Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования биоплёнок, формируемых Vibrio cholerae 01 серогруппы на поверхности хитина

Предполагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при изучении способности штаммов Vibrio cholerae формировать как простые, состоящие из одной монокультуры, так и сложные, включающие несколько микроорганизмов, биопленки на поверхности хитина.

Для возбудителя холеры Vibrio cholerae существуют две основные экологические ниши: организм человека и водные объекты окружающей среды с ее гидробионтами. Особую роль в сохранении холерного вибриона в водных экосистемах играют хитиновые покрытия членистоногих, некоторых диатомовых водорослей и грибов, на поверхности которых вибрион способен существовать в виде биопленки. Хитин - один из наиболее распространенных в природе полисахаридов. Эволюционно хитин для вибрионов служит основным питательным субстратом, а сформированные на его поверхности биопленки служат местом обитания и убежищем от неблагоприятных факторов окружающей среды. Известно, что для человека биопленки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязненной планктоном воды или необработанных морепродуктов (1).

В результате многочисленных исследований установлено, что вибрионы обладают сложным хитинолитическим комплексом обуславливающего утилизацию хитина в качестве источника энергии, углерода и азота (2).

В тоже время способность вибрионов формировать биопленку на поверхности хитина изучена недостаточно. Основная причина заключается в отсутствии простых, недорогих способов для моделирования и изучения всех этапов феномена образования вибрионами биопленки на поверхности хитина.

Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на пластике (3), заключающийся в культивировании бактерий в лунках полистироловых микротитровальных планшет с последующей окраской адгезировавшихся к твердой фазе (полистиролу) и сформировавших биопленку бактерий причем оценку интенсивности сформировавшихся биопленок проводят на фотометре по степени окраски спиртового экстракта красителя в каждой лунке.

Однако этот способ не позволяет объективно оценивать способность микроорганизмов формировать биопленки на биологических субстратах, т.к. в качестве твердой фазы используют синтетический материал (полистирол), сильно отличающийся по своему химическому составу от биологических объектов.

Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы (4), заключающийся в том, что натуральные почечные камни до состояния песка, размещают в пробирки и добавляют по 0,5 мл суспензий нескольких штаммов E. coli, выделенных от больных циститами в концентрации порядка 10⁶ КОЕ/мл, затем песок инкубируют, отмывают, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин и трижды отмывают физиологическим раствором получая биопленки, сорбированные на поверхности песчинок, которые затем окрашивают 0,1% красителя кристалл-виолет.

Недостатком известного способа является его трудоемкость в исполнении и возможность работы только с одной культурой микроорганизма.

Кроме того в естественных условиях возбудителя никогда не встречаются в виде монокультуры, поэтому достоверность такого исследования может вызывать сомнения.

За прототип выбран способ изучения формирования биопленки на поверхности хитина (5), включающий внесение взвеси клеток V. cholerae (10⁶/мл) в солевой среде в лунки культурального планшета, в которые добавляют 2% коммерческого препарата хлопьев хитина (С9213, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), затем планшеты инкубируют трое суток при комнатной температуре и встряхивании при 60 об/мин, учет способности V. cholerae формировать биопленку проводят путем высева или путем окрашивания красителем МТТ (Cell Proliferation Kit I, Roche, Basel, Switzerland) с последующим учетом окраски на фотометре, после этого при необходимости анализа пула тотальной РНК вибрионов проводят удаление планктонной фазы и осуществляют экстракцию РНК с помощью коммерческого набора (RNeasy Protect Bacteria Mini Kit; Qiagen, Hilden, Germany) согласно инструкции.

Недостатками данного способа являются невозможность анализа сложных биопленок (построенных из гомологичных и гетерологичных микроорганизмов), необходимость использования дорогостоящих импортных коммерческих препаратов (хитина, красителя МТТ и реагентов для выделения РНК), сложного аналитического оборудования (фотометра для количественного учета клеток в составе биопленки). Кроме того, неясна возможность получения из полученных таким образом биопленок препаратов ДНК, пригодных для использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР), что в общем снижает достоверность способа и увеличивает его себестоимость.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка достоверного и доступного по цене способа моделирования биопленок, формируемых штаммами V. cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина с последующим изучением методом ПЦР.

Поставленная задача достигается тем, что в способе моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина, включающем использование хитина для формирования биопленки, образуемой клетками V. cholerae, с последующей инкубацией и анализом результатов в ПЦР, в качестве хитина используют пластины речного рака Astacus astacus в количестве 10-15 штук и размером 0,3×0,3 см, которые размещают во флакон емкостью 100 мл, содержащий 30 мл отстоенной речной воды, затем флакон автоклавируют 10 минут при 120°С, а после охлаждения во флакон вносят взвесь культур Vibrio cholerae 01 серогруппы до конечной концентрации 10⁴ м.к./мл, инкубирование проводят в заданные интервалы времени при 10°С и 28°С, анализ результатов образования как простых, так и сложных биопленок V. cholerae проводят в ПЦР с использованием праймеров:

VC1699-1 GCTTAGCTATTTTTGGGTATAGGTT,

VC1699-2 CGTTCATTTTTACTCAAACAGTCA

к INDEL-локусу 1699, при этом атоксигенные штаммы ctx- tcpA- формируют ампликон массой 132 п.о, а токсигенные штаммы ctx+ tcpA+ образуют ампликон массой 116 п.о., подтверждая присутствие клеток токсигенного штамма в составе сложной биопленки и способность колонизировать поверхность хитина.

При этом для проведения ПЦР пластины хитина извлекают из емкости, троекратно промывают физиологическим раствором, удаляют избыток жидкости и переносят в пробирки емкостью 1,5 мл, содержащие 0,5 мл дистиллированной воды, лизис клеток и выделение ДНК осуществляют путем прогревания при 99°С в течение 30 мин, проводят посев на специфическую стерильность, в дальнейшем полученный препарат хранят при 4°С.

Кроме того инкубационная смесь для амплификации объемом 25 мкл содержит:

- 1,5 мМ Mg-буфер,

- 0,2 мМ смеси дНТФ,

- 1,0 мкМ смеси праймеров к INDEL-локусу 1699 (по 0,5 мкМ каждого праймера),

- 25 нг ДНК - матрицы,

- 0,25 ед. ДНК-полимеразы - 1 мкл,

- оставшийся объем - вода.

Причем реакцию амплификации в ПЦР проводят с соблюдением следующих температурных режимов: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 60°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 1 мин (1 цикл).

Технология проведения способа поясняется примерами.

Пример 1. Формирование на хитине и анализ в ПЦР простой биопленки образуемой монокультурой Vibrio cholerae.QX серогруппы штамм 81 ctx+tcpA+.

Способ проводят по этапам:

Первоначально получают препарат хитина для этого панцири широкопалого речного рака Astacus astacus разрезают на фрагменты величиной порядка 0,3×0,3 мм, помещают в количестве 10-15 штук во флакон емкостью 100 мл содержащий 30 мл отстоянной речной воды и автоклавируют 10 минут при 120°С. После охлаждения во флакон вносят взвесь культур V. cholerae O1 81 ctx+tcpA+ до конечной концентрации 10⁴ м.к./мл. Инкубацию проводили при 10°С и 28°С в течение 2 и 4 суток. Культура взята из коллекции Ростовского противочумного института.

Анализ результатов образования биопленок проводят вторым этапом с помощью ПЦР. Предварительно в необходимые интервалы времени пластинки хитина извлекают стерильным пинцетом, троекратно промывают стерильным физиологическим раствором от непрочно связанных клеток, а избыток жидкости удаляют стерильной фильтровальной бумагой. Каждую отдельную пластинку переносят в пробирку емкостью 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды. Затем проводят лизис клеток и выделение путем прогревания при 99°С в течение 30 минут. Далее проводили высев на специфическую стерильность. Полученный препарат хранят при 4°С.

Постановку ПЦР проводят согласно МУ 1.3.2569-09 с использованием праймеров к INDEL-локусу 1699.

Обоснование выбора праймеров

В ходе изучения коллекции из 25 атоксигенных штаммов V. cholerae, изолированных из объектов окружающей среды Российской Федерации в 2016-2017 годах и 10 токсигенных штаммов, изолированных в Российской Федерации начиная с 2000 годов, в составе базы данных INDEL-маркеров (6) авторами идентифицирован INDEL-локус 1699. В ПЦР сконструированы специфические праймеры к локусу 1699, при этом все токсигенные штаммы образовывали ампликон массой 116 п.о., а атоксигенные штаммы формировали ампликон массой 132 п.о. При использовании в ПЦР ДНК из гетерологичных культур амплификат отсутствовал. Таким образом, сконструированные праймеры к INDEL-локусу 1699 позволили идентифицировать с помощью ПЦР атоксигенные и токсигенные штаммы холерного вибриона, циркулирующие на территории Российской Федерации в настоящее время.

Праймеры: VC1699-1 GCTTAGCTATTTTTGGGTATAGGTT

VC1699-2 CGTTCATTTTTACTCAAACAGTCA

к INDEL-локусу 1699.

Условия проведения реакции амплификации

Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров к INDEL-локусу 1699 (по 0,5 мкМ каждого праймера, 25 нг ДНК - матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы(«НПФ Евроген», Россия) - 1 мкл оставшийся объем - вода. Далее полученные образцы помещают в амплификатор Терцик (НПФ «ДНК-технология», Москва) для проведения амплификации. Амплификация проводится по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 60°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 1 мин (1 цикл). Анализ продуктов амплификации проводится с помощью электрофореза в геле 10% полиакриламида.

Пример 2. Образование простой биопленки монокультурой Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+ с помощью ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699

На фиг. 1. Отображен анализ в 10% геле полиакриламида результатов образования биопленки.

Лунки: 1 - контрольная пластинка хитина без добавления клеток; 2 - культура клеток Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+использованная для заражения; 3, 5 - пластинки хитина инкубируемые при 10°С через 2 и 4 суток; 4, 6 - пластинки хитина инкубируемые при 28°С через 2 и 4 суток. Стрелка указывает на специфический амплификат массой 116 п.о., формируемый клетками токсигенного штамма.

Таким образом, результат, приведенный на фиг 1, показывает, что клетки штамма Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+ в ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699 формируют ампликон массой 116 пн (лунка 2). Факт наличия этого ампликона в препаратах ДНК, полученных из биопленок через 2 и 4 суток инкубации при10°С и 28°С, доказывает способность клеток штамма 301 формировать биопленку на поверхности хитина.

Пример 3. Формирование и анализ сложной биопленки на хитине в ПЦР двумя штаммами Vibrio cholerae.

Проводят как в примере 1, только во флакон вносят смесь двух штаммов Vibrio cholerae 301 O1 серогруппы ctx+tcpA+ и Vibrio cholerae O1 серогруппы 20000 ctx-tcpA- до конечной концентрации каждого штамма 10⁴ м.к./мл. Инкубацию проводят при 10°С и 28°С.

На фиг. 2 показан анализ в 10% геле полиакриламида образования сложной биопленки сформированной клетками Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+ и Vibrio cholerae 20000 ctx-tcpA- методом ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699. Лунки: 7 - клетки токсигенного штамма Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+, 8 - клетки атоксигенного штамма Vibrio cholerae 20000 ctx-tcpA- 9, 11, 13, 15 и 17 анализ ДНК, выделенной из сложной биопленки инкубированной при 10°С через 4, 5, 7, 10 и 12 суток инкубации; 10, 12, 14, 16 и 18 - анализ ДНК, выделенной из сложной биопленки инкубированной при 28°С через 4, 5, 7, 10 и 12 суток инкубации. Стрелки указывают расположение специфических ампликонов ctx+ и ctx- (молекулярной массой 116 и 132 п.о. соответственно) штаммов. Лунка 19 содержит маркеры молекулярного веса.

Следовательно, приведенный на фиг 2 результат, показывает, что клетки штамма Vibrio cholerae 01 серогруппы 301 ctx+tcpA+ в ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699 формируют ампликон массой 116 пн., а для клеток штамма O1 серогруппы 20000 ctx-tcpA- характерен ампликон массой 132 пн (лунки 7 и 8). В препарате ДНК из сложной биопленки после четырех суток инкубации при 10°С и 28°С зарегистрировано наличие ампликона массой 116 пн (лунки 9 и 10). Это доказывает, что сложная биопленка в этот период образована только клетками Vibrio cholerae O1 серогруппы 301 ctx+tcpA+. Начиная с седьмых суток инкубации при обеих исследованных температурах (лунки 13 и 14) в составе сложной биопленки по появлению двух ампликонов регистрируют наличие двух штаммов Vibrio cholerae 301 O1 серогруппы ctx+tcpA+ и Vibrio cholerae O1 серогруппы 20000 ctx-tcpA-. Подобная картина сохраняется после 10 и 12 суток инкубации (лунки 15-18).

Эти исследования демонстрируют сложный характер взаимодействия ctx+ и ctx- штамма при формировании сложной биопленки на хитине: первоначально биопленку формируют клетки токсигенного штамма, а начиная с седьмых и последующих суток биопленка образована двумя штаммами.

Пример 4. Формирование на хитине и анализ в ПЦР сложной биопленки образуемой штаммом Vibrio cholerae и гетерологичным микроорганизмом Aeromonas veronii.

Исследования проводят как в примере 1, только используют смесь двух штаммов Vibrio cholerae O1 серогруппы 81 ctx+tcpA+ и гетерологичной культуры Aeromonas veronii выделенной и воды реки Дон в 2017 году. Образцы инкубируют при 28°С.

На фиг. 3 показан результат анализа в 10% геле полиакриламида результатов образования сложной биопленки сформированной клетками Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+ и клетками Aeromonas veronii с помощью ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699. Лунки: 20 - маркеры молекулярного веса, 21 - исходная смесь Vibrio cholerae 301 ctx+tcpA+ и Aeromonas veronii, использованная для инокуляции; 22 и 23 - ДНК из сложной биопленки через 4 и 7 суток инкубации, 24 - ДНК из клеток Aeromonas veronii. Стрелка указывает на специфический амплификат с молекулярной массой 116 п.о., формируемый клетками токсигенного штамма.

Результат, приведенный на фиг. 3, показывает, что клетки штамма Vibrio cholerae O1 серогруппы 301 ctx+tcpA+ в ПЦР с праймерами к INDEL-локусу 1699 формируют ампликон массой 116 пн (лунка 21). Клетки гетерологичной культуры Aeromonas ампликона не образуют (лунка 24). Факт наличия ампликона массой 116 пн в препаратах ДНК, полученных из сложной биопленки через 4 и 7 суток инкубации при 28°С доказывает наличие клеток токсигенного штамма 301 в составе сложной биопленки и соответственно их способность колонизировать поверхность хитина в присутствии гетерологичной культуры Aeromonas.

Использование предполагаемого изобретения позволяет моделировать биопленки при использовании одной или нескольких культур формируемые Vibrio cholerae 01 серогруппы на поверхности хитина с последующим их достоверным изучением методом ПЦР, применяя праймеры к INDEL-локусу 1699. При этом с помощью способа моделирования возможно приступить к изучению внутривидовой и межвидовой конкуренции при формировании биопленок на хитине в отношении штаммов токсигенных вибрионов. Это позволит анализировать способность различных штаммов токсигенных вибрионов выживать в объектах внешней среды и идентифицировать представителей нормальной микрофлоры, обладающих выраженным антагонизмом в отношении токсигенных вибрионов.

Информационные источники

1. Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, С.Г. Саппо, Л.В. Миронова, Е.Ю. Марков, В.В. Мальник, В.М. Корзун, С.К. Миткеева, С.В. Балахонов. БИОПЛЕНКА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ В РЕЗЕРВАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ В ВОДНОЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ. // Журн. микробиол., 2015, №1, С. 3-11.

2. Е.Ю. Марков, Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, В.С. Вишняков, С.В. Балахонов. ХИТИН И ПРОДУКТЫ ЕГО ГИДРОЛИЗА В ЭКОЛОГИИ Vibrio cholerae // БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1334-1343.

3. O'Toole G.A., Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol v. 28 №3, P. 449-461.

4. Патент РФ 2461631 Способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы. Авторы Алексеева Наталья Валентиновна (RU), Степанова Татьяна Валентиновна (RU), Тиганова Ирина Глебовна (RU), Толордава Этери Ромеовна (RU), Романова Юлия Михайловна (RU), Гинцбург Александр Леонидович (RU), C12Q 1/00 публикация патента: 20.09.2012.

5. Shuyang Sun, Qi Xiang Martin Tay, Staffan Kjelleberg, Scott A Rice, Diane McDougald. Quorum sensing-regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. // The ISME Journal (2015) 9, 1812-1820; doi:10.1038/ismej.2014.265; published online 23 January 2015.

6. Гены, позволяющие дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae и проводить внутривидовое типирование. Свидетельство об официальной регистрации базы данных №2014620308 от 20 февраля 2014 г. Водопьянов А.С., Водопьянов C.O., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П.