БИОАНАЛИЗ И ПЕПТИДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В НЕМ

2420-152611RU/071

БИОАНАЛИЗ И ПЕПТИДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В НЕМ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к пептидам, используемым в анализе определения Mycobacterium tuberculosis, а также к самому анализу.

Уровень техники

Туберкулез представляет собой инфекцию, вызываемую бактерией Mycobacterium tuberculosis. Туберкулез представляет глобальную проблему во многих странах, особенно в развивающемся мире, и во многих развивающихся странах заболеваемость туберкулезом увеличивается. Несмотря на то, что туберкулез чаще представляет собой легочную инфекцию, он также может воздействовать на другие части тела, такие как лимфатические узлы, кожа и кости.

Диагностика туберкулеза, а также предоставляемое лечение, является основным средством против распространения заболевания. Диагноз может быть поставлен на основании сочетания клинических признаков, культурального исследования мокроты, рентгенограммы грудной клетки, гистологии ткани и жидкости бронхиального лаважа, и используя туберкулиновую кожную пробу (также известную как стандарт очищенного деривата белка или кожная проба PPD), такую как проба Манту и проба Гиффа. Пробы основаны на иммунной реакции на белок M.tuberculosis, показывающей наличие в крови пациента антител против M.tuberculosis.

Для проведения проб необходимо провести у пациента иммунологическую провокацию и затем оценить для определения результата теста. Эти этапы делают пробу трудоемкой для применения в скрининге населения.

В настоящем изобретении были сделаны попытки разрешить некоторые из этих проблем.

Сущность изобретения

В первом общем аспекте изобретение относится к пептиду, состоящему менее чем из 18 аминокислот, содержащему последовательность NSPAX, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10), где пептид способен связываться с антителом, направленным против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11). В наиболее предпочтительных вариантах осуществления пептид связывается с таким антителом.

Практически такое антитело могло бы быть направлено против указанного пептида (SEQ ID NO: 11), дополненного дополнительной С-аминокислотой на С-терминальном конце, т.е. направленным против GRDIKVQFQSGGNNSPAVC.

Во втором аспекте таким образом пептид содержит до 6 дополнительных аминокислот на С и/или N-терминальном конце последовательности NSPAX.

Предпочтительно, следовательно, пептид по первому или второму аспекту содержит последовательность NSPAX, а более предпочтительно пептид содержит последовательность NNSPAV (SEQ ID NO: 14).

В дополнительном предпочтительном аспекте пептид содержит последовательность SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).

В любом аспекте изобретения предпочтительно, чтобы пептид отличался от GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).

Также в любом аспекте изобретения предпочтительно, чтобы пептид состоял из последовательности SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).

Также в любом пептиде по изобретению предпочтительно, чтобы Х представлял собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17) или аланин (SEQ ID NO: 15). Особенно предпочтительны пептиды, в которых Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18) или аланин (SEQ ID NO: 15). Обнаружено, что именно такие замены обладают лучшей стабильностью Leu к нагреванию, что делает их подходящими для использования в странах с жарким климатом.

Наиболее предпочтительные пептиды по любому аспекту изобретения дополнительно содержат метку. Использование меченого пептида облегчает его использование в анализе определения Mycobacterium tuberculosis. К подходящим меткам относятся радиоактивные метки (например, путем введения радиоактивного изотопа или замены одного или нескольких атомов пептида их радиоактивным эквивалентом), что позволяет без труда определить наличие или концентрацию пептида или комплекса, содержащего пептид, например, с помощью сцинтилляционного счетчика или тому подобного. Также можно было использовать другие метки, такие как опосредованная ферментом хромогенная метка. Особенно предпочтительными метками являются флуоресцентные метки, включающие связывание пептида с флуоресцентным белком. Особенно подходящей, тем не менее, является флуоресцентная метка, такая как Alexa Fluor (например, Alexa Fluor 633).

Предпочтительно также, чтобы любой из вышеуказанных пептидов находился в выделенной форме, т.е., по существу, свободной от белков первичного источника (например, бактериальных, грибковых или белков млекопитающих).

Описанные выше пептиды применяют в анализах определения Mycobacterium tuberculosis.

Изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из вышеуказанных пептидов. Такая последовательность применяется в биосинтезе пептидов по настоящему изобретению.

Изобретение относится к антителу, направленному против SEQ ID NO: 11. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными, или могут быть рекомбинантными антителами, такими как химерные антитела, в которых константные области легкой и тяжелой цепей мышей заменяют последовательностями человека, или CDR-привитые антитела, в которых присутствуют только комплементарные определяющие области, например, мышей. Антитела по изобретению также могут быть антителами человека, полученными, например, иммунизацией трансгенных животных, способных продуцировать антитела человека (смотри, например, заявку РСТ № WO 93/12227).

Также изобретение относится к заместительной ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащий пептид по любому предшествующему пункту. Подходящий порядок выполнения такого анализа будет описан ниже. Предпочтительно чтобы такой заместительный анализ дополнительно включал антитело, направленное против SEQ ID NO: 11, или фрагмент такого антитела, имеющий сродство в отношении SEQ ID NO: 11.

Также изобретение относится к анализу ELISA для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащему антитело, направленное против SEQ ID NO: 11, или фрагмент такого антитела, имеющий сродство в отношении SEQ ID NO: 11.

Дополнительно изобретение относится к заместительному анализу для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащему пептид по изобретению, и пептид, соответствующий SEQ ID NO: 11.

Разработка теста и описание предпочтительных вариантов осуществления

Тест основан на идентифицированном Т-клеточном эпитопе Ag85B M. tuberculosis [Mustafa, A.S. et al, "Identification and HL Restriction of Nuturally Derived Thl-Cell Epitopes from the Secreted 1-Cell Epitopes from the Secreted Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Recognised by Antigen-Specific Human CD4⁺ T-Cell Lines", Infection and Immunity, 68(7), 3933-3940, 2000], представленном 18-мерным пептидом р3 (аминокислоты с 19 по 36, обозначаемые Р779) с последовательностью GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).

В одном из аспектов изобретение относится к обеспечению конкурентного заместительного ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) - эффективного лиганд-замещающего анализа. Антитела против M. tuberculosis, в частности, направленные к эпитопу Ag85B, связываются с тестируемой плашкой. Пептиды способны связываться с антителами, но связываются с антителами, предпочтительно меченными, например, флуоресцентным маркером, с более низким сродством по сравнению с антигеном M. tuberculosis. Если образцы, содержащие антигены M. tuberculosis (например, сам организм), приводят в контакт с комплексом антитело-пептид, то антигены замещают пептиды, что может быть определено по изменению флуоресценции. В другом аспекте изобретения подходящие синтетические пептиды получают, как описано ниже:

Для идентификации антигена-мишени с целью создания библиотеки аналогов были синтезированы 10 9-мерных перекрывающихся пептидов, картирующих 18-мерный р3 (т.е. 1-9аа, 2-10аа, 3-11аа и т.д. последовательности SEQ ID NO: 11).

Ниже представлены последовательности 10 9-мерных пептидов, используя стандартный 1 буквенный аминокислотный код:

SEQ ID NO: 1: GRDIKVQFQ (1-9аа), обозначаемая Р782-1

SEQ ID NO: 2: RDIKVQFQS (2-10aa), обозначаемая P782-2

SEQ ID NO: 3: DIKVQFQSG (3-11aa), обозначаемая P782-3

SEQ ID NO: 4: IKVQFQSGG (4-12aa), обозначаемая P782-4

SEQ ID NO: 5: KVQFQSGGN (5-13aa), обозначаемая P782-5

SEQ ID NO: 6: VQFQSGGNN (6-14aa), обозначаемая P782-6

SEQ ID NO: 7: QFQSGGNNS (7-15aa), обозначаемая P782-7

SEQ ID NO: 8: FQSGGNNSP (8-16aa), обозначаемая P782-8

SEQ ID NO: 9: QSGGNNSPA (9-17aa), обозначаемая P782-9

SEQ ID NO: 10: SGGNNSPAV (10-18aa), обозначаемая P782-10.

Эти пептиды наряду с 18-мерным р3 (SEQ ID NO: 11) были скринированы против антисыворотки (кролика) в отношении 18-мерного р3 (SEQ ID NO: 11). При скрининге использовали методику конкурентного ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ), которую использовали для оценки относительного сродства связывания 9-мерных пептидов с 18-мерным пептидом.

Коротко, анализ включал связывание (покрытие) 18-мерного р3 (Р779, SEQ ID NO: 11) с планшетами для проведения ELISA, с последующей инкубацией с различными количествами конкурентного лиганда (9-меры, SEQ ID NO: 1-10) в присутствии антисыворотки (разведение 1:250). Уровень связывания антисыворотки с 18-мерным р3 (Р779, SEQ ID NO: 11) определяли обработкой антикроличьим антителом козы, конъюгированным с пероксидазой, с последующим добавлением хромогенного субстрата ABTS (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонат]) и перекиси водорода, где после появления зеленой окраски ее измеряли с помощью счетчика плашек как оптическую плотность (поглощения). Развитие окрашивания пропорционально уровню связывания исходной антисыворотки с плашкой.

Для определения концентраций покрывающего пептида и конкурентных пептидов, использующихся для проведения экспериментов ELISA, осуществляли тест ELISA, содержащий конкуретный ELISA 9-мерного Р782-1 (GRDIKVQFQ) - SEQ ID NO: 1 - против 18-мерного Р779 (GRDIKVQFQSGGNNSPAV) - SEQ ID NO: 11 (Mustafa, A.S. et al, указано выше). Этот 9-мер выбирали так, чтобы он также перекрывался 18-мерным р2 (YLQVPSPSMGRDIKVQFQ) - SEQ ID NO: 12. На основании этих результатов авторы показали, что концентрации использованных пептидов подходили для проведения исследований с использованием ELISA. Плашки для проведения ELISA покрывали 2 мкМ раствором 18-мерного р3 (Р779) - SEQ ID NO: 11 и использовали 500 мкМ растворы конкурентных пептидов, которые затем подвергали четырехкратному серийному разведению. Результаты теста ELISA представлены на фиг.1.

Затем для определения относительного сродства связывания между десятью 9-мерами (с Р782-1 по Р782-10) - SEQ ID NO: с 1 по 10 - против 18-мерного р3 (Р779) - SEQ ID NO: 11 осуществляли картирование эпитопа посредством ELISA. Для получения количественной оценки относительного сродства связывания конкурирующих эпитопов важен выбранный диапазон концентрации пептида (линейная часть конкурентного графика). Результаты показали, что в этом диапазоне концентрации у 9-меров с Р782-1 по Р782-9 (т.е. SEQ ID NO: с 1 по 9) не наблюдалось связывания с антисывороткой в каком-либо значительном количестве; тем не менее, 9-мер Р782-10 (SGGNNSPAV) - SEQ ID NO: 10 - связывался с антисывороткой так же сильно, как и 18-мерный пептид р3 (SEQ ID NO: 11). Этот результат крайне важен и он привел авторов к мысли о возможной важности С-терминального остатка валина, поскольку у предшествующего 9-мера Р782-9 (QSGGNNSPA), SEQ ID NO: 9 не наблюдалось значительного связывания даже несмотря на то, что он перекрывает пептид Р782-10, SEQ ID NO: 10, 8 остатками. Результаты картирования этого эпитопа с помощью анализа ELISA представлены на фиг.2(а) и 2(b). Затем для проверки важности С-концевого региона эпитопа для связывания с антисывороткой наметили использовать анализ ELISA эпитопа-мишени. Были синтезированы два 6-мера, Р782-11 (GNNSPA) - SEQ ID NO: 13 - и P782-12 (NNSPAV) - SEQ ID NO: 14, которые являются усеченными формами соответствующих им 9-меров, и их подвергли конкурентному анализу ELISA в соответствии с вышеуказанным, и также повторно протестировали 9-мер Р782-10 (SEQ ID NO: 10), идентифицированный при картировании эпитопа посредством анализа ELISA как значимый эпитоп. Результаты ELISA эпитопа-мишени показаны на фиг.3. Данные ясно показывают воспроизводимые результаты и вновь указывают на то, что:

9-мер Р782-10 (SEQ ID NO: 10) связывается с антисывороткой так же прочно, как и р3 18-мерный пептид Р779 (SEQ ID NO: 11)

6-мерный Р782-11 (SEQ ID NO: 13) не связывается с антисывороткой и:

6-мерный Р782-12 (NNSPAV) (SEQ ID NO: 14) связывается с антисывороткой в 2 раза (1,99) слабее по сравнению либо с 9-мерным Р782-10 (SEQ ID NO: 10), либо с 18-мерным Р779 (SEQ ID NO: 11).

Этот результат указывает на важность С-концевого региона, который содержит остаток валина. На основании этого эксперимента было бы неразумно модифицировать N-концевой регион, чтобы вместо этого не нацеливать С-концевой остаток валина с целью создания некоторого различия сродства связывания. Поэтому авторы решили сосредоточить внимание на библиотеке, основанной на 9-мерном Р782-10 (SGGNNSPAV), SEQ ID NO: 10, и модифицировать С-концевой регион, и синтезировали пептиды с последовательностью SGGNNSPA-Х, где Х представляет собой вариабельную аминокислоту, включающую другие гидрофобные и имеющие заряд аминокислоты.

Для создания библиотеки ELISA авторы синтезировали следующие пептиды:

SEQ ID NO 15: SGGNNSPAA, обозначаемая P783-1

SEQ ID NO 16: SGGNNSPAF, обозначаемая P783-2

SEQ ID NO 17: SGGNNSPAL, обозначаемая P783-3

SEQ ID NO 18: SGGNNSPAM, обозначаемая P783-4

SEQ ID NO 19: SGGNNSPAY, обозначаемая P783-5

SEQ ID NO 20: SGGNNSPAG, обозначаемая P783-6

SEQ ID NO 21: SGGNNSPAS, обозначаемая P783-7

SEQ ID NO 22: SGGNNSPAP, обозначаемая P783-8

SEQ ID NO 23: SGGNNSPAN, обозначаемая P783-9

SEQ ID NO 24: SGGNNSPAE, обозначаемая P783-10

SEQ ID NO 25: SGGNNSPAR, обозначаемая P783-11.

Авторы ограничились концентрациями конкурентных пептидов, использованными в предыдущих экспериментах, поскольку было бы невозможно оценить относительное сродство связывания конкурентных пептидов в рамках одного исследования. Результаты конкурентного анализа ELISA библиотеки (графически представлены на фиг.4) показывают диапазон сродства связывания относительно 9-мерного Р782-10 (SGGNNSPAV), SEQ ID NO: 10. Особенно важными эпитопами являются варианты с аланином, лейцином и метионином (SEQ ID NO: 15, 17 и 18) особенно при концентрациях эпитопов 125 мкМ и 31,3 мкМ. Наиболее предпочтительными из этих вариантов являются варианты с аланином и метионином, поскольку они обладают повышенной устойчивостью к нагреванию, что делает их особенно эффективными для использования в странах с жарким климатом.

Анализ ELISA

Подходящий способ осуществления анализа ELISA по настоящему изобретению выглядит следующим образом.

Для определения наличия или отсутствия Mycobacterium tuberculosis образец пациента приводят в контакт с антителом, направленным против SEQ ID NO: 11; определяют наличие или отсутствие комплекса, сформированного между пептидом в образце и указанным антителом; определяют количество комплекса, образованного в указанном образце по сравнению с контролем, принимаемым за значение нормы, где увеличение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis. Основные способы осуществления анализов ELISA известны специалисту в данной области. Образцы пациентов могут быть получены в виде жидкостей, таких как кровь, слюна, сперма и молоко, или образцов ткани, таких как материал биопсии, подходящим образом полученный, например, путем гомогенизации. Тем не менее, предпочтительными являются образцы, полученные из дыхательных путей. Особенно предпочтительна мокрота или жидкости, полученные бронхиальным или легочным лаважем. Наиболее предпочтительными, тем не менее, являются образцы, полученные индуцированием кашлевого рефлекса у пациента путем распыления аэрозоля и сбора полученного материала из дыхательных путей пациента; эти образцы содержат материал, происходящий из трахеи.

Заместительный анализ ELISA

Подходящий способ осуществления заместительного анализа ELISA по настоящему изобретению выглядит следующим образом.

Для определения наличия или отсутствия Mycobacterium tuberculosis получают композицию, содержащую пептид, как описано в настоящем документе и определено в формуле изобретения, и образец пациента. Композицию приводят в контакт с антителом, направленным против SEQ ID NO: 11; определяют наличие или отсутствие комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и количество комплекса, образованного в указанном образце, сравнивают с контролем, принимаемым за значение нормы, где снижение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.

Специалистам в данной области известны основные способы осуществления заместительных анализов ELISA. Кроме того, образцы пациентов могут быть получены в виде жидкостей организма, таких как кровь, слюна, сперма и молоко, или образцы ткани, такие как биопсийный материал, полученный подходящим образом, например путем гомогенизации. Тем не менее, предпочитаются образцы, получаемые из дыхательных путей. Особенно предпочтительна мокрота или жидкости, полученные бронхиальным или легочным лаважем. Наиболее предпочтительными, тем не менее, являются образцы, полученные индуцированием кашлевого рефлекса у пациента путем распыления аэрозоля и сбора полученного материала из дыхательных путей пациента; эти образцы содержат материал, происходящий из трахеи.