Результат интеллектуальной деятельности: БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА ДЛЯ КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, а именно к косметологии, и может быть использовано при производстве косметических средств с лечебно-профилактическими свойствами.

Известно, что в процессе жизнедеятельности медицинская пиявка (Hirudo medicinalis) вырабатывает широкий спектр биологически активных веществ (БАВ): гирудин, ингибитор калликреина плазмы крови, бделлины, эглины, гиалуронидазу, дестабилазный комплекс, липазы, простагландины и др.

В зависимости от способа обработки медицинской пиявки выделяют комплексы БАВ, различные по своей структуре и составу, которые обуславливают свойства получаемых из них препаратов.

Известны препараты (Никонов Г.И. “Медицинская пиявка. Основы трудотерапии”. СПб.: “СДС”, 1998, с.32-68, 206-242, Патент РФ №2153325, МКИ А 61 К 7/48, опубл. 2000 г.), полученные путем гомогенизации медицинской пиявки и применяемые в виде нативного гомогената или его экстракта.

Однако низкое содержание биологически активных веществ, находящихся в активном состоянии и способных обеспечивать стимуляцию белково-липидного обмена в коже и подкожной клетчатке, не позволяет эффективно использовать их в качестве биологически активных добавок в косметических средствах.

При этом продукты, полученные непосредственно из живой пиявки, сильно загрязнены балластными веществами, различными бактериями и, прежде всего, продуктами жизнедеятельности (эндо- и экзопептидазами) бактерии-симбионта пиявки (Aeromonas hirudinis), и их применение часто провоцирует аллергические реакции организма. Кроме того, БАВ в нативном гомогенате сохраняют свою активность лишь незначительный срок. Поэтому препараты на основе гомогената или экстракта гомогената из медицинских пиявок и их частей имеют крайне ограниченное применение как в лечебных, так и в косметических средствах.

Попытки применить методы криообработки гомогената, полученного из медицинской пиявки (заявка №94031070, МКИ⁷ А 61 К 35/62, опубл. 10.09.96 г.), позволили несколько повысить биологическую активность целевого продукта.

Однако степень его воздействия на кожу остается низкой, а проявляемые свойства имеют нестабильный характер, поскольку в результате гомогенизации подавляющее количество БАВ, адсорбированных на стенке бактерии-симбионта пиявки и на поверхности балластных веществ кутикулы пиявки, остаются в связанном состоянии и не переходят в надосадочную жидкость.

Частично решить эти проблемы удалось при использовании технологий получения препарата из медицинских пиявок путем их замораживания с последующим лиофильным высушиванием (Патент РФ №2033173, МКИ А 61 К 35/62, опубл. 95 г.). Полученное таким образом порошкообразное вещество содержит достаточно широкий комплекс биологически активных соединений, длительное время сохраняет активность и используется как самостоятельно в лечебных целях, например, в качестве препарата, обладающего антитромботическим, тромболитическим, антиатеросклеротическим и гипотензивным действием, так и в составе косметических средств.

Наиболее близким из известных к описываемому изобретению является способ получения биологически активной добавки для косметических средств (Патент РФ №2113843, МКИ⁷ А 61 К 7/48, опубл. 98 г.) путем замораживания медицинской пиявки. Полученная известным способом биологически активная добавка (БАД) представляет собой надосадочную жидкость экстракта из порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок и при включении в косметические средства оказывает некоторое влияние на белково-липидный обмен в коже.

Однако известный способ получения БАД включает лиофильную сушку медицинской пиявки и измельчение лиофилизата до порошкообразного состояния, что не способствует сохранению БАВ в активном состоянии и, прежде всего, липосомы (дестабилазный комплекс). В процессе лиофилизации большая часть БАВ адсорбируется на стенке пищеварительного тракта, мышечных клетках тела пиявки, а также на балластных веществах кутикулы пиявки и не переходят в жидкую фазу в процессе экстрагирования, утрачивая свойства ингибировать ферменты. Кроме того, известный способ получения БАД для косметических средств требует предварительного промывания медицинской пиявки дистиллированной водой или физиологическим раствором и просушивания ее перед замораживанием, в результате чего происходит непроизвольный выброс секрета слюнных желез, а потому имеют место потери ценных биологически активных веществ (БАВ). И, как следствие, полученная известным способом БАД не обладает достаточной степенью активности из-за низкого содержания антиоксидантов, а также веществ, обеспечивающих стимуляцию белково-липидного обмена в коже и подкожной клетчатке, что является причиной проявления такого нежелательного эффекта, как накопление суммарных липидов в коже (нарушение метаболизма липидов). Кроме того, отсутствие веществ, стимулирующих увеличение парциального содержания кислорода в крови микроциркулярного русла кожи, не позволяют получить БАД для косметических средств с антигипоксическими свойствами.

При этом загрязнение конечного состава известной БАД балластными веществами и продуктами жизнедеятельности бактерии-симбионта пиявки увеличивают ее протеолитическую активность, которая является нежелательным фактором воздействия на клетки кожи, поскольку вызывает снижение собственной ферментативной активности клетки кожи, а при длительном применении может вызвать аллергический ответ.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, состоит в повышении биологической активности целевого продукта, получаемого из медицинской пиявки, за счет устранения возможности комплексообразования БАВ на поверхности мембраны бактерии-симбионта медицинской пиявки и высвобождения новых БАВ в активной форме.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биологически активной добавки для косметических средств путем замораживания медицинской пиявки замороженную пиявку оттаивают, гомогенизируют, полученный гомогенат экстрагируют в воде или физиологическом растворе и выдерживают в течение 2-10 часов при комнатной температуре, после чего выделяют жидкую фазу в качестве целевого продукта.

При этом для получения БАД с антипрокоагулянтным и гипотензивным действием выделенную жидкую фазу дополнительно подкисляют до значения рН 5,2-6,0 и прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-25 минут.

Указанный технический результат достигается также биологически активной добавкой, полученной по описанному выше способу.

Биологически активная добавка для косметических средств, полученная в соответствии с настоящим изобретением, содержит следующие ингредиенты: гиалуронидазу, гирудин, липосому (дестабилазный комплекс, структурированный в липосому, который разрушается при лиофилизации), антиоксиданты, стабильный аналог простациклина (6-keto-PGF_1α ), ингибиторы трипсина, плазмина и тромбина, липаза и холестерин-эстераза, а также антигипоксанты.

Полученная композиция БАВ позволяет стимулировать белковый обмен и повысить уровень суммарных липидов в коже, обладает выраженным антиоксидантным и антигипоксичесим действием, не проявляя при этом пртеолитической активности, раздражающего или аллергизирующего действия.

Описываемый способ получения БАД для косметических средств осуществляют следующим образом.

Медицинские пиявки замораживают, например, в бытовой морозильной камере, замороженную массу оттаивают при комнатной температуре, гомогенизируют, заливают водой или физиологическим раствором и выдерживают при комнатной температуре 2-10 часов, после чего полученный препарат перемешивают и выделяют жидкую фазу. Полученный жидкий продукт используют непосредственно в качестве БАД для косметической продукции.

Выделение жидкой фазы осуществляют любым известным способом, например центрифугированием, фильтрованием или отстаиванием. Продукт может быть передан на следующую стадию - подкисления и термической обработки - для получения БАД с антипрокоагулянтным и гипотензивным действием и/или подвергнут выпариванию до порошкообразного состояния с целью длительного хранения.

Установлено специфичное для биологии медицинской пиявки явление. Симбионт пиявки - бактерия Aeromonas hirudinis, обитающая в кишечном канале пиявки и обеспечивающая пиявку необходимыми для ее жизни веществами, синтезирует биологически активные вещества не только своими органеллами, но и на поверхности мембраны (в примембранном матриксе). Причем имеют место специфическая (синтез дистабилазного комплекса; активация неактивных форм предшественников БАВ) и неспецифическая (депонирование гирудина, антигипоксантов, простагландинов и т.д.) адсорбция БАВ на внешней поверхности мембраны. Процесс криообработки путем замораживания целой живой пиявки с последующим ее оттаиванием позволяет перевести бактерию в состояние спор при сохранении целостности бактерии-симбионта. При этом разрушаются адсорбционные связи между БАВ и стенкой бактерии, что приводит к переводу БАВ из связанного с матриксом состояния в свободное, т.е. происходит преобразование БАВ из состояния предшественника в активную форму. В результате последующей гомогенизации пиявочной массы и экстрагирования гомогената освобожденные БАВ легко переходят в жидкую фазу, в то время как бактерия и осколки ее оболочек после гомогенизации вместе с протеолитическими ферментами, эндо- и экзопептитазами поступает в осадок. Полученная водная субстанция активизированных БАВ и есть целевой продукт.

При этом установлено, что применение приемов замораживания-оттаивания уже размельченной пиявочной массы (гомогената), как это предлагается в упомянутом выше аналоге, не приводит к спорообразованию, комплексы БАВ - стенка бактерии-симбионта сохраняются, БАВ остаются в связанном с частями бактерии состоянии и не переходят в раствор, поступая в осадок, а потому не наблюдается какого-либо значительного повышения биологической активности.

В таблице представлены свойства полученной в соответствии с описываемым способом биологически активной добавки (А) в сравнении с характеристиками известных препаратов аналогичного действия (БАД по прототипу - патент РФ 2113843 (С) и препарата, полученного с применением приемов криообработки гомогената из медицинской пиявки (заявка РФ 94031070 (В)).

Сущность изобретения поясняется конкретными примерами реализации описываемого изобретения, где в примерах 1 и 2 показаны варианты осуществления способа получения БАД для косметических средств, а в примерах 3-9 приведена экспериментальная оценка эффективности полученной БАД.

Пример 1

Берут 500 медицинских пиявок общим весом 600 г, замораживают при температуре -4° С, оттаивают при комнатной температуре на льду в течение шести часов, гомогенизируют в гомогенизаторе Politron P-40 до состояния однородной массы.

Полученную массу заливают дистиллированной водой, доводя объем гомогената до 1 литра (соотношение объемов 1:1), выдерживают при комнатной температуре в течение 10 часов, перемешивают, центрифугируют и собирают выделенную жидкость. Таким образом получают 650 мл жидкого целевого продукта. В целях длительного хранения продукт подвергают выпариванию, получая 25 г порошкообразной БАД к косметическим средствам.

Пример 2

Берут 100 медицинских пиявок (общий вес 120 г), замораживают при температуре -4° С, оттаивают при комнатной температуре в течение четырех часов, гомогенизируют, доводят дистиллированной водой объем гомогената до 240 мл, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение шести часов, собирают супернатант и определяют активности.

В полученный супернатант добавляют 0,1% раствор НСl до значения рН=5,6, после чего раствор прогревают в кипящей бане в течение 15 минут, центрифугируют и собирают выделенную жидкость. Получают 100 мл жидкого целевого продукта.

Пример 3. Изучение раздражающего и аллергизирующего действия БАД, ее подострой токсичности, влияния накожных длительных аппликаций препаратов на морфологические структуры кожи и печени экспериментальных животных.

Исследования проводились на 90 половозрелых морских свинках, находящихся на обычном рационе питания. Полученную по способу, описанному в примере 1, жидкую БАД наносили на кожу морских свинок ежедневно в течение 30 дней в концентрации 0,001% (n=30), 0,01% (n=30), и 0,1% (n=15). В качестве контроля животным апплицировали 0,85% раствор NaCl (физиологический раствор; n=15).

Результаты исследований показали, что полученный в соответствии с описываемым способом продукт не обладает раздражающим и аллергизирующим действием на кожу, отрицательного действия на морфологические структуры кожи и печени не оказывает, не вызывает общетоксического действия на организм подопытных животных. Животные не отставали в прибавлении веса от контрольных, были активны, подвижны, имели блестящую шерсть, хороший аппетит. При анализе влияния препарата-прототипа установлено аллергизирующее действие на кожу животных, которое выражалось в нарушении пигментации отдельных участков кожи и расчесывании кожи. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии отрицательного воздействия полученного комплекса БАВ на состояние кожи экспериментальных животных.

Пример 4. Изучение содержания общего растворимого белка в коже.

Исследования проводились по стандартному методу Д.Бейли.

Полученный по способу, описанному в примере 1, жидкий продукт наносили на кожу экспериментальных животных по методике и в режиме, аналогично описанному в примере 3.

Результаты испытаний, приведенные в таблице, свидетельствуют об эффективности полученного в соответствии с описываемым изобретением препарата в стимулировании белкового обмена.

Пример 5. Изучение суммарных липидов в коже.

Воздействие полученным препаратом на исследуемых животных проводили по методике, аналогичной описанной в примере 3, содержание суммарных липидов определялось по общепринятой методике Хуэрго.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о выраженном влиянии исследуемого препарата на метаболизм липидов, обусловленном избирательным воздействием описываемого комплекса БАВ на свободные липиды, в то время как при воздействии БАД согласно прототипу происходит делипидизация мембранной клетки, т.е. разрушение структурных липидов.

Пример 6. Изучение содержания малонового диальдегида.

Исследования проводились по стандартному методу В.Стальной.

Результаты отражены в таблице.

Достоверное снижение уровня малонового диальдегида является показателем антиоксидантной активности исследуемого комплекса БАВ.

Пример 7. Изучение антигипоксического действия БАД.

Исследование проводилось по стандартному методу Н.Агаджаняна “Определение устойчивости к гипоксии в группе крыс” на 28-ми половозрелых крысах-самцах линии Вистар, находящихся на обычном рационе питания.

Жидкую БАД, полученную в соответствии с настоящим изобретением, наносили на кожу 14-ти животных ежедневно в течение 45 дней в концентрации 0,01% (n=14). В контрольной группе (n=14) животным апплицировали 0,85% раствор NaCl (физиологический раствор). Обе группы животных были помещены в барокамеру, в которой производилась откачка воздуха до давления, соответствующего высоте 12000 м над уровнем моря. Спустя 4 минуты восстанавливали исходное давление воздуха. В контрольной группе выжило 2 крысы (14,3%), в опытной - 8 (57,1%). То есть выживаемость крыс при использовании описываемой БАД увеличивается в 4 раза, что свидетельствует об антигипоксическом действии препарата.

Пример 8. Изучение антипрокоагулянтного действия.

Противотромботическое действие препарата, полученного по способу, описанному в примере 2, определяли на крысах с использованием метода тромбообразования по Весслеру. Степень блокады тромбообразования оценивали при интервале между введением раствора препарата и активированной стеклом сыворотки крови человека, составляющем 4 часа, и выражали в процентах относительно контроля (равный объем физиологического раствора).

При внутривенном введении 0,3 мл как 0,01%, так и 0,001% раствора препарата степень блокады тромбообразования составила 100%.

При введении 0,3 мл 0,001% раствора препарата по прототипу (С) степень блокады тромбообразования составила 45%, а препарата (В) - 85%.

Пример 9. Изучение гипотензивного действия.

Гипотензивное действие определяли при пероральном введении 2 мл препарата крысам линии SHR (спонтанно гипертензивные). Исходный уровень давления составлял 165-5 мм рт. ст. Спустя 10 часов анализировали уровень давления в хвостовой вене крыс. Гипотензивное действие выражали в процентах относительно контроля (равный объем физиологического раствора). Экспериментальным животным вводили препарат, получение которого описано в примере 2.

Уровень давления в хвостовой вене крыс составил при введении 0,001% раствора БАД по сравнению с контролем 15-5%, при введении 0,01% раствора - 25-5%, что свидетельствует о выраженном гипотензивном действии препарата.

Другие свойства описываемого продукта, представленные в таблице, анализировали по общепринятым методикам для определения каждого параметра. Сведения, представленные в таблице, указывают на значительное увеличение активности препарата по сравнению с аналогичными продуктами, полученными из медицинской пиявки.

Полученный комплекс БАВ стимулирует белковый обмен, увеличивает содержание суммарных липидов в коже, обладает выраженным антиоксидантным, антигипоксическим и гипотензивным действием, не проявляет раздражающего и аллергизирующего действия на кожу и предназначен для использования в качестве биологически активной добавки для косметических средств.