НОВАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буфере, пригодном для поддержания значения рН раствора в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Такую композицию предпочтительно применяют для профилактики и лечения заболеваний, связанных с эритропоэзом.

Эритропоэз представляет собой процесс образования эритроцитов, который служит для восполнения клеточной деструкции. Эритропоэз представляет собой контролируемый физиологический механизм, в результате которого образуется количество эритроцитов, достаточное для соответствующего насыщения ткани кислородом. Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин (hEPO) продуцируется в почке и представляет собой гуморальный плазматический фактор, стимулирующий образование эритроцитов (Р.Carnot и С.Deflandre, C.R.Acad. Sci. 143: 432 (1906); A.J.Erslev, Blood 8: 349 (1953); K.R.Reissmann, Blood 5: 372 (1950); L.O.Jacobson, E.Goldwasser, W.Freid и L.F.Pizak, Nature 179: 6331-6334 (1957)). Встречающийся в естественных условиях ЕРО стимулирует деление и дифференцировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге и проявляет свою биологическую активность посредством связывания с рецепторами на эритоидных предшественниках (B.S.Krantz, Blood 77: 419 (1991)).

Эритропоэтин был получен путем биологического синтеза с использованием методики рекомбинантной ДНК (J.C.Egrie, T.W.Strickland, J.Lane и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)), и он представляет собой продукт клонированного гена человеческого ЕРО, который встраивали и экспрессировали в клетках ткани яичника китайского хомячка (СНО-клетки). Первичная структура доминирующей полностью процессированной формы hEPO представлена в SEQ ID NO:1. В ней присутствуют два дисульфидных мостика между Cys⁷-Cys¹⁶¹ и Cys²⁹-Cys³³. Молекулярная масса полипептидной цепи ЕРО без фрагментов сахара составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЕРО примерно 40% молекулярной массы приходится на долю углеводных групп, которые приводят к гликозилированию протеина в сайтах гликозилирования протеина (H.Sasaki, В.Bothner, A.Dell и М.Fukuda, J.Biol. Chem. 262: 12059 (1987)).

Поскольку человеческий эритропоэтин играет ключевую роль в образовании эритроцитов, то этот гормон можно применять при лечении заболеваний крови, для которых характерно низкое производство эритроцитов или производство аномальных эритроцитов. В клинических условиях ЕРО применяют для лечения анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (J.W.Eschbach, J.C.Egri, M.R.Downing и др., NEJM 316: 73-78 (1987); J.W.Eschbach, M.H.Abdulhadi, J.K.Browne и др.. Ann. Intern. Med.111: 992 (1988); J.C. Egrie, J.W. Eschbach, T.McGuire, J.W.Adamson, Kidney Intl. 33: 262 (1988); V.S.Lim, R.L.Degowin, D.Zavala и др.. Ann. Intern. Med. 110: 108-114 (1989)) и пациентов, страдающих СПИДом, и пациентов, страдающих раком и подвергающихся химиотерапии (R.P.Danna, S.A.Rudnick, R.I. Abels в: Garnick M.B. (ред.) Erythropoietin in Clinical Application - An International Perspective, New York, NY: Marcel Dekker; стр.301-324 (1990)).

Известные фармацевтические композиции имеют по меньшей мере один из перечисленных ниже недостатков:

- Они представляют собой лиофилизаты. Помимо того, что процесс их производства является сложным, недостатком лиофилизатов является то, что их необходимо восстанавливать перед осуществлением инъекции людям. Это приводит к необходимости осуществления медицинским персоналом дополнительных операций, что является затруднительным и сопряжено с риском неправильного обращения с фармацевтическим продуктом;

- Они содержат в качестве добавки человеческий сывороточный альбумин. Поскольку человеческий сывороточный альбумин представляет собой продукт, полученный из общей воды организма человека, то существует риск возникновения вирусных инфекций в результате загрязнения альбуминового препарата. Возможны также аллергические реакции.

- Все поступающие в настоящее время в продажу композиции, содержащие эритропоэтин, являются нестабильными при повышенных температурах, т.е. при температурах, превышающих температуру холодильника, которая, как правило, составляет 2-8°С. Поэтому их необходимо хранить в холодильнике (2-8°С) и нельзя хранить при комнатной температуре (приблизительно 20°С). Это приводит к дополнительным расходам, связанным с процессом хранения при пониженной температуре и необходимостью иметь для этого соответствующее оборудование, а также затрудняет применение лекарственного средства. Понятие «нестабильный» в контексте настоящего описания обозначает, что хранение при повышенных температурах, например, при 25°С, в течение продолжительного периода времени (например, в течение нескольких месяцев или более 6 месяцев) приводит к разложению протеина. В контексте настоящего описания понятие «разложение» обозначает физические изменения (например, агрегацию или денатурацию) и химические изменения (например, окисление или в целом модификацию химических связей) молекулы протеина, которые, как известно, происходят прежде всего при повышенных температурах (выше 8°С). Инкубация протеина при температурах, близких или превышающих его температуру фазового перехода (которую называют также температурой плавления), приводит к развертыванию протеина, т.е. при этом теряется нативная структура и биологическая активность полипептида. Температура фазового перехода строго коррелирует с термостабильностью протеина и зависит от окружающей среды, в которой находится протеин (например, от значения рН, присутствия солей, ионной силы, наличия буферной субстанции и т.п.). Например, денатурация может приводить к агрегации молекул эритропоэтина, т.е. образованию димеров (с ковалентными или нековалентными связями), агрегатов более высокого порядка и даже отдельных частиц. Это приводит к снижению эффективности лекарственного средства и может вызывать нежелательные побочные действия после инъекции людям.

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача создать фармацевтическую композицию, которая позволяет минимизировать или устранить указанные выше недостатки.

Согласно настоящему изобретению задачу решают путем создания фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буферном растворе, имеющем значение рН в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что включение эритропоэтина в такую композицию улучшает его стабильность при температурах, превышающих температуру холодильника (2-8°С), прежде всего при комнатной температуре (т.е. ниже 25°С), и даже при более высоких температурах, например при 40°С. Это означает, что композицию можно хранить без охлаждения в течение продолжительного периода времени и при этом не происходит существенной потери активности и существенного разложения.

Если не указано иное, то понятия, применяемые для иллюстрации и определяющие значение и объем различных терминов, используемых при описании настоящего изобретения, имеют следующие значения.

Понятие «многозарядный неорганический анион» обозначает неорганический анион, имеющий два или более отрицательных зарядов на молекулу, например, анион сульфата SO₄ ^2- или анион фосфата, т.е. кислый фосфат HPO₄ ^2-. Многозарядный неорганический анион можно добавлять в форме соответствующей соли, например натриевой соли, калиевой соли и их смесей и/или в форме буфера, например, фосфатного буфера.

Понятие «изоосмотический или изотонический» обозначает раствор, который можно смешивать с общей водой организма, не оказывая влияния на ее компоненты. Растворы, которые являются изотоническими с кровью, такие как 0,9%-ный раствор хлорида натрия, имеют такое же осмотическое давление, что и сыворотка, и они не влияют на мембраны эритроцитов. Как правило, растворы, которые являются изотоническими с кровью, имеют осмотическое давление приблизительно 290 мОсм/кг Н₂О.

Понятие «сильная неорганическая кислота» обозначает неорганические кислоты, диссоциация которых в 1н. растворе составляет от 20 до 100%, например, H₂SO₄.

Понятие «фармацевтически приемлемый» в контексте настоящего описания означает, что буфер или соли являются приемлемыми с точки зрения токсичности.

Понятие «разбавитель» обозначает входящий в состав медицинского препарата ингредиент, который не обладает фармакологической активностью, но который является необходимым или желательным с фармацевтической точки зрения. Например, разбавитель может представлять собой жидкость для растворения предназначенного(ых) для инъекции лекарственного(ных) средства(в), например воду.

Понятие «растворители» относится к жидкости, которая содержит растворенную в ней другую субстанцию, т.е. растворяет ее, например к воде.

Понятие «консерванты» относится к субстанции, которую добавляют в фармацевтическую композицию для предупреждения роста бактерий, например бензалконийхлорид или бензиловый спирт.

Понятие «полиол» относится к любой субстанции, несущей несколько гидроксильных групп, в том числе к многоатомным спиртам и углеводам. Многоатомные спирты включают такие соединения, как сорбит, маннит и глицерин. Углеводы представляют собой циклические молекулы, несущие кето- или альдегидную группу, такие, например, как сахароза или трегалоза.

Понятие «эритропоэтин» или «протеин эритропоэтин» относится к протеину, обладающему in vivo биологической активностью, приводящей к тому, что клетки костного мозга увеличивают продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые описаны ниже.

Понятие «пэгилированный эритропоэтин (Пэг-ЕРО или ПЭГ-ЕРО) относится к протеину эритропоэтину, ковалентно связанному с одним-тремя производными полиэтилена, как это описано ниже.

Понятие «устройство» обозначает приспособление, предназначенное для конкретной цели. В контексте настоящего изобретения цель заключается в осуществлении, поддержании или облегчении введения жидкой фармацевтической композиции.

Описание чертежей

Фиг.1: Первичная структура человеческого ЕРО (165 аминокислот) (SEQ ID NO:1).

Фиг.2: Первичная структура человеческого ЕРО (166 аминокислот) (SEQ ID NO:2).

Фиг.3: Влияние значения рН на термостабильность. Представлен график зависимости температуры фазового перехода от значения рН.

Фиг.4: Влияние ионной силы на термостабильность. Представлен график зависимости температуры фазового перехода от концентрации фосфата.

Фиг.5: Зависимость термостабильности от типа буферной субстанции.

Фиг.6: Приведены данные, свидетельствующие о том, что сульфат является также приемлемым буфером/добавкой при низких значениях рН (например, при рН 6,2), в то время как фосфат при рН 6,2 менее эффективен, чем при рН 7,5. Это свидетельствует о том, что сульфат обеспечивает высокий уровень термостабильности даже при низких значениях рН.

Фиг.7: Зависимость агрегации ПЭГ-ЕРО от значения рН. Образцы ПЭГ-ЕРО после теплового стресса (как описано выше) анализировали с помощью ПААГ-ДСН. Протеины окрашивали серебром. Полоса 1: стандарт молекулярной массы. Полоса 2: рН 5. Полоса 3: рН 5, после восстановления. Полоса 4: рН 6. Полоса 5: рН 6, после восстановления. Полоса 6: рН 6,5. Полоса 7: рН 6,5, после восстановления. Полоса 8: рН 7. Полоса 9: рН 7, после восстановления. Полоса 10: ПЭГ-ЕРО, без теплового стресса.

Фиг.8: Приведены данные о том, что использование ацетилцистеина в концентрации 1 мг/мл в качестве антиоксиданта предупреждает образование агрегатов в условиях теплового стресса. Агрегация ПЭГ-ЕРО в условиях теплового стресса (80°С в течение 20 мин): полоса 1: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5, без стресса; полоса 2: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5, в условиях стресса; полоса 3: ПЭГ-ЕРО при рН 6,2, в условиях стресса; полоса 4: ПЭГ-ЕРО при рН 6,2, в условиях стресса, после восстановления; полоса 5: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5+1 мг/мл N-ацетилцистеина, в условиях стресса; полоса 6: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5+1 мг/мл N-ацетилцистеина, в условиях стресса, после восстановления.

Фиг.9: Содержание сиаловой кислоты (NANA) в образцах новых композиций, включающих ПЭГ-ЕРО, хранившихся в течение 6 месяцев при различных температурах.

Фиг.10: Анализ в опытах на мышах биологической активности образцов, содержащих ПЭГ-ЕРО, которые хранились в течение 6 месяцев при различных температурах в 10 мМ фосфате натрия, 40 мМ сульфате натрия, 3% (мас./об.) манните, рН 6,2.

Фиг.11: Сопоставление хроматограмм, полученных методом гель-фильтрации, для образцов, содержащих ПЭГ-ЕРО, которые хранились в течение 6 месяцев при различных температурах в 10 мМ фосфате натрия, 40 мМ сульфате натрия, 3% (мас./об.) манните, рН 6,2 (сверху вниз: буфер, исходный продукт, 4°С, 25°С, 30°С и 40°С).

Более конкретно, настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буфере, пригодном для поддержания значения рН раствора в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой жидкий раствор, например водный раствор. В предпочтительном варианте осуществления указанные выше фармацевтические композиции представляют собой изотонические растворы.

Анион предпочтительно выбирают из анионов сильных неорганических кислот, таких как H₂SO₄, Н₃PO₄ или лимонная кислота. Таким образом, предпочтительные анионы выбирают из группы, включающей сульфат, фосфат и цитрат, предпочтительным является сульфат или фосфат, наиболее предпочтительным является сульфат. Концентрация многозарядного неорганического аниона может составлять от 10 до 200 ммолей/л, например, для сульфатного аниона она может составлять от 10 до 200 ммолей/л.

В качестве буфера, применяемого согласно изобретению для поддержания значения рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, предпочтительно от 5,8 до 6,7, более предпочтительно от 6,0 до 6,5 и наиболее предпочтительно на уровне приблизительно 6,2, можно применять обычные буферы на основе органических или неорганических кислот (например, фосфатный буфер, аргинин/Н₂SO₄/Na₂SO₄-буфер или любую другую фармацевтически приемлемую буферную систему). В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит фосфатный буфер или аргинин/Н₂SO₄/Na₂SO₄-буфер, более предпочтительно фосфатный буфер с концентрацией 10-50 ммолей/л. Очевидно, что комбинации этих буферных систем также подпадают под объем настоящего изобретения. Значение рН можно регулировать с помощью соответствующего основания, например, NaOH, в фосфатной буферной системе, и соответствующей кислоты, например, серной кислоты в аргининовой буферной системе, соответственно.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Такие фармацевтически приемлемые эксципиенты можно выбирать из группы, включающей фармацевтически приемлемые соли, разбавители, и/или растворители, и/или консерванты и т.д., например, агенты для регулирования тоничности (агенты, обеспечивающие изотоничность), полиолы, антиоксиданты или неионогенные поверхностно-активные вещества. Примерами таких субстанций являются хлорид натрия, хлорид кальция, сорбит, маннит, глицерин, сахароза, трегалоза, ацетилцистеин, полисорбат 20, полисорбат 80 или плуроник F68.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции могут содержать полиол, выбранный из группы, включающей маннит, сорбит, глицерин, трегалозу и сахарозу, предпочтительно маннит. Концентрация полиола может составлять 1-10% (мас./об.).

Примерами антиоксидантов являются цистеин, метионин, ацетилцистеин или аскорбиновая кислота, предпочтительно метионин. Антиоксиданты, как правило, можно добавлять в концентрации от 0,01 до 0,5% (мас./об.), или, например, в случае метионина, в концентрации 1-20 мМ.

Вышеописанные композиции необязательно могут содержать также обеспечивающий изотоничность агент в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,9 мас.%. Такие соединения известны в данной области; примерами таких агентов являются хлорид натрия или сульфат натрия. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиции представляют собой изотонические растворы. Вышеописанные композиции могут содержать также неионогенные детергенты полисорбат 20, полисорбат 80 или плуроник F68, предпочтительно плуроник F68, например, в количестве до 1% (мас./об.), более предпочтительно до 0,1% (мас./об.), например, от 0,001 до 0,01% (мас./об.).

Вышеописанная композиция может содержать также другие соли, например, до 1 ммоля/л CaCl₂.

Настоящее изобретение относится прежде всего к получению фармацевтических композиций, содержащих в качестве обладающего фармацевтической активностью ингредиента эритропоэтин. Понятие "эритропоэтин" или "протеин эритропоэтин" или "ЕРО" обозначает следующее: указанные понятия относятся прежде всего к гликопротеину, например, человеческому эритропоэтину, например, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или в SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, практически гомологичную указанным последовательностям, биологические свойства которого обусловливают стимуляцию производства эритроцитов и стимуляцию деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. В контексте настоящего описания эти понятия включают такие протеины, которые преднамеренно модифицированы, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза, или в результате случайных мутаций. Эти понятия также включают аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Эти понятия включают как встречающийся в естественных условиях, так и полученный рекомбинантным путем человеческий эритропоэтин.

Как это подробно описано ниже, методы получения и очистки ЕРО хорошо известны в данной области. Эритропоэтин представляет собой встречающийся в естественных условиях или рекомбинантный протеин, предпочтительно человеческий, который можно получать из любого доступного источника, например, из тканей, путем синтеза протеина, из клеточной культуры с использованием встречающихся в естественных условиях или рекомбинантных клеток. Это понятие включает любой протеин, обладающий активностью эритропоэтина, например, из группы мутеинов или иным образом модифицированных протеинов. Рекомбинантный ЕРО можно получать путем экспрессии в линиях клеток СНО, ВНК (клетки почки детеныша хомяка) или HeLa (культура опухолевых клеток Элен Лейк), методом рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена. Методы экспрессии протеинов, включая эндогенную активацию гена, хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах US 5733761, 5641670 и 5733746 и в опубликованных международных заявках на патент WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждого из указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительными видами ЕРО для получения продуктов, содержащих гликопротеин эритропоэтин, являются виды человеческого ЕРО. Более предпочтительно виды ЕРО представляют собой человеческий ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или в SEQ ID NO:2, более предпочтительно аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

Кроме того, эритропоэтин может представлять собой аналог гликопротеина, имеющий от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования. Гликозилирование протеина, несущего одну или несколько олигосахаридных групп, происходит в определенных положениях на полипептидном каркасе и оказывает сильное влияние на физические свойства протеина, такие как стабильность протеина, секрецию, внутриклеточную локализацию и биологическую активность. Существует два типа гликозилирования. O-сшитые олигосахариды связываются с остатками серина или треонина, а N-сшитые олигосахариды связываются с остатками аспарагина. Одним из типов олигосахаридов, обнаруженных как в N-сшитых, так и в O-сшитых олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота), принадлежащая к семейству аминосахаров, несущих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота, как правило, представляет собой концевой остаток как на N-сшитых, так и на O-сшитых олигосахаридах и, поскольку она несет отрицательный заряд, она придает гликопротеину кислотные свойства. Человеческий эритропоэтин, имеющий 165 аминокислот, содержит три N-сшитых и одну O-сшитую олигосахаридные цепи, на долю которых приходится приблизительно 40% общей молекулярной массы гликопротеина. Гликозилирование N-сшитыми олигосахаридами происходит на остатках аспарагина в положениях 24, 38 и 83, а гликозилирование O-сшитыми олигосахаридами происходит на остатке серина в положении 126. Концевые остатки сиаловой кислоты модифицируют олигосахаридные цепи. Удаление с помощью ферментов всех остатков сиаловой кислоты из гликозилированного эритропоэтина приводит к потере активности in vivo, но не приводит к потере активности in vitro, поскольку сиалилирование эритропоэтина препятствует его связыванию и последующему клиренсу печеночным связывающим протеином.

Понятие «эритропоэтин», используемое применительно к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает аналоги человеческого эритропоэтина, имеющие одну или несколько замен в аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина, которые приводят к увеличению количества сайтов связывания с сиаловой кислотой. Такие гликопротеиновые аналоги можно создавать путем сайтнаправленного мутагенеза, приводящего к добавлениям, делециям или заменам аминокислотных остатков, вызывающим увеличение количества или изменение сайтов, пригодных для гликозилирования. Гликопротеиновые аналоги, имеющие содержания сиаловой кислоты, превышающие содержание, характерное для человеческого эритропоэтина, создают путем введения сайтов, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, обусловливающую их биологическую активность. Гликопротеины по настоящему изобретению включают также аналоги, имеющие повышенные уровни присоединения углеводов в сайте гликозилирования, для чего, как правило, осуществляют замену одной или нескольких аминокислот непосредственно вблизи N-сшитого или O-сшитого сайта. Гликопротеины по настоящему изобретению включают также аналоги, имеющие одну или несколько аминокислот, простирающихся от С-конца эритропоэтина и имеющие по меньшей мере один дополнительный углеводный сайт. Протеины эритропоэтины, входящие в состав композиции по настоящему изобретению, включают также аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая характеризуется перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Такая перегруппировка сайта гликозилирования представляет собой делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования в человеческом эритропоэтине и добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, не встречающихся в естественных условиях. Увеличение количества углеводных цепей на эритропоэтине и, следовательно, количества остатков сиаловой кислоты в молекулах эритропоэтина может придавать ценные свойства, такие как более высокая растворимость, повышенная устойчивость к протеолизу, пониженная иммуногенность, большее время полужизни в сыворотке и более высокая биологическая активность. Аналоги эритропоэтина, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, описаны более подробно в заявке на Европейский патент 640619 на имя Elliot, опубликованной 1 марта 1995 г.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит протеины эритропоэтины, имеющие аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования, такие как эритропоэтины, имеющие (но не ограничиваясь ими) последовательность человеческого эритропоэтина, включающую модификацию, выбранную из числа перечисленных ниже модификаций:

Asn³⁰Thr³²,

Asn⁵¹Thr⁵³,

Asn⁵⁷Thr⁵⁹,

Asn⁶⁹,

Asn⁶⁹Thr⁷¹,

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹,

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²,

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹,

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹,

Asn¹³⁶Thr¹³⁸,

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰.

Thr¹²⁵ и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

Условные обозначения, используемые в настоящем описании для указания модификации аминокислотной последовательности, означают, что аминокислота(ы) в положении(ях) последовательности соответствующего немодифицированного протеина (например, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 hEPO), указанных верхним(и) индексом(ами) заменены на аминокислоту(ы), указанную(ые) непосредственно перед соответствующим верхним индексом.

Протеин эритропоэтин может являться также аналогом, имеющим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования. Дополнительная аминокислотная последовательность может включать пептидный фрагмент, полученный из карбоксильного конца человеческого относящегося к хориону гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей (а) человеческий эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln (SEQ ID NO:3), простирающуюся от карбоксильного конца; (б) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ ЕРО; и (в) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

Протеин эритропоэтин может также являться аналогом, имеющим аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Перегруппировка может представлять собой делецию любого из N-связанных углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление N-связанного углеводного сайта в положение 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO и Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

В более предпочтительном варианте в качестве протеина эритропоэтина, входящего в состав описанной выше фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может применять также его пэгилированные производные. Пэгилированные производные эритропоэтина и содержащие их композиции известны в данной области и описаны, например, в ЕР-А-539167, ЕР-А-605963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, патенте US 556. ЕР-А-584876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, патентах US 5359030 и 5681811, патенте US 4179337, японском патенте, WO 98/32466, патенте US 5324650. Предпочтительными вариантами видов пэгилированного эритропоэтина являются описанные ниже производные.

В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение относится также к конъюгату эритропоэтина, который содержит описанный выше протеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, имеющие последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем добавления 1-6 сайтов гликозилирования или перегруппировки по меньшей мере одного сайта гликозилирования; где эритропоэтин ковалентно связан с «n» поли(этиленгликольными) группами формулы -СО-(СН₂)_х-(OCH₂CH₂)_m-OR, в которых радикал -СО (т.е. карбонил) каждой поли(этилен)гликольной группы образует амидную связь с одной из указанных аминогрупп; R обозначает (низш.)алкил; х равно 2 или 3; m представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900; n равно 1-3; и n и m выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата за вычетом молекулярной массы гликопротеина эритропоэтина составляла от 20 до 100 кДа. В настоящем изобретении предложены также фармацевтические композиции, содержащие описанные выше конъюгаты, в которых содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно 96% от общего количества всех конъюгатов, содержащихся в композиции.

Более конкретно указанные выше конъюгаты могут быть представлены формулой (I)

где Р обозначает описанный выше остаток протеина эритропоэтина (т.е. не содержащий аминогруппу или аминогруппы, которые образуют амидную связь с карбонилом, представленным в формуле I), обладающие биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга; и где R обозначает (низш.)алкил; х равно 2 или 3; m представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900; n равно 1-3; и n и m выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата за вычетом молекулярной массы гликопротеина эритропоэтина составляла от 20 до 100 кДа.

В контексте настоящего описания понятие «(низш.)алкил» обозначет алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, несущую 1-6 атомов углерода. Примерами (низш.)алкильных групп являются метил, этил и изопропил. Согласно настоящему изобретению R может представлять собой любой (низш.)алкил. Предпочтительными являются конъюгаты, в которых R представляет собой метил.

Символ «m» обозначает количество этиленоксидных звеньев (ОСН₂СН₂) в поли(этиленоксидной) группе. Одна этиленоксидная субъединица ПЭГ (полиэтиленгликоль) имеет молекулярную массу приблизительно 44 Да. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (за вычетом молекулярной массы ЕРО) зависит от числа «m». В конъюгатах по настоящему изобретению «m» представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900 (что соответствует молекулярной массе от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа), предпочтительно от приблизительно 650 до приблизительно 750 (что соответствует молекулярной массе от приблизительно 30 кДа). Число m выбирают таким образом, чтобы образующийся конъюгат по настоящему изобретению обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ЕРО, при этом его активность может быть равна, превышать или составлять часть соответствующей активности немодифицированного ЕРО. Понятие «молекулярная масса имеет приблизительно» указанную величину означает, что ее величина достаточно близка к указанному значению, которое определяют с помощью обычных аналитических методов. Число «m» выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса каждой поли(этиленгликольной) группы, ковалентно связанной с гликопротеином эритропоэтином, составляла от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа, предпочтительно приблизительно 30 кДа.

В конъюгатах по настоящему изобретению число «n» обозначает количество поли(этиленгликольных) групп, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая ε-аминогруппы аминокислоты лизина и/или N-концевые аминогруппы) протеина эритропоэтина с помощью амидной(ых) связи(ей). Конъюгаты по настоящему изобретению могут иметь одну, две или три ПЭГ-группы на молекулу ЕРО. «n» представляет собой целое число от 1 до 3, предпочтительно «n» равно 1 или 2, более предпочтительно «n» равно 1. Предпочтительными конъюгатами из числа описанных выше конъюгатов являются соединения, где х равно 2, m обозначает число от 650 до 750, n равно 1 и R обозначает метил.

Соединения формулы (I) можно получать из известных полимеров:

где R и m имеют указанные выше значения, путем конденсации соединения формулы II с гликопротеином эритропоэтином. Соединения формулы (II), в которых х равно 3, представляют собой сукцинимидиловые эфиры альфа(низш.)алкоксиполи(этиленгликоля) и масляной кислоты ((низш.)алкокси-ПЭГ-СМК). Соединения формулы (II), в которых х равно 2, представляют собой сукцинимидиловые эфиры альфа(низш.)алкоксиполи(этиленгликоля) и пропионовой кислоты ((низш.)алкокси-ПЭГ-СПК). Для получения амида можно использовать любой из обычных методов для осуществления взаимодействия активированного эфира с амином. В описанной выше реакции указанный в качестве примера сукцинимидиловый эфир представляет собой уходящую группу, позволяющую осуществлять образование амида. Применение сукцинимидиловых эфиров, таких как соединения формулы II, для получения конъюгатов с протеинами описано в патенте US 5672662, выданном 30 сентября 1997 г. (на имя Harris и др.).

Человеческий ЕРО содержит девять свободных аминогрупп, т.е. N-концевую аминогруппу плюс ε-аминогруппы 8 остатков лизина. Было установлено, что когда пэгилирующий реагент объединяют с СМК-производным формулы II, то при значении рН 7,5, соотношении протеин: ПЭГ, равном 1:3, и температуре реакции 20-25°С образуется смесь, содержащая моно-, ди- и следовые количества трипэгилированных продуктов. Если пэгилирующий реагент представлял собой СПК-производное формулы II, то в аналогичных условиях, за исключением того, что соотношение протеин: ПЭГ составляло 1:2, получали в основном монопэгилированные продукты. Пэгилированный ЕРО можно вводить в виде смеси или в виде различных пэгилированных видов, выделенных с помощью катионообменной хроматографии. Манипулируя условиями реакции (например, соотношением реагентов, значением рН, температурой, концентрацией протеина, продолжительностью реакции и т.д.) можно изменять относительные количества различных пэгилированных продуктов.

Описанные выше фармацевтические композиции могут содержать также указанный выше протеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, имеющие первичную структуру человеческого эритропоэтина, модифицированную путем добавления 1-6 сайтов гликозилирования; где гликопротеин ковалентно связан с одной-тремя (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, причем каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином с помощью линкера формулы -C(O)-X-S-Y- с фрагментом С(O) линкера, в результате чего образуется амидная связь с одной из аминогрупп, Х обозначает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, k равно 1-10, Y обозначает

или

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 51 до приблизительно 175 кДа. Такие виды эритропоэтина могут быть представлены также формулой (III)

где R может представлять собой любой (низш.)алкил, т.е. алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, несущую один-шесть атомов углерода, такую как метил, этил, изопропил и т.д. Предпочтительно алкил представляет собой метил. Х может представлять собой -(CH₂)_k-или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k имеет значение от 1 до приблизительно 10. Предпочтительно k имеет значение от 1 до приблизительно 4, более предпочтительно k равно 1 или 2. Наиболее предпочтительно Х обозначает -(СН₂).

В формуле 1 Y обозначает

или

предпочтительно

или

более предпочтительно

В формуле (III) число m выбирают таким образом, чтобы образовавшийся конъюгат формулы (III) обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ЕРО, при этом его активность может быть равна, превышать или составлять часть соответствующей активности немодифицированного ЕРО. m обозначает количество этиленоксидных звеньев на единицу ПЭГ. Одна субъединица ПЭГ, т.е. -(ОСН₂СН₂)-, имеет молекулярную массу приблизительно 44 Да. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (за вычетом молекулярной массы ЕРО) зависит от числа m. Понятие «молекулярная масса имеет приблизительно» указанную величину означает, что ее величина достаточно близка к указанному значению, что определяется с помощью обычных аналитических методов, m обозначает целое число от приблизительно 450 до приблизительно 900 (что соответствует молекулярной массе от 20 до 40 кДа), предпочтительно m составляет от 550 до приблизительно 800 (что соответствует молекулярной массе приблизительно от 24 до 35 кДа), и наиболее предпочтительно m составляет от приблизительно 650 до приблизительно 700 (что соответствует молекулярной массе от приблизительно 29 до приблизительно 31 кДа).

В формуле (III) n обозначает число ε-аминогрупп аминокислоты лизина в протеине эритропоэтине, ковалентно связанных с единицей ПЭГ с помощью амидной связи. Конъюгат по настоящему изобретению может иметь одно, два или три звена ПЭГ на молекулу ЕРО. n обозначает целое число от 1 до 3, предпочтительно n равно 1 или 2, наиболее предпочтительно n равно 1.

Предпочтительные протеины эритропоэтины формулы (III) описываются формулами:

и

Наиболее предпочтительные продукты, содержащие гликопротеин эритропоэтин, представлены формулой:

где n в указанных выше формулах обозначает целое число от 1 до 3; m обозначает целое число от 450 до 900; R обозначает (низш.)алкил; Х обозначает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- и Р обозначает остаток гликопротеина эритропоэтина без аминогруппы или групп, образующих амидную связь с X.

Другие предпочтительные продукты, содержащие гликопротеин эритропоэтин, представлены формулами:

и

Более предпочтительные продукты, содержащие гликопротеин эритропоэтин, представлены формулой:

Такие протеины эритропоэтины можно получать путем

(а) ковалентного взаимодействия ε-аминогруппы аминокислоты лизина протеина эритропоэтина, представленного формулой P-[NH₂]_n, с бифункциональным реагентом, представленным формулой Z-CO-X-S-Q, с получением промежуточного продукта, имеющего амидную связь, представленного формулой:

где Р обозначает протеин эритропоэтин, не содержащий аминогрупы, образующей амидную связь; n обозначает целое число от 1 до 3; Z обозначает реакционно-способную группу, например, NHS-эфир карбоновой кислоты; Х обозначает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k обозначает число от 1 до примерно 10; и Q обозначает защитную группу типа алканоила, например, ацетил;

(б) ковалентного взаимодействия промежуточного продукта, имеющего амидную связь, полученного на стадии (а), с активированным полиэтиленгликольным производным, представленным формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR, с получением содержащего гликопротеин эритропоэтин продукта, представленного формулой:

где W обозначает сульфгидрильную реакционно-способную форму Y; m обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900; R обозначает (низш.)алкил; и Y имеет указанные выше значения.

Согласно этому варианту бифункциональный реагент предпочтительно представляет собой N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат, Z предпочтительно обозначает N-гидроксисукцинимид, а активированное полиэтиленгликольное производное W-[OCH₂CH₂]_m-OR предпочтительно выбирают из группы, включающей йодацетилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфон и метокси-ПЭГ-малеимид.

Более конкретно, протеины эритропоэтины формулы (III) можно получать путем ковалентного связывания тиольных групп с ЕРО («активация») и сочетания образовавшегося активированного ЕРО с поли(этиленгликольным) (ПЭГ) производным. Первая стадия получения пэгилированного ЕРО по настоящему изобретению предусматривает ковалентное связывание тиольных групп с NH₂-группами ЕРО. Такую активацию ЕРО осуществляют с помощью бифункциональных реагентов, которые несут защищенную тиольную группу и дополнительную реакционно-способную группу, выбранную из ряда, включающего обладающие активностью сложные эфиры (например, сукцинимидиловый сложный эфир), ангидриды, эфиры сульфоновых кислот, галогениды карбоновых кислот и сульфоновых кислот соответственно. Тиольную группу защищают с помощью известных в данной области групп, например, ацетильной группы. Такие бифункциональные реагенты обладают способностью взаимодействовать с ξ-аминогруппами аминокислоты лизина путем образования амидной связи. Первая стадия реакции представлена ниже:

ЕРО, n и Х имеют указанные выше значения, a Z обозначает реакционно-способную группу, известную в данной области, например, N-гидроксисукцинимидный (NHS) заместитель формулы

В предпочтительном варианте осуществления активацию ε-аминогрупп лизина осуществляют путем взаимодействия с бифункциональными реагентами, содержащими сукцинимидильный фрагмент. Бифункциональные реагенты могут нести различные типы спейсеров, например, -(CH₂)_k- или -CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_k- фрагменты, где k имеет значение от 1 до приблизительно 10, предпочтительно от 1 до приблизительно 4, более предпочтительно 1 или 2, и наиболее предпочтительно 1. Примерами таких реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (SATP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA)

где k имеет указанные выше значения.

Методы получения бифункциональных реагентов известны в данной области. Предшественники NHS-эфиров 2-(ацетилтио)(этокси)_kуксусной кислоты описаны в DE-3924705, а метод дериватизации с получением соединения, содержащего ацетилтиогруппу, описан у J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 375-376, 1977. SATA имеется в продаже (фирма Molecular Probes, Эуген, штат Орегон, США и фирма Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс).

В молекулу ЕРО можно вводить необходимое количество тиольных групп путем регулирования параметров реакции, т.е. концентрации протеина (ЕРО) и соотношения протеин/бифункциональный реагент. Предпочтительно ЕРО активируют путем ковалентного связывания 1-5 тиольных групп с одной молекулой ЕРО, более предпочтительно от 1,5 до 3 тиольных групп с одной молекулой ЕРО. Указанные диапазоны характеризуют статистическое распределение тиольных групп в популяции протеина ЕРО.

Реакцию проводят, например, в водном буферном растворе, рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный реагент можно добавлять в ДМСО. После проведения реакции приблизительно в течение 30 мин реакцию прекращают путем добавления лизина. Избыток бифункционального реагента можно удалять методами, известными в данной области, например, диализом или фильтрацией на колонках. Среднее количество тиольных групп, присоединенных к ЕРО, можно определять фотометрическими методами, описанными, например, у D.R.Grasetti и J.F.Murray в J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967).

После проведения описанной выше реакции осуществляют ковалентное связывание активированного поли(этиленгликольного) (ПЭГ) производного. Пригодными ПЭГ-производными являются активированные молекулы ПЭГ, имеющие среднюю молекулярную массу от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа, более предпочтительно от приблизительно 24 до приблизительно 35 кДа, и наиболее предпочтительно приблизительно 30 кДа.

Активированные ПЭГ-производные известны в данной области, например, у М.Morpurgo и др., J. Bioconj. Chem. 7, стр.363 и далее (1996) описан ПЭГ-винилсульфон. Для получения соединений формулы 1 можно применять виды ПЭГ с линейной и разветвленной цепью. Примерами реакционно-способных ПЭГ-реагентов являются йодацетилметокси-ПЭГ и метокси-ПЭГ-винилсульфон:

или

Применение таких активированных йодом субстанций известно в данной области и описано, например, у G.T.Hermanson в Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, стр.147-148 (1996).

Наиболее предпочтительно различные твиды ПЭГ активируют с помощью малеимида, используя (алкокси-ПЭГ-малеимид), такой как метокси-ПЭГ-малеимид (ММ 30000; фирма Shearwater Polymers, Inc.). Алкокси-ПЭГ-малеимид имеет следующую структуру:

или

где R и m имеют указанные выше значения, предпочтительно

Реакция сочетания с алкокси-ПЭГ-малеимидом происходит после удаления in situ тиольной защитной группы в водном буферном растворе, например, в содержащем 10 мМ фосфат калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2. Удаление защитной группы можно осуществлять, например, путем обработки гидроксиламином в ДМСО при 25°С, рН 6,2, в течение приблизительно 90 мин. Для модификации ПЭГ молярное соотношение активированный ЕРО/алкокси-ПЭГ-малеимид должно составлять от приблизительно 1:3 до приблизительно 1:6, предпочтительно 1:4. Реакцию можно прекращать путем добавления цистеина и взаимодействия оставшихся тиольных (-SH) групп с N-метилмалеимидом или другими приемлемыми соединениями, способными образовывать дисульфидные связи. Вследствие взаимодействия каких-либо оставшихся активных тиольных групп с защитной группой, такой как N-метилмалеимид, или соответствующей другой защитной группой, гликопротеины ЕРО в конъюгатах по настоящему изобретению могут содержать такие защитные группы. Как правило, описанный процесс приводит к получению смеси молекул, имеющих различное количество тиольных групп, защищенных различным количеством защитных групп, что зависит от количества активированных тиольных групп, которые не конъюгированы с ПЭГ-малеимидом.

В то время как N-метилмалеимид при его использовании для того, чтобы блокировать оставшиеся тиольные группы пэгилированного протеина, образует ковалентную связь такого же типа, дисульфидные соединения должны приводить в результате внутримолекулярной реакции обмена сульфид/дисульфид к связыванию дисульфидным мостиком блокирующего реагента. Предпочтительными блокирующими реагентами для такого типа реакции блокирования являются окисленный глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. В то время как цистеин не вносит дополнительный чистый заряд в пегилированный протеин, использование блокирующих реагентов GSSG или цистамина приводит к появлению дополнительного отрицательного или положительного заряда.

Дополнительную очистку соединений формулы (III), включая разделение моно-, ди- и трипэгилированных типов ЕРО, можно осуществлять методами, хорошо известными в данной области, например, хроматографией на колонках.

Композицию, включающую пэгилированные производные эритропоэтина, предпочтительно содержащую по меньшей мере 90% моноПЭГ-конъюгатов, т.е. в которых n равно 1, можно получать согласно методу, описанному в примере 5. Как правило, предпочтительными являются моноПЭГ-конъюгаты гликопротеина эритропоэтина, поскольку они характеризуются более высокой активностью, чем диПЭГ-конъюгаты. Процентное содержание моноПЭГ-конъюгатов, а также соотношение моно- и диПЭГ-видов можно регулировать путем объединения фракций, либо располагающихся в более широком диапазоне вокруг пика элюирования с целью уменьшения процентного содержания моноПЭГ, либо в более узком диапазоне с целью увеличения процентного содержания моноПЭГ в композиции. Удовлетворительное соотношение выхода и активности достигается в том случае, если присутствует приблизительно 90% моноПЭГ-конъюгатов. В определенных случаях может оказаться целесообразным применять композиции, в которых, например, по меньшей мере 92% или по меньшей мере 96% конъюгатов относятся к моноПЭГ-виду (n равно 1). Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет от 90% до 96%.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать от 10 до 10000 мкг указанного выше протеина эритропоэтина на мл. Предпочтительно композиции содержат от 10 до 1000 мкг, например, 10, 50, 100, 400, 800 или 2500 м к г/мл.

Кроме того, композиции по настоящему изобретению могут содержать от 10 до 10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 10-200 ммолей/л сульфата, 10-50 ммолей/л фосфата, рН 6,0-6,5. Указанная композиция может содержать также до 20 мМ метионина, 1-5% (мас./об.) полиола, до 0,1% (мас./об.) плуроника F68 и необязательно до 1 мМ CaCl₂. Примером такой композиции является композиция, содержащая 10-10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 40 ммолей/л сульфата, 10 ммолей/л фосфата, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, рН 6,2.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения композиция может содержать 10-10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 10-100 молей/л NaCl, 10-50 ммолей/л фосфата, рН 6,0-7,0, необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Кроме того, такая композиция может содержать до 20 мМ метионина, до 0,1% (мас./об.) плуроника F68 и необязательно 7,5 мкмоля/л CaCl₂. Согласно одному из вариантов осуществления такая композиция может содержать 10-10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 100 молей/л NaCl, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68 и 10 ммолей/л фосфата, рН 7,0.

Настоящее изобретение относится также к указанной выше композиции, содержащей 10-10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 10-50 ммолей/л аргинина, рН 6-6,5, 10-100 ммолей/л сульфата натрия. Кроме того, указанная композиция может содержать до 20 мМ метионина, до 0,1% (мас./об.) плуроника F68, необязательно до 1 мкмоля/л CaCl₂ и необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Согласно одному из вариантов осуществления указанная композиция может содержать 10-10000 мкг протеина эритропоэтина на мл, 40 ммолей/л аргинина, рН 6,2, 30 ммолей/л сульфата натрия, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, необязательно 1 мкмоля/л CaCl₂.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения композиции содержат 10-10000 мкг/мл эритропоэтина, предпочтительно 25-2500 мкг/мл эритропоэтина, и

а) 10 мМ фосфат натрия/калия, 100 мМ NaCl, рН 7,0 или

б) 10 мМ фосфат натрия, 120 мМ сульфат натрия, рН 6,2 или

в) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, рН 6,2 или

г) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, рН 6,2 или

д) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, рН 6,2 или

е) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, рН 6,2.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления композиции содержат 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг/мл протеина эритропоэтина. Наиболее предпочтительные композиции содержат либо 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, рН 6,2, либо 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, 10 мМ метионин, 0,01% (мас./об.) плуроника F68, рН 6,2.

Композиции по настоящему изобретению могут находиться в форме высушенного распылением порошка.

Кроме того, изобретение относится к композиции, представляющей собой лиофилизат или высушенный распылением порошок, имеющий указанный выше состав. Композиции можно восстанавливать, получая жидкий раствор путем добавления растворителя, например воды, или их можно применять непосредственно, например, с помощью устройства для ингаляции или устройства для трансдермального введения.

Изобретение относится также к способу получения описанной выше композиции, предусматривающему смешение протеина эритропоэтина с раствором, содержащим несущий много отрицательных зарядов анион и необязательно один или несколько указанных выше фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Кроме того, настоящее изобретение относится также к применению указанной выше композиции для приготовления лекарственных средств, которые можно применять для лечения и предупреждения заболеваний, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и/или для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии. Кроме того, изобретение относится к способу лечения и предупреждения заболеваний, сопровождающихся анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии, предусматривающему стадию введения пациенту описанной выше композиции.

Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к устройствам для местного и системного непрерывного введения лекарственного средства, содержащим указанную выше композицию. Устройство может представлять собой любой тип имплантата, который обеспечивает контролируемое высвобождение эритропоэтина, входящего в описанную выше композицию, например микро- или наночастицы на основе полимера. Описанная выше композиция может также находиться в предварительно заполненном шприце или в любом другом устройстве для введения, таком, например, как безигольное устройство для инъекции или устройство для ингаляции.

Композиция по изобретению может находиться в виде стандартной дозируемой формы, предназначенной для инъекции или внутривенного введения. С другой стороны, композицию по изобретению можно хранить в жидкой или твердой формах и затем делить на стандартные дозируемой формы, предназначенной для инъекции или внутривенного введения. Поэтому жидкая композиция по настоящему изобретению может присутствовать в количестве по меньшей мере 0,3 мл для того, чтобы ее можно было использовать для введения в качестве одной стандартной дозируемой формы. С другой стороны, объем заявленной композиции может достигать 60 л, если ее хранят до распределения в упакованную дозируемую форму. Принимая во внимание ее повышенную стабильность, композицию по изобретению можно хранить в больших контейнерах для того, чтобы позднее помещать в упаковки, пригодные для распределения докторам, пациентам и по клиникам.

Инъецируемый раствор по настоящему изобретению можно вводить с помощью обычных приспособлений для инъекции, таких как шприцы, позволяющие вводить от 0,3 до 20 мл композиции в виде стандартной дозы. С другой стороны, композицию по изобретению можно вводить путем инъекции, используя ампулы, которые содержат композицию либо в виде лиофилизата, либо высушенного распылением порошка, который восстанавливают перед инъекцией обычным методом. Кроме того, благодаря их стабильности, композиции по настоящему изобретению можно фасовать в стандартные дозируемые формы, такие как пузырьки, содержащие от приблизительно 0,3 до приблизительно 10 мл указанной композиции. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно вводить внутривенно с использованием контейнеров для внутривенного введения. Такие контейнеры содержат от приблизительно 20 до приблизительно 500 мл раствора в зависимости от периода времени, в течение которого раствор требуется вводить пациенту. Согласно изобретению жидкий раствор по изобретению можно хранить в предназначенных для хранения контейнерах, из которых его затем можно фасовать в небольшие упаковки для дозируемых форм, предназначенные для распределения докторам, пациентам и по клиникам. Благодаря стабильности композиций по изобретению эти композиции можно хранить в таких контейнерах в течение продолжительных периодов времени до введения.

Получение эритропоэтина в качестве ингредиента описанных выше композиций или в качестве исходного продукта для получения описанных выше производных эритропоэтина подробно описано, например, в патентах US 5547933 и 5621080, ЕР-В 0148605, у S.L.Huang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712 (1984), в ЕР-В 0205564, ЕР-В 0209539 и ЕР-В 0411678, а также у Р.Н.Lai и др., J. Biol. Chem. 261, 3116-3121 (1986), у Н.Sasaki и др., J. Biol. Chem. 262, 12059-12076 (1987). Для терапевтических целей эритропоэтин можно получать рекомбинантными методами (см. ЕР-В 0148605. ЕР-В 0209539 и J.C.Egrie, T.W.Strickland, J.Lane и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)).

Методы экспрессии и получения эритропоэтина в бессывороточной среде описаны, например, в WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996, и в европейском патенте No. 513738 на имя Koch, опубликованном 12 июня 1992. Помимо методов, описанных в указанных выше публикациях, известно, что можно осуществлять ферментацию в бессывороточной среде рекомбинантных клеток СНО, которые содержат ген ЕРО. Такие методы описаны, например, в ЕР-А 0513738, ЕР-А 0267678 и в общей форме у Т.Kawamoto и др., Analytical Biochem. 130, 445-453 (1983), в ЕР-А 0248656, у J.Kowar и F.Franek, Methods in Enzymology 421, 277-292 (1986), В.Bavister, Expcology 271, 45-51 (1981), в ЕР-А 0481791, ЕР-А 0307247, ЕР-А 0343635, WO 88/00967.

В ЕР-А 0267678 описана очистка ЕРО, полученного в бессывороточной культуре после диализа, которую осуществляют с помощью ионообменной хроматографии на S-сефарозе, препаративной ЖХВР с обращенной фазой на C₈-колонке и гель-фильтрации. В этом случае стадию гель-фильтрации можно заменить ионообменной хроматографией на S-сефарозе с большой скооростью потока. Предложено также перед проведением ионообменной хроматографии осуществлять хроматографию с использованием на колонке, заполненной Blue Trisacryl.

Метод очистки рекомбинантного ЕРО описан у I. Nobuo и др., J. Biochem. 107, 352-359 (1990). Однако согласно этому методу перед стадиями очистки ЕРО обрабатывают раствором Tween^® 20, фенилметилсульфонилфторидом, этилмалеимидом, пепстатином А, сульфатом меди и оксаминовой кислотой. В ряде публикаций, в том числе в заявке WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996, описан метод получения эритропоэтина путем ферментации в бессывороточной среде (EPOsf).

Удельную активность ЕРО или конъюгатов ЕРО по настоящему изобретению можно определять различными известными в данной области методами. Биологическая активность очищенных протеинов ЕРО по настоящему изобретению проявляется в том, что введение путем инъекции протеина ЕРО больным людям приводит к тому, что клетки их костного мозга усиливают производство ретикулоцитов и эритроцитов по сравнению с группами пациентов, которых не подвергали инъекции, или с контрольными группами пациентов. Биологическую активность протеинов ЕРО или их фрагментов, полученных и очищенных согласно настоящему изобретению, можно тестировать методами, описанными у Annable и др., Bull. Wid. Hith. Org., 47: 99-112 (1972) и Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Другой метод биологического анализа, предназначенный для оценки активности протеина ЕРО с использованием нормоцитарных мышей, описан в примере 6.

Изобретение более подробно поясняется с помощью приведенных ниже примеров, которые служат для иллюстрации изобретения, но не направлены на ограничение его объема.

Примеры

Пример 1: Ферментация и очистка человеческого ЕРО

а) Получение инокулята и ферментация

Из газовой фазы контейнера для хранения, охлаждаемого жидким азотом, берут один пузырек, содержащий клетки рабочего банка, происходящие из продуцирующей ЕРО линии клеток СНО (для этой цели можно использовать линию клеток АТСС CRL8695, описанную в ЕР 411678 (Genetics Institute)). Клетки переносят во вращающиеся стеклянные колбы и культивируют в забуференной бикарбонатом среде в термостате в увлажненной атмосфере, содержащей СО₂. Типичные бессывороточные среды, которые можно использовать для получения инокулята и ферментации, описаны в заявке на европейский патент 513738 на имя Koch, опубликованной 12 июня 1992, или в заявке WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996, например, они включают среду DMEM/F12 (например, поставляемую фирмой JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Денвер, США, номер для заказа 57-736), и дополнительно содержат бикарбонат натрия, L-глутамин, D-глюкозу, рекомбинантный инсулин, селенит натрия, диаминобутан, гидрокортизон, сульфат железа(II), аспарагин, аспартамовую кислоту, серин и стабилизатор для клеток млекопитающего, такой, например, как поливиниловый спирт, метилцеллюлозу, полидекстран, поли(этиленгликоль), плуроник F68, расширитель плазмы полигелин (HEMACCEL^®) или поливинилпирролидон (WO 96/35718).

Культуры проверяют под микроскопом в отношении отсутствия загрязняющих микроорганизмов и определяют плотность клеток. Эти анализы проводят на каждой стадии деления.

После стадии начального роста клеточную культуру разбавляют свежей средой до исходной плотности клеток и начинают новый цикл роста. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока объем культуры не составит приблизительно 2 л в каждой вращающейся стеклянной колбе. После приблизительно 12 удвоений можно получить 1-5 л такой культуры, которую затем используют в качестве инокулята для ферментера объемом 10 л, служащего для получения большей партии инокулята.

Через 3-5 дней культуру, выращенную в ферментере объемом 10 л, можно использовать в качестве инокулята для ферментера объемом 100 л, служащего для получения большей партии инокулята.

Еще через 3-5 дней культуру, выращенную в ферментере объемом 100 л, можно использовать в качестве инокулята для ферментера объемом 1000 л, служащего для получения продукта.

б) Сбор и отделение клеток

Используют периодический процесс с подпиткой, это означает, что когда достигается требуемая плотность клеток, то собирают приблизительно 80% культуры. Оставшуюся культуру дополняют свежей средой и культивируют до следующего сбора. Один цикл получения продукции включает максимум 10 последовательных сборов: 9 частичных сборов и 1 полный сбор по окончании ферментации. Сбор осуществляют каждые 3-4 дня.

Определенный собранный объем переносят в охлаждаемый сосуд. Клетки отделяют центрифугированием или фильтрацией и удаляют. Содержащий ЕРО супернатант, получаемый на стадии центрифугирования, сразу же подвергают фильтрации и собирают во второй охлаждаемый сосуд. В процессе очистки каждую собранную партию обрабатывают отдельно.

Типичный процесс очистки протеина ЕРО описан в заявке WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996. Процесс очистки заключается в следующем.

а) Хроматография с использованием голубой сефарозы (Blue Sepharose)

Blue Sepharose (фирма Pharmacia) состоит из гранул сефарозы, с поверхностью которых ковалентно связан краситель Cibacron голубой. Поскольку ЕРО более сильно связывается с Blue Sepharose, чем большинство небелковых загрязнителей, некоторые белковые загрязнители и ПВА, то содержание ЕРО может быть повышено на этой стадии. Элюирование заполненной Blue Sepharose колонки осуществляют, повышая концентрацию соли, а также значение рН.

Колонку заполняют 80-100 л Blue Sepharose, регенерируют с помощью NaOH и уравновешивают уравновешивающим буфером (хлорид натрия/кальция и ацетат натрия). Загружают полученный из ферментера подкисленный и профильтрованный супернатант. После окончания загрузки колонку промывают сначала буфером, аналогичным уравновешивающему буферу, который содержит более высокую концентрацию хлорида натрия, а затем трис-буфером. Продукт элюируют трис-буфером и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

б) Хроматография с использованием Butyl Toyopearl

Butyl Toyopearl 650 С (фирма Toso Haas) представляет собой матрикс, основой которого является полистирол, с которым ковалентно связаны алифатические бутильные фрагменты. Поскольку ЕРО более сильно связывается с этим гелем, чем большинство загрязнителей и ПВА, то его можно элюировать с помощью содержащего изопропанол буфера.

Колонку заполняют 30-40 л Butyl Toyopearl 650 С, регенерируют с помощью NaOH, промывают трис-буфером и уравновешивают с помощью содержащего изопропанол трис-буфера.

Концентрацию изопропанола в элюате, полученном с помощью хроматографии с использованием Blue Sepharose, доводят до концентрации изопропанола в уравновешивающем буфере и загружают в колонку. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером с повышенной концентрацией изопропанола. Продукт элюируют буфером для элюирования (трис-буфер с высокой концентрацией изопропанола) и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

в) Хроматография с использованием гидроксиапатитного ультрагеля (Hydroxyapatite Ultrogel)

Hydroxyapatite Ultrogel (фирма Biosepra) состоит из гидроксиапатита, включенного в агарозный матрикс с целью улучшения механических свойств. ЕРО обладает низкой аффинностью по отношению к гидроксиапатиту и вследствие этого может элюироваться более низкими концентрациями фосфата, чем белковые загрязнители.

Колонку заполняют 30-40 л Hydroxyapatite Ultrogel и регенерируют буфером, содержащим фосфат калия/хлорид кальция и NaOH, а затем трис-буфером. Затем ее уравновешивают трис-буфером с низким содержанием изопропанола и хлорида натрия.

В колонку загружают элюат, полученный с помощью хроматографии с использованием Butyl Toyopearl. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером и трис-буфером без изопропанола и хлорида натрия. Продукт элюируют трис-буфером с низким содержанием фосфата калия и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

г) ЖХВР с обращенной фазой на материале Vydac C4

Материал для ЖХВР-ОФ Vydac C4 (фирма Vydac) состоит из частиц силикагеля, на поверхности которых находятся С4алкильные цепи. Отделение ЕРО от белковых загрязнителей основано на различиях в силе их гидрофобных взаимодействий. Элюирование осуществляют в градиенте ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте.

Препаративную ЖХВР проводят с использованием колонки из нержавеющей стали (заполненной 2,8-3,2 л силикагеля Vydac C4). Элюат, полученный с помощью Hydroxyapatite Ultrogel хроматографии, подкисляют, добавляя трифторуксусную кислоту, и загружают в колонку, заполненную Vydac C4. Для промывки и элюирования используют градиент ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте. Фракции собирают и немедленно нейтрализуют фосфатным буфером. Объединяют содержащие ЕРО фракции, которые соответствуют требованиям IPC (контроль производственного процесса).

д) Хроматография с использованием DEAE-Sepharose

Материал DEAE-Sepharose (фирма Pharmacia) состоит из диэтиламиноэтильных (DEAE) групп, ковалентно связанных с поверхностью гранул сефарозы. Связывание ЕРО с DEAE-группами опосредуется ионными взаимодействиями. Ацетонитрил и трифторуксусную кислоту пропускают через колонку без задержки. После того как эти вещества отмывают, следовые количества загрязнителей удаляют, промывая колонку ацетатным буфером с низким значением рН. Затем колонку промывают нейтральным фосфатным буфером и ЕРО элюируют буфером с повышенной ионной силой.

Колонку заполняют DEAE-Sepharose, предназначенной для хроматографии с высокой скоростью потока. Объем колонки регулируют таким образом, чтобы гарантировать загрузку ЕРО из расчета 3-10 мг ЕРО/мл геля. Колонку промывают водой и уравновешивающим буфером (фосфат натрия/калия), Загружают объединенные фракции, полученные после элюирования с использованием ЖХВР, и колонку промывают уравновешивающим буфером. После этого колонку промывают промывочным буфером (натрий-ацетатный буфер), а затем промывают уравновешивающим буфером. После этого ЕРО элюируют из колонки с помощью элюирующего буфера (хлорид натрия, фосфат натрия/калия) и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

Элюат, полученный из колонки, заполненной DEAE-Sepharose, доводят до определенной проводимости. Полученную субстанцию для приготовления лекарственного средства фильтруют в стерильных условиях в сосуды из тефлона (Teflon) и хранят при -70°С.

Пример 2: Пэгилирование ЕРО с помощью мПЭГ-СМК

ЕРО, очищенный согласно описанному в примере 1 методу в бессывороточной среде (EPOsf), является гомогенным по данным оценки с помощью аналитических методов и имеет типичную схему изоформ, состоящую из 8 изоформ. Он имеет удельную биологическую активность 190000 МЕ/мг, как установлено в опыте с использованием нормоцитарных мышей. Применяемый пэгилирующий реагент представляет собой метокси-ПЭГ-СМК, т.е. соединение формулы II, в котором R обозначает метил; х равно 3; и m обозначает число от 650 до 750 (в среднем примерно 680, что соответствует средней молекулярной массе примерно 30 кДа).

Реакция пэгилирования

К 100 мг EPOsf (9,71 мл маточного раствора ЕРО с концентрацией 10,3 мг/мл, 548 мкмоля) добавляют 10 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 506 мг метокси-ПЭГ-СМК с молекулярной массой 30 кДа (16,5 мкмоля) (полученного от фирмы Shearwater Polymers Inc., Хантсвилл, штат Алабама), и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре (20-23°С). Конечная концентрация протеина составляет 5 мг/мл и соотношение протеин: ПЭГ-реагент составляет 1:3. Через 2 ч реакцию прекращают, доводя значение рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кислоты, и хранят при -20°С до начала очистки.

Очистка

1. Смесь конъюгатов: Примерно 28 мл SP-SEPHAROSE FF (сульфопропильная катионобменная смола) загружают в стеклянную колонку типа AMICON (2,2×7,5 см) и уравновешивают 20 мМ ацетатным буфером, рН 4,5, при скорости потока 150 мл/ч. 6 мл реакционной смеси, содержащей 30 мг протеина, разбавляют в 5 раз уравновешивающим буфером и вносят в колонку. Неадсорбированные продукты отмывают буфером, а адсорбированную смесь ПЭГ-конъюгата элюируют из колонки с помощью 0,175М NaCl в уравновешивающем буфере. Еще оставшийся в колонке немодифицированный EPOsf элюируют 750 мМ NaCl. Колонку повторно уравновешивают исходным буфером. Образцы анализируют с помощью ПААГ-ДСН и определяют степень их пэгилирования. Установлено, что элюат, полученный с помощью 0,175М NaCl, содержит моно-, а также ди- и следовые количества трипэгилированных видов, в то время как элюат, полученный с помощью 750М NaCl, содержит немодифицированный EPOsf. Ди-ПЭГ- и моноПЭГ-EPOsf: Очищенную смесь конъюгатов, элюированную из колонки на предыдущей стадии, разбавляют буфером в 4 раза, повторно вносят в колонку и промывают, как описано выше. Ди-ПЭГ-EPOsf и моноПЭГ-EPOsf элюируют по отдельности с колонки с помощью 0,1М NaCl и 0.175М NaCl соответственно. Проводят элюирование с помощью 750М NaCl для того, чтобы элюировать весь оставшийся немодифицированный EPOsf.

В альтернативном варианте реакционную смесь разбавляют в 5 раз ацетатным буфером и вносят в колонку, заполненную SP-Sepharose (˜0,5 мг протеина/мл геля). Колонку промывают и адсорбированные моноПЭГ-EPOsf, ди-ПЭГ-EPOsf и немодифицированный EPOsf элюируют согласно методу, описанному в предыдущем разделе.

Результаты

ПЭГ-EPOsf синтезируют путем химической конъюгации с линейной молекулой ПЭГ со средней молекулярной массой 30 кДа. ПЭГ-EPOsf получают в результате реакции между первичными аминогруппами EPOsf и производным сукцинимидилового эфира масляной кислоты и ПЭГ с молекулярной массой 30 кДа, приводящей к образованию амидной связи.

Результаты обобщены в таблице 1. Очищенная смесь конъюгатов содержит моно- и ди-ПЭГ-EPOsf и не содержит немодифицированный EPOsf, что установлено с помощью анализа с использованием ПААГ-ДСН. Смесь конъюгатов составляет 23,4 мг или 78% исходного материала. Разделение с помощью катионообменной хроматографии моно- и ди-ПЭГ-EPOsf позволило установить, что, соотношение моно- и ди-ПЭГ в смеси конъюгатов составляет примерно 1:1. После завершения реакции соотношение индивидуальных компонентов моно:ди:немодифицированный EPOsf составляет 40:38:20 (%). Общий выход оказывается практически количественным.

Пример 3: Пэгилирование ЕРО с помощью мПЭГ-СПК

Различные аликвотные количества EPOsf, указанные в примере 2, подвергают взаимодействию с метокси-ПЭГ-СПК с молекулярной массой 30 кДа (фирма Shearwater Polymers Inc., Хантсвилл, штат Алабама). Реакцию проводят при соотношении протеин: реагент 1:2 и используют методы очистки, описанные в примере 2. Получают в основном монопэгилированные виды.

Пример 4: Ковалентное связывание тиольных групп с ЕРО

В этом примере описаны результаты определения реакционных условий для ковалентного связывания тиольных групп с ЕРО. Для определения условий различные количества реагента, содержащего заблокированную тиольную группу, в данном случае SATA или SATP (растворенные в ДМСО до концентрации 10 мг/мл), добавляют к раствору ЕРО, в данном случае к 1 мл раствора ЕРО с концентрацией 5 мг/мл в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, pH 7,3. Реакционную смесь перемешивают в течение примерно 30 мин (25°С) и реакцию прекращают, добавляя 1М раствор лизина до концентрации 1 мМ. Избыточные количества SATA и SATP удаляют путем диализа в противотоке 10 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТК, pH 6,2. Количество ковалентно связанных с ЕРО тиольных групп после удаления с помощью гидроксиламина защитной ацетильной группы определяют фотометрическим путем с использованием дитиодипиридана согласно методу, описанному у Grasetti D.R. и Murray J.E. в: Appl. Biochem. Biotechnol. 119, стр.41-49 (1967).

Ниже в таблице представлены данные о количестве тиольных групп, ковалентно связанных с молекулой ЕРО

Пример 3: Модификация активированного ЕРО с помощью метокси-ПЭГ-малеимида

А) Активация ЕРО:

100 мг ЕРО, полученного согласно примеру 1 (190000 МЕ/мг, определено с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей), активируют SATA (молярное соотношение ЕРО:SATA=1/5) согласно методу, описанному в примере 2. Полученный в результате ЕРО ("активированный ЕРО"), несущий ковалентно связанные заблокированные тиольные группы, отделяют от побочных продуктов типа N-гидроксисукцинимида, или не прореагировавшего SATA, путем диализа, согласно методу, описанному в примере 1. Получают раствор, содержащий 4,5 мг/мл активированного ЕРО в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2.

Б) Пэгилирование активированного ЕРО:

380 мг метокси-ПЭГ-малеимида, имеющего указанное выше "наиболее предпочтительное" строение (ММ 30000; фирма Shearwater Polymers Inc., Ханствилл, штат Алабама, США), растворяют в вышеуказанном растворе, содержащем 95 мг активированного ЕРО (4,5 мг/мл в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2), В результате молярное соотношение активированного ЕРО и метокси-ПЭГ-малеимида в растворе составляет 1:4. Добавляя 1М водный раствор гидроксиламина к описанному выше раствору до достижения концентрации 30 мМ, рН 6,2, осуществляют разблокирование ковалентно связанных заблокированных тиольных групп активированного ЕРО. Образовавшийся активированный ЕРО, находящийся в реакционной смеси в растворе, имеет свободные тиольные (-SH) группы. Сразу после разблокирования тиольных групп осуществляют реакцию сочетания между активированным ЕРО, который теперь уже содержит свободные тиольные (-SH) группы, и метокси-ПЭГ-малеимидом в течение 90 мин (перемешивание, 25°С). Реакцию сочетания прекращают, добавляя к реакционной смеси 0,2М водный раствор цистеина до концентрации 2 мМ. Через 30 мин избыток свободных тиольных групп активированного ЕРО, которые не прореагировали с метокси-ПЭГ-малеимидом, блокируют, добавляя 0,5М раствор N-метилмалеимида в ДМСО до достижения концентрации 5 мМ. Через 30 мин полученную в результате реакционную смесь, уже содержащую пэгилированные виды ЕРО, подвергают диализу в противотоке 10 мМ фосфата калия, рН 7,5 в течение промежутка времени ≥15 ч.

В) Очистка пэгилированных видов ЕРО

Для выделения пэгилированных видов ЕРО из реакционной смеси осуществляют следующий процесс очистки: 50 мл Q-Sepharose ff (c высокой скоростью потока)-колонку уравновешивают 10 мМ фосфатом калия, рН 7,5. Полученную на стадии Б) реакционную смесь загружают в колонку (скорость потока: 3 объема колонки (ОК)/ч). Для отделения непрореагировавшего метокси-ПЭГ-малеимида колонку промывают 5 OK 10 мМ фосфата калия, рН 7,5. Пэгилированные виды ЕРО отделяют элюированием при повышающемся солевом градиенте в 5 OK буфера А (10 мМ фосфат калия, рН 7,5) и 5 OK буфера Б (10 мМ фосфат калия, 500 мМ NaCl, рН 7,5) со скоростью потока 3 ОК/ч. Благодаря наличию градиента NaCl сначала элюируются пэгилированные виды ЕРО (три-, ди- и монопэгилированные виды ЕРО), а затем непэгилированные виды ЕРО. Фракцию элюата, содержащую пэгилированные виды ЕРО (три-, ди- и монопэгилированные виды ЕРО), объединяют и фильтруют (фильтрация в стерильных условиях с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм).

Содержание и чистоту три-, ди- и монопэгилированных видов ЕРО оценивают на ПААГ-ДСН-гелях с окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970)), а концентрацию протеина определяют при 280 нм согласно закону Бира-Ламберта. Кажущаяся молекулярная масса видов ЕРО, определенная с помощью ПААГ-ДСН-электрофореза, составляет примерно 68 кДа (монопэгилированные виды ЕРО), примерно 98 кДа (дипэгилированные виды ЕРО) и примерно 128 кДа (три-ПЭГилированные виды ЕРО).

Дополнительное разделение три-, ди- и монопэгилированных видов ЕРО можно осуществлять с помощью хроматографии, например гель-фильтрации (Superdex, pg 200; фирма Pharmacia).

Определение биологической активности in vivo элюата, содержащего три-, ди- и монопэгилированные виды, осуществляют согласно описанному ниже методу.

Пример 6: Активность in vivo пэгилированного ЕРО, определенная с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей

Биологический анализ с использованием нормоцитарных мышей известен в данной области (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997(2)), этот метод описан в монографии по эритропоэтину Ph. Eur. BRP. Образцы разбавляют БСА-ЗФР. Нормальным здоровым мышам возрастом 7-15 недель вводят подкожно 0,2 мл фракции ЕРО, содержащей непэгилированный ЕРО или три-, ди- или монопэгилированный ЕРО, полученный согласно методу, описанному в примере 2 или 3. В течение 6 дней отбирают образцы крови путем пункции хвостовой вены и разбавляют таким образом, чтобы в 1 мл раствора, окрашенного 0,15 мкМ акридином оранжевым присутствовал 1 мкл крови. Время окрашивания составляет 3-10 мин. Количество ретикулоцитов определяют микрофлуорометрически с использованием проточного цитометра, анализируя гистограмму красной флуоресценции. Количество ретикулоцитов дано в виде абсолютных величин (на 30000 проанализированных клеток крови). Представлены данные, полученные в один день для групп, каждая из которых состоит из 5 мышей, причем у мышей берут кровь только один раз.

В другой серии экспериментов мышам вводят однократную дозу немодицированного ЕРО (25 нг ЕРО), смеси ПЭГ(СМК)-ЕРО, полученной в примере 2 (10 нг конъюгата), моно- и дипэгилированных ЕРО, полученных в примере 2 (10 нг конъюгата), ПЭГ(СПК)-ЕРО, полученных в примере 3 (10 нг конъюгата) и буферного раствора. Результаты приведены в таблице 2. Результаты свидетельствуют о более высокой активности и пролонгированном времени полужизни пэгилированных видов ЕРО, о чем свидетельствует существенное увеличение количества ретикулоцитов и сдвиг максимального количества ретикулоцитов при использовании одной и той же дозы/мышь (10 нг) по сравнению с дозой 25 нг немодифицированного ЕРО.

Пример 7: Получение продукта, представляющего собой в основном моноПЭГ-ЕРО

Реакция пэгилирования

В качестве исходного продукта используют 100 мг (5,48 мкмоля) EPOsf в 100 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, полученного согласно примеру 1, к нему добавляют 329 мг (10,96 мкмоля) реагента 30 кДа ПЭГ-СМК, растворенного в 3 мл 1 мМ HCl. Добавляют еще 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, доводя объем реакционной смеси до 20 мл. Конечная концентрация протеина составляет 5 мг/мл и соотношение протеин:ПЭГ составляет 1:2. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре окружающей среды (20-22°С). Через 2 ч реакцию прекращают, доводя значение рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кислоты, и хранят при -20°С до начала очистки.

Очистка

Полученную на предыдущей стадии реакционную смесь разбавляют в соотношении 1:5 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,5, и вносят в 300 мл SP-Sepharose FF (сульфопропильная катионобменная смола), загруженной в колонку размером 4,2×19 см. Колонку предварительно уравновешивают таким же буфером. Выходящие из колонки продукты исследуют при длине волны 280 нм с помощью УФ-монитора типа Gilson и данные регистрируют с помощью записывающего устройства фирмы Kipp и Zonen. Колонку промывают 300 мл или объемом, равным объему 1 слоя уравновешивающего буфера с целью удаления избытка реагентов, побочных продуктов реакции и олигомерного ПЭГ-ЕРО. Затем осуществляют промывку 100 мМ NaCl, используя объем, равный объему 2 слоев, с целью удаления ди-ПЭГ-ЕРО. Затем элюируют моноПЭГ-ЕРО с помощью 200 мМ NaCl. Во время процесса элюирования моноПЭГ-ЕРО первые 50 мл пика протеина удаляют и моноПЭГ-ЕРО собирают в виде фракции объемом 150 мл. Немодифицированный EPOsf, оставшийся на колонке, элюируют 750 мМ NaCl. Все элюирующие буферы готовят в уравновешивающем буфере. Все элюированные образцы анализируют с помощью ПААГ-ДСН и с помощью гель-фильтрации высокого разрешения (SEC). Пул моноПЭГ-ЕРО, полученный из фракции объемом 150 мл, который не имеет обнаруживаемых количеств немодифицированного EPOsf, затем концентрируют до получения концентрации ˜4,5-7,5 мг/мл и подвергают фильтрации путем диализа (диафильтрация) в противотоке буфера для хранения, представляющего собой 10 мМ фосфат калия, 100 мМ NaCl, рН 7,5. Концентрацию/диафильтрацию проводят при температуре окружающей среды, используя систему Millipore Labscale™ TFF System, снабженную мембраной типа Millipore Pellicon XL Biomax 50, пропускающей продукты с максимальной молекулярной массой 50 кДа. Концентрированный моноПЭГ-ЕРО стерилизуют фильтрацией и хранят в замороженном состоянии при -20°С.

Пэгилируется примерно 75% EPOsf. После очистки общий выход моноПЭГ-ЕРО, не содержащего обнаруживаемых количеств немодифицированного EPOsf, составляет ˜30%, выход диПЭГ-ЕРО составляет примерно 25%. Остальная часть протеина представляет собой олигомеры и непэгилированные EPOsf. Пул моноПЭГ-ЕРО, полученный из фракции объемом 150 мл, содержит примерно 90% моноПЭГ-ЕРО и примерно 10% диПЭГ-ЕРО.

Пример 8: Термостабильность ЕРО и пэгилированного ЕРО в различных композициях: анализ с помощью ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия)

Широко известно, что температура фазового перехода при тепловой денатурации, измеряемая методом дифференциальной сканирующей калориметрии, является важным показателем термостабильности протеинов. Растворы эритропоэтина или пэгилированного эритропоэтина с концентрацией от 0,6 до 1,2 мг/мл в различных буферах в присутствии стабилизаторов и без них анализируют с помощью калориметра типа Nano-DSC (фирма Calorimetric Sciences Corporation, штат Юта, США) при скорости нагрева 2 К/мин. Увеличение температуры фазового перехода свидетельствует о повышении термостабильности протеина. Измеренные значения температур не следует понимать как абсолютные значения, они скорее характеризуют различия между стабильностями отдельных композиций.

Для определения оптимального значения рН композиции изучают зависимость тепловой денатурации пэгилированного эритропоэтина от величины рН в диапазоне от 4 до 9. Образцы протеина анализируют в 30 мМ Na₂HPO₄, 30 мМ цитрате натрия, 30 мМ борате. На фиг.3 видно, что максимальная температура фазового перехода выходит на плато в диапазоне значений рН от приблизительно 6 до приблизительно 9 и резко снижается при значениях рН менее 5,5. Это свидетельствует о том, что оптимальное значение рН для обеспечения максимальной термостабильности превышает 5,5 (фиг.3).

Для исследования влияния ионной силы определяют зависимость тепловой денатурации от концентрации фосфата. Данные, приведенные на фиг.4, свидетельствуют о том, что термостабильность возрастает при увеличении ионной силы композиции.

Влияние буферной субстанции также исследуют с помощью ДСК. Данные, приведенные на фиг.5, свидетельствуют о том, что наиболее приемлемыми буферами или добавками для обеспечения высокой термостабильности являются сульфат, цитрат или фосфат. Глицин, который применяют в качестве буфера в используемых в настоящее время композициях (см. выше), не является оптимальным для этой цели.

Данные, приведенные на фиг.6, свидетельствуют о том, что сульфат является приемлемым буфером/добавкой также и при низких значениях рН (например, при рН 6,2), в то время как фосфат при рН 6,2 менее эффективен, чем при рН 7,5. Это свидетельствует о том, что сульфат позволяет поддерживать термостабильность на высоком уровне даже при низких значениях рН. Это открытие позволяет создавать композицию, имеющую значение рН от 6,0 до 6,5, у которой не происходит значительных потерь термостабильности эритропоэтина.

Пример 9: Агрегация ЕРО и ПЭГ-ЕРО в условиях теплового стресса: анализ с помощью ПААГ-ДСН (гель-электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия)

Для исследования воздействия теплового стресса на протеин эритропоэтин образцы различных композиций подвергают тепловому стрессу (20 мин при 80°С) и анализируют с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) в восстанавливающих (в образце буфера присутствует ДТТ) и в невосстанавливающих (в образце буфера отсутствует ДТТ) условиях. Такой метод позволяет выявлять образование ковалентно связанных агрегатов. Как указывалось выше, образование агрегатов является одним из основных причин разложения протеинов, и поэтому необходимо, чтобы оно не имело места в фармацевтических композициях протеинов. С большой долей вероятности можно считать, что агрегаты, которые можно обнаружить в отсутствии восстановителя (например, ДТТ) и которые нельзя обнаружить в присутствии восстановителя, возникают в условиях стресса за счет образования неправильных дисульфидных связей в результате окислительной реакции. На фиг.5 представлена зависимость степени агрегации от значения рН в условиях теплового стресса. Результаты этого эксперимента ясно свидетельствуют о том, что образование агрегатов снижается при значениях рН ниже 6,5. Чем выше значение рН, тем больше количество агрегатов. Большинство образующихся агрегатов можно восстановить путем обработки образцов восстановителем при осуществлении ПААГ-ДСН, что позволяет предположить, что большая часть агрегатов, образующихся в условиях теплового стресса, представляет собой связанные дисульфидными мостиками димеры, олигомеры и агрегаты более высокого порядка. Взятые в совокупности эти данные свидетельствуют о том, что образование агрегатов в значительной степени можно предотвращать, если значение рН композиции поддерживать на уровне 6,5 или ниже.

Фиг.7: Зависимости агрегации ПЭГ-ЕРО от значения рН. Представлены результаты анализа с помощью ПААГ-ДСН образцов ПЭГ-ЕРО после теплового стресса (описанного выше). Протеины окрашивают серебром. Полоса 1: стандарт молекулярной массы. Полоса 2: рН 5. Полоса 3: рН 5, после восстановления. Полоса 4: рН 6. Полоса 5: рН 6, после восстановления. Полоса 6: рН 6,5. Полоса 7: рН 6,5, после восстановления. Полоса 8: рН 7. Полоса 9: рН 7, после восстановления. Полоса 10: ПЭГ-ЕРО, не подвергавшийся стрессу.

Образование агрегатов можно предупреждать также путем использования антиоксидантов. На фиг.8 продемонстрировано, что применение 1 мг/мл ацетилцистеина в качестве антиоксиданта предупреждает образование агрегатов в условиях теплового стресса. Следовательно, для предупреждения образования агрегатов в условиях теплового стресса можно применять антиоксиданты, такие, например, как ацетилцистеин, при низких значениях рН, например, при рН 6,2.

Фиг.6: Образование агрегатов ПЭГ-ЕРО можно предупреждать, поддерживая значение рН на уровне 6,2 и/или применяя ацетилцистеин. Представлены результаты анализа с помощью ПААГ-ДСН образцов ПЭГ-ЕРО после теплового стресса (описанного выше). Протеины окрашивают серебром. Полоса 1: ПЭГ-ЕРО, не подвергавшийся стрессу. Полоса 2: рН 7,5, после стресса. Полоса 3: рН 6,2, после стресса. Полоса 4: рН 6,2, после стресса, после восстановления. Полоса 5: рН 7,5, 1 мг/мл ацетилцистеина, после стресса. Полоса 6: рН 7,5, 1 мг/мл ацетилцистеина, после стресса, после восстановления.

Пример 10: Стабильность ПЭГ-ЕРО в различных композициях при 4. 25, 30 и 40°С

Пэгилированный ЕРО в различных композициях инкубируют при нескольких температурах. В определенные моменты времени отбирают образцы и оценивают стабильность с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой (ОФ-ЖХВР), гель-фильтрации высокого разрешения (SEC) и электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН). В таблице 3 представлено сравнение стабильности ПЭГ-ЕРО в различных композициях после хранения при указанных температурах. Эти данные ясно свидетельствуют о улучшенных свойствах представленных в настоящем описании композиций с точки зрения восстановления протеина и образования агрегатов.

Пример 11: Оптимальные композиции позволяют предотвращать окисление метионина в положении 54 (метионин54) протеина ЕРО при использовании метионина в качестве антиоксиданта

Различные композиции, в состав которых входит пэгилированный ЕРО, инкубируют при нескольких температурах. Через 6 месяцев отбирают образцы и определяют степень окисления метионина54 согласно описанному ниже методу. В целом метод состоит в следующем. Образцы ЕРО обрабатывают эндопротеиназой LysC. Образовавшиеся пептиды разделяют с помощью хроматографии с обращенной фазой. Рассчитывают соотношение содержания окисленного пептида Т8 (несущего окисленный метионин54) и содержания пептида Т8 (несущего неокисленный метионин54). Данные обобщены в таблице 4.

Представленные данные ясно свидетельствуют о том, что предп очтительная композиция по настоящему изобретению (10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннит, рН 6,2) превосходит в отношении степени окисления метионина54 другие композиции, такие как 10 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, рН 7,0. Добавление в композицию 1 или 10 мМ метионина выражение уменьшает окисление метионина54. Следовательно, метионин действует в качестве антиокислителя и стабилизирует ЕРО.

Пример 12: Содержание сиаловой кислоты в образцах ПЭГ-ЕРО для различных композиций

Для оценки сохранности углеводной структуры гликопротеина ПЭГ-ЕРО проводят с помощью стандартных методов анализ содержания сиаловой кислоты в образцах ПЭГ-ЕРО после хранения в течение 6 месяцев при различных температурах. Полученные данные свидетельствуют о том, что хранение описанных выше новых композиций, содержащих протеин, не оказывает негативного влияния на целостность углеводной структуры (фиг.9).

Пример 13: Биологическая активность пэгилированного ЕРО после хранения в течение продолжительных периодов времени при повышенной температуре

Для подтверждения того, что хранение ПЭГ-ЕРО в составе композиции, содержащей 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, рН 6,2 не оказывает негативного влияния на биологическую активность in vivo, проводят стандартные опыты по исследованию активности ЕРО на мышах (см. пример 6). Для образцов ПЭГ-ЕРО-образцов, которые хранили при указанных на графике температурах в течение 6 месяцев в составе композиции, содержащей 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, рН 6,2, при их хранении при 4, 25 и 30°С не обнаружено потери активности in vivo no сравнению со свежим образцом, применяющимся в качестве стандарта (фиг.10).

Пример 14: Содержание агрегатов ПЭГ-ЕРО после хранения при повышенной температуре в течение 6 месяцев

Для анализа содержания агрегатов в образцах ПЭГ-ЕРО после хранения в течение 6 месяцев при повышенной температуре в составе композиции, содержащей 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% (мас./об.) маннита, рН 6,2, отбирали образцы и проводили анализ с помощью гель-фильтрации.

При 4, 25 и 30°С не обнаружено присутствия агрегатов, что свидетельствует о стабильности пэгилированного ЕРО, входящего в состав описанных выше композиций. На фиг.11 приведено сопоставление хроматограмм, полученных с помощью гель-фильтрации.