающая клетки. При старении культура образует цисты. Культура грамотрицательная, каталазо- и оксидазоположительная, аэробная, способна расти при пониженном содержании кислорода в среде. Хорошо растет на среде Эшби. Культура образует много слизи. Фиксирует молекулярный азот в кислой среде при pH 5,5 - 6,0. Хорошо растет при 20-30oC, при 37oC роста нет. Использует нитрат и восстанавливает его до нитрита, сереводород из цистеина не образует. Желатину не разжижает. Крахмал и казеин не гидролизует. В качестве единственного источника углерода ассимилирует фруктозу, глюкозу, сахарозу, этанол, молочную и пропионовую кислоты. Рамнозу не использует.
Идентификацию данного вида бактерий осуществляли по Bergey's "Manual of systematic Bacteriology", 1984.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами:
Пример 1: получение регулятора роста растений "Симбионта".
Микробное сообщество, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodorula glutinis, бактерии Azotobacter beijerinckii и Enterobacter agglomerans, KM МГУ 452, засевают в среду, содержащую (%):
Глюкоза - 0,8
K2HPO4 - 0,03
MgSO4 - 0,02
K2SO4 - 0,01
FeSO4 и MnSO4 - Следы
Аспарагин - 0,001
Вода дистиллированная - До 1 л
Культивируют в стационарных условиях при исходном pH 6,5 и температуре 20oC в течение месяца. По окончании процесса культивирования биомассу отделяют. Из биомассы экстрагируют биологически активные вещества спиртом, выдерживают, удаляют образовавшийся осадок и получают препарат "Симбионта", представляющий собой водно-спиртовой бесцветный, прозрачный или слегка опалесцирующий со специфическим запахом раствор продуктов жизнедеятельности вышеуказанного сообщества микроорганизмов. Препарат содержит гиббериллины не менее 0,05 мг/мл, пуриновые основания не менее 0,02 мг/мл и аминокислоты не менее 1 мг/мл, содержание тяжелых металлов не превышает 0,001%, мышьяк и ртуть отсутствуют, pH 5,4-5,8.
Содержание этилового спирта 48-54%.
Сухой остаток не менее 0,25%.
Из аминокислот регулятор содержит глутамин, глицин, аланин, валин, гистидин, цитизин, гуанин.
Полученный препарат стимулирует развитие микоризы, что ведет к улучшению питания растений. Полученные микоризные грибы опережают в своем развитии патогенные, занимающие одну и ту же экологическую нишу, способствующие снижению степени поражения грибными фитопатогенами.
В основе защищает растение в период вегетации. Скорость воздействия через 8-10 дней после вегетации.
Регулятор совместим со всеми средствами защиты растений: протравителями, инсектицидами, фунгицидами, гербицидами и регуляторами роста растений. Препарат был испытан на различных растениях.
Исследования, проведенные при выращивании капусты сорта Слава, показали, что замачивание семян в растворе "Симбионта" с нормой расхода препарата 2 мл/1 кг в течение 30 минут и последующее опрыскивание растений через 3 недели после высадки рассады в грунт при норме расхода препарата 1 мл/га обеспечили достоверную прибавку урожайности капусты на 11-30%. Применение препарата способствовало повышению энергии прорастания семян, их всхожести и улучшению качества рассады. Пораженность рассады капусты "черной ножкой" снизилась на 15%, листьев капусты различными бактериозами на 15-20%, перноспорозом на 5-12%.
Проведены исследования биологической эффективности "Симбионта" на огурце (сорт Неженский). Наиболее эффективным оказалось замачивание семян в регуляторе роста растений с нормой расхода препарата 1 мл/кг, нормой расхода рабочего раствора 2 л/кг, время замачивания 30 минут, 2-х кратное опрыскивание: 1-е в фазу образования 1-2 листьев, 2-е в фазу образования 4-5 листьев. Норма расхода препарата 1 мл/га, норма расхода рабочего раствора 300 л/га. Прибавка урожайности огурца составила 16,7% или 1,53 кг/м2. В полевых испытаниях урожайность огурца возросла на 33%.
В результате 2-х летних испытаний регулятора роста растений на перце сорта Бодрость определены наиболее эффективные регламенты применения регулятора роста: замачивание семян на 30 мин, расход препарата 2 мл/кг, расход рабочего раствора 2 л/кг и опрыскивание в фазу цветения 1 мл/га, при норме расхода рабочего раствора 300 л/га. Исследования показали, что использование "Симбионта" способствовало получению прибавки урожая перца - 31%, увеличилось количество плодов перца на растении, масса 1 плода.
Испытания, проведенные на баклажане сорта Универсал 3, показали, что наиболее эффективным приемом обработки баклажана является замачивание семян в течение 30 минут в растворе "Симбионта" и опрыскивание растений в фазе цветения при вышеприведенных нормах расхода. Урожайность баклажан возросла на 13,8-16,8% и составила 1,13 - 1,12 кг/м2. Получена более развитая и здоровая рассада баклажана, увеличились масса 1 плода и количество в среднем на 1 растение.
Препарат повышает урожайность гречихи на 9-11%, при этом повысилась всхожесть и энергия прорастания семян, масса зерна в среднем с 1-го растения. Урожайность гречихи увеличилась на 9-11%. Препарат также повышает урожайность сахарной свеклы на 10-20%, сахаристость корнеплодов на 0,5-0,8%. Препарат испытан при выращивании астр. Применение регулятора обеспечило повышение высоты растения астры, увеличение количества соцветий и их диаметра, % распустившихся цветков, снижение пораженности рассады астры "черной ножкой".
Обработка семян арбуза сорта Огонек и Херсонский ранний регулятором роста в дозе 4 мл/кг, при расходе рабочего раствора 2 л/кг, способствовала повышению урожайности арбуза на 36-40%, прибавка урожайности составила 42-80 ц/га, при урожайности на контроле 105-220 ц/га, соответственно.
Из приведенных данных следует, что полученный препарат способствует повышению урожайности сельскохозяйственных культур и устойчивости растений к возбудителям заболеваний.
Источники информации:
1. Авторское свидетельство N 370932, 22.11.73, A 01 N 65/00.
2. Авторское свидетельство N 921488, 23.04.82, A 01 N 65/00.
3. Патент N 2100932, 10.01.98, A 01 N 63/00.
4. Авторское свидетельство N 1824148, 30.06.93, A 01 N 65/00.3
1.Сообществомикроорганизмов,состоящееизмикромицетаAcremoniumsp,дрожжейRhodotortulaglutinis,бактерийEnterobacteragglomeransиAzotobacterbeijerinckiiКММГУ452дляполучениярегулятораростарастений.12.Способполучениярегулятораростарастений,предусматривающийкультивированиесообществамикроорганизмовспоследующимэкстрагированиембиологическиактивныхвеществспиртомизполученнойбиомассы,отличающийсятем,чтоизсообществамикроорганизмовиспользуютсообществопоп.1.23.Регуляторростарастений,содержащийспиртовойэкстрактбиомассысообществамикроорганизмов,отличающийсятем,чтоонсодержитспиртовойэкстрактизбиомассысообществамикроорганизмовпоп.1.34.Регуляторростарастенийпоп.3,отличающийсятем,чтоонсодержитгиббериллинынеменее0,05мг/мл,пуриновыеоснованиянеменее0,02мг/мл,аминокислотынеменее1мг/мл,спирт48-54%,сухойостатокмикроэлементовнеменее0,25%,приэтоммышьякиртутьотсутствуют.4