Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА

Бешенство - острое инфекционное заболевание зоонозного происхождения. Случаи бешенства диких, а также домашних животных регулярно регистрируются во многих странах, что представляет серьезную угрозу для населения. В ветеринарной практике широкое распространение получили живые и инактивированные цельновирионные вакцины на основе вакцинных штаммов вируса бешенства (Rabies, 2nd edition. Alan С.Jackson, William H.Wunner, 2007). Традиционные вакцины от бешенства получают из нервной ткани инфицированных животных. Применение таких вакцин нередко приводит к нежелательным побочным эффектам (полиневрит, энцефаломиелит), связанным с наличием примесей миелина в препарате (J. Postgrad Med. 1970 16(3): 132-4). Меньшей реактогенностью обладают вакцины на основе нервной ткани новорожденных животных (мыши, ягнята), что связано со слабым развитием миелиновой оболочки в нервной ткани таких животных. Однако данные вакцины небезопасны. Первыми вакцинами против бешенства, основанными не на нервной ткани, были вакцины, получаемые в утиных эмбрионах (Mil Med. 1964; 129:960-5). Эти вакцины вскоре были замещены современными культуральными вакцинами на основе диплоидных клеток человека, клеток Vero (Dev Biol Stand. 1981; 50:173-82), клеток почки новорожденных хомячков (Appl Microbiol. 1973 Dec; 26(6):858-62), куриных эмбриональных фибробластов (Monogr Ser World Health Organ. 1966; 23:124-31). Несмотря на эффективность использования живых аттенуированных штаммов вируса бешенства для вакцинопрофилактики, их применение связано с риском попадания в окружающую среду живого инфекционного вируса, поскольку не исключается возможность реверсии в вирулентную форму.

В настоящее время широко применяются культуральные вакцины, содержащие аттенуированные штаммы вируса бешенства, инактивированные различными химическими агентами (фенол, бета-пропиолактон) или физическими воздействиями (ультрафиолетовое излучение) (Jpn J Med Sci Biol. 1953; 6(6):577-86). Однако получение таких вакцин связано с необходимостью непосредственной работы с живым патогеном. Кроме того, проведение процесса аттенуирования вирулентного штамма с целью получения препарата, пригодного для массовой иммунизации, является кропотливой и рутинной работой, требующей затраты большого количества времени и средств.

Успехи в области клонирования и экспрессии генов привели к созданию рекомбинантных вакцин против бешенства, которые просты в изготовлении, устойчивы во внешней среде и индуцируют напряженный иммунитет. Применение рекомбинантного вируса исключает попадание во внешнюю среду потенциально опасного генома вакцинного вируса бешенства. Наиболее изученными и перспективными для использования в вакцинопрофилактике бешенства являются рекомбинантные вакцины на основе вируса коровьей оспы (Vaccine. 2009 27; 27(51):7198-201) и аденовирусов (Virology. 20065-20; 356(1-2):147-54).

Рекомбинантная вирусная вакцина от бешенства на основе вируса коровьей оспы, экспрессирующая гликопротеин вируса бешенства, используется для иммунизации животных в дикой природе (J. Wildl. Dis., 1998, 34, 752-763). Однако, контакт человека с вирусом коровьей оспы может сопровождаться серьезными побочными эффектами, что было показано при проведении массовой вакцинации солдат американской армии (Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2003, 26, 423-430).

Рекомбинантные аденовирусы по сравнению с другими векторными системами отличаются высокой эффективностью экспрессии целевого трансгена в различных типах клеток, безопасностью вектора для человека и животных, накоплением рекомбинантных вирусов в клетках-продуцентах в высоком титре, индукцией как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на трансгенный продукт, большой пакующей емкостью вектора (Curr Top Microbiol Immunol. 2004, 273, 335-57). Рекомбинантные аденовирусы в качестве вакцины могут использоваться как для парэнтерального, так и для перорального введения.

Известен способ пероральной иммунизации мышей рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами 5 (аденовирус человека) и 68 серотипа (аденовирус шимпанзе), несущими ген гликопротеина вируса бешенства (US Pat. 2004019603).

К недостаткам описанного способа относится высокая стоимость процесса получения необходимого для иммунизации количества препарата рекомбинантного аденовируса с использованием клеточной линии человека.

К наиболее безопасным среди современных вакцин относятся расщепленные сплит-вакцины, содержащие частицы вируса - изолированные поверхностные и внутренние белки. Изготавливается вакцина путем расщепления вирусных частиц при помощи органических растворителей или детергентов, также вирусные компоненты могут быть получены в лабораторных условиях с использованием генно-инженерной технологии (J Immunol. 1996 15; 156(10):3579-82). Расщепленные вакцины характеризуются значительно меньшим риском побочных реакций, в связи с удалением реактогенных липидов, входящих в состав оболочки вируса. Поскольку выработка вируснейтрализующих антител против бешенства идет на поверхностный гликопротеин, данный структурный компонент используется для создания ресщепленных вакцин. Использование методов генной инженерии для получения изолированного гликопротина вируса бешенства, исключающих работу с патогеном, повышают безопасность получаемых вакцин.

Известен способ получения вакцины против бешенства, содержащей изолированный поверхностный гликопротеин вируса бешенства, экспрессированный в эукариотических клетках (US. Pat. 9411112). Кодирующую последовательность ДНК гликопротеина вируса бешенства получают реакцией обратной транскрипции на матрице РНК вируса или искусственно синтезируют, после чего она может быть встроена в коммерческий экспрессирующий вектор. Для экспрессии гликопротеина вируса бешенства в клетках S. cerevisiae разработан коммерческий плазмидный вектор pYES2 (hivitrogen, San Diego, CA). Получение гликопротеина вируса бешенства в клетках насекомых обеспечивается бакуловирусной системой экспрессии (Virology. 1989; 173(2):390-9), например, коммерческим набором МахВас (bivitrogen, Sail Diego, CA). Для получения гликопротеина вируса бешенства в клетках млекопитающих (клетки яичника китайского хомячка) может быть использован плазмидный вектор pcDNA I bivitrogen, San Diego, CA). Высокий уровень экспрессии интересующего гена обеспечивается присутствием промоторных последовательностей, энхансеров, сигнала полиаденилирования. Таким образом, получение поверхностного гликопротеина вируса бешенства возможно как в прокариотичексих, так и в эукариотических системах экспрессии, однако, использование клеток эукариот является предпочтительным, поскольку они обеспечивают необходимые посттрансляционные модификации, что приводит к образованию функционально активного продукта.

Рекомбинантный гликопротеин вируса бешенства вводится перорально животным в виде приманки с привлекательным вкусом и запахом в количестве от 100 до 300 мкг. При пероральной иммунизации описанным способом гликопротеин вируса бешенства, попадая в организм животных связывается с эпителием ротовой полости и глотки, что приводит к развитию мукозального иммунитета.

Описанный способ как наиболее близкий к заявляемому выбран за прототип.

Однако к недостаткам прототипа относится быстрая деградация в организме за счет действия протеолитических ферментов и клеток иммунной системы, короткий период полураспада чужеродного белка в организме (в среднем 2-3 часа), необходимость введения в организм больших доз вакцинных препаратов для достижения положительного эффекта; для эффективной пероральной иммунизации изолированным вирусным белком необходимо применение адъюванта; высокая себестоимость процесса получения препаративных количеств рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства, связанная с необходимостью культивирования эукариотических клеток для получения препаративных количеств рекомбинантного белка.

Целью предполагаемого изобретения является получение рекомбинантной многокомпонентной вакцины, накопленной в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, для однократной пероральной иммунизации животных против вируса бешенства.

Сущностью предлагаемого изобретения является использование смеси рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства и аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих мембраннсвязанную и секретируемую формы гликопротеина вируса бешенства, накопленных в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов. Рекомбинантный аденовирус птиц CELO, экспрессирующий секретируемую форму гликопротеина вируса бешенства обеспечивает присутствие данного компонента непосредственно в вакцинном препарате, а рекомбинантный аденовирус птиц CELO, экспрессирующий мембраннсвязанный гликопротеин вируса бешенства позволяет осуществлять эффективную и пролонгированную экспрессию целевого гена в организме иммунизированных животных, что приводит к формированию у них мощного гуморального и цитотоксического иммунного ответа против бешенства.

В качестве носителя для действующего вещества вакцины и адъюванта используется рекомбинантный аденовирус птиц CELO. Вектор CELO обеспечивает высокий уровень экспрессии целевого гена в клетках куриного эмбриона (Protein Expr Purif. 2009; 65(1): 100-7), что приводит к накоплению рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства в аллантоисной жидкости в концентрациях, достаточных для проведения иммунизации (до 100 мкг/мл). Вектор CELO способен осуществлять доставку репортерных генов и генов интереса в млекопитающих in vivo и обеспечивает пролонгированную экспрессию (до 30 дней), что обеспечивает продление периода циркуляции антигена в организме (Mol Gen Mikrobiol Virusol. 2008; (4):26-30). Эта система вирусной доставки генов безопасна для млекопитающих, так как вирус CELO не способен к репликации в клетках данных хозяев. Основным преимуществом аденовирусного вектора CELO является возможность получения препаративного количества рекомбинантных вирусов CELO в куриных эмбрионах. Количество рекомбинантных аденовирусов CELO, получаемое из одного куриного эмбриона, составляет более 10¹² вирусных частиц. Титр вируса в аллантоисной жидкости составляет 5×10⁸ БОЕ/мл. Рекомбинантный гликопротеин вируса бешенства и аденовирусные частицы, присутствующие в аллантоисной жидкости, достаточно стабильны в течение времени, необходимого для проведения иммунизации, поэтому дополнительной стабилизации препарата не требуется.

Для решения проблемы, связанной с ограниченной эффективностью трансдукции клеток млекопитающих векторами на основе аденовируса птиц, разработаны подходы, заключающиеся в генетической модификации отростка пентона (фибера). Данные подходы включают конструирование «химерных» фиберов (замена глобулярного домена на соответствующий домен альтернативного серотипа аденовирусов) или введения различных гетерологичных рецептор-связывающих последовательностей на С-конец или в HI-петлю 3 глобулярного домена фибера (J Virol., 2007 81(18); 9641-9652.). Такие модифицированные векторы способны обеспечивать эффективную доставку генетической информации в клетки млекопитающих, в норме резистентных к инфекции аденовирусами.

За счет способности взаимодействовать с рецепторами врожденного иммунитета аденовирусный вектор может выступать в качестве адъюванта (J. Virol., 2002, р.127-135).

Пример 1

Вирус бешенства вакцинного штамма ТС-80 размножают в культуре клеток почки сайги. Титр полученного вируса определяют в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Laboratory Technics in rabies. 4_th edition. WHO, Geneva, 1996). Титр вируса составляет 10⁸ БОЕ/мл.

Стандартный штамм вируса бешенства CVS-24 для проведения заражения летальной дозой вируса получают из ткани мозга инфицированных новорожденных мышей (J Ехр Med. 1977 1; 145(6):1617-22).

Пример 2

Ген гликопротеина G получают путем амплификации кДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscription System «Invitrogene» №12236-014, USA) на матрице РНК, выделенной из вируса бешенства вакцинного штамма ТС-80 с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Для ПЦР используют олигонуклеотиды, фланкирующие полный ген гликопротеина 5'-ggatccaggaaagatggttcctcaggctctcctgtttg и 5'-gctgcagcaaggggaggtgatcttcagacttggatcgt, подобранные согласно последовательности гена гликопротеина вируса бешенства (gene bank AB518487.1). Фрагмент ДНК, несущий ген гликопротеина G вируса бешенства (последовательность №1), клонируют в плазмидный вектор pGEM-T Easy Vector ("Promega", A1360, USA). Ген гликопротеина G вируса бешенства субклонируют в составе экспрессирующей кассеты, состоящей из промотора CMV с энхансером и участком полиаденилирования BGH в вектор pCBEdlRV, содержащий фрагмент генома аденовируса CELO с делецией, несущественной для репликации вируса области. Рекомбинантный аденовирус CELO-glRb, несущий ген гликопротеина вируса бешенства, получают методом гомологичной рекомбинации в клетках LMH. Растворимую форму гликопротеина G вируса бешенства (ΔglRb) получают путем сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидов: 5'-aggagcatgcaaactcaag, 5'-ggtggcggccgctcaatgcac, внося замену в аминокислотной последовательности в положении 417: Pro417 на стоп-кодон. Вариант гена гликопротеина G вируса бешенства с делецией трансмембранного домена (последовательность №2) субклонируют в составе экспрессирующей кассеты, состоящей из промотора CMV с энхансером и участком полиаденилирования BGH в вектор pCBEdlRV, содержащий фрагмент генома аденовируса CELO с делецией, несущественной для репликации вируса области. Рекомбинантный аденовирус CELO-ΔglRb, несущий ген гликопротеина вируса бешенства с делецией, получают методом гомологичной рекомбинации в клетках LMH. Схематическое изображение геномной ДНК рекомбинантного аденовируса птиц CELO-glRb, несущего ген гликопротеина G вируса бешенства, представлено на фигуре 1А

Плазмидную конструкцию, несущую полноразмерный геном аденовируса птиц CELO-HIRGD, имеющего модификации структурных белков капсида (фибера) и экспрессирующую кассету с геном гликопротеина вируса бешенства, получают методом гомологичной рекомбинацией в Е. coli штамма BJ5183 между плазмидами pCELO-HIRGD, и шаттл-вектором pCShCMV-glRb, несущим экспрессирующую кассету (CMV промотор, трансген, сигнал полиаденилирования), фланкируемую последовательностями CELO. Шаттл-вектор pCShCMV-glRb линеаризуют по рестриктазе AscI. Плазмиду pCELO-HIRGD линеаризуют по PacI. Шаттл-вектор вместе с плазмидой pCELO-HIRGD трансформируют в клетки Е. coli штамма BJ5183. Получение рекомбинантных клонов подтверждают с помощью ПЦР, рестрикционным картированием и секвенированием. Схематическое изображение геномной ДНК рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HIRGD-glRb, имеющего модификации структурных белков капсида, несущего ген гликопротеина G вируса бешенства, представлено на фигуре 1Б.

Пример 3

Экспрессию гена гликопротеина G вируса бешенства в куриных эмбрионах, зараженных аденовирусами CELO-ΔglRb, CELO-glRb, CELO-HIRGD-glRb, определяют методом иммуноблоттинга. Куриные эмбрионы заражают рекомбинантными аденовирусами CELO-ΔglRb, CELO-glRb, CELO-HIRGD-glRb. В качестве контрольного используют аденовирус CELO дикого типа. Через 72 часа после заражения отбирают аллантоисную жидкость, которую анализируют методом иммуноблоттинга. В реакции используют моноклональные антитела к вирусу бешенства штамма ТС-80. Специфическое взаимодействие комплекса антиген-антитело выявляют антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом (Goat-antimouse IgG-HRP, Amersham, 1:5000). Окраску проводят с использованием хемилюминисцентной системы детекции (ECL-plus Detection System, Amersham). Результат проведенного иммуноблоттинга представлен на фигуре 2.

Результат анализа показывает специфическое взаимодействие антител и рекомбинантного белка, соответствующего по электрофоретической подвижности гликопротеину G вируса.

Пример 4

Полученным культуральным вирусным препаратом CELO-glRb инфицируют куриные SPF-эмбрионы, из расчета 100 мкл культурального препарата на эмбрион. Через 72 ч после заражения отбирают аллантоиснюю жидкость. Аналогичным образом получают препарат рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HIRGD-glRb и препарат рекомбинантного аденовируса птиц, несущего в составе экспрессирующей кассеты ген гликопротеина G вируса бешенства без трансмембранного домена - CELO-ΔglRb. Для проведения иммунизации аллантоисные препараты рекомбинантных вирусов CELO-glRb и CELO-HIRGD-glRb смешивают в соотношении 1:1 с препаратом рекомбинантного аденовируса птиц CELO-ΔglRb. Полученные комбинации используются для пероральной иммунизации мышей в количестве 1 мл на животное.

Пример 5

Первой группе беспородных мышей перорально однократно вводят смесь рекомбинантных аденовирусов CELO-glRb/CELO-ΔglRb в виде аллантоисного препарата. Второй группе вводят смесь рекомбинантных аденовирусов CELO-HIRGD-glRb/CELO-ΔglRb. Третью группу мышей двукратно иммунизируют культуральной инактивированной вакциной, содержащей штамм вируса бешенства ТС-80. В качестве отрицательного контроля группе мышей однократно вводят аденовирус CELO дикого типа. Через 14 дней после иммунизации мышам интрацеребрально вводят 100 МЛД₅₀ вируса CVS-24. В группе мышей, однократно иммунизированных рекомбинантными аденовирусами CELO-glRb и CELO-HIRGD-glRb, выжило 91% и 90% животных, соответственно. При использовании стандартной культуральной инактивированной вакцины только 82% мышей были защищены от последующего заражения летальной дозой вируса бешенства штамма CVS-24 (таблица).

Таким образом, показано, что максимальный уровень защиты мышей от внутрицеребрального заражения вирусом бешенства штамма CVS-24 - 91% - детектируется при однократной иммунизации рекомбинантными аденовирусами птиц CELO-glRb и CELO-HIRGD-glRb перорально.

Пример 6

Специфические антитела к вирусу бешенства в сыворотке крови мышей, иммунизированных рекомбинантной вакциной CELO-glRb или CELO-HIRGD-glRb, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа.

Сенсибилизацию панелей проводят нормальным и специфическим антигенами, которые вносят разведенными в рабочем разведении в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,2-7,4 в нечетные и четные ряды, соответственно. Панели инкубируют в течение ночи при 4°С.

Свободные адсорбционные сайты полистирола блокируют 1% БСА, в объеме 0,15 мл /лунку, инкубируя в течение 30 минут при 37°С. После последующей отмывки пластин ФСБ с Твин-20 (ФСБ-Т) испытуемые сыворотки вносят в лунки панелей в разведении с 1:3 до 1:729 на 1% БСА в ФСБ. Пластины инкубируют в течение 40 минут при 37°С, затем проводят трехкратную отмывку в ФСБ-Т, вносят рабочее разведение (1:1000) антимышиного пероксидазного конъюгата и инкубируют в течение 40 минут при 37°С.

После этого пластины шестикратно отмывают ФСБ-Т и вносят раствор хромогенного субстрата (АБТС). Учет результата проводят через 30 минут инкубирования при комнатной температуре.

Учет реакции осуществляют фотометрически при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной и специфичной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые сыворотки, а также в лунках, в которые вносили положительные контрольные сыворотки, в 2 или более раз превышала среднюю оптическую плотность субстрата в лунках, в которые вносили контрольные (отрицательные) нормальные сыворотки.

Результат титрования специфических антител к вирусу бешенства в сыворотке крови мышей, иммунизированных рекомбинантным вирусом CELO-glRb, представлен на фигуре 5. Титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами CELO-glRb и CELO-HIRGD-glRb, коррелирует с титром антител, детектированным в сыворотках крови мышей после иммунизации культуральной вакциной ТС-80. Рекомбинантные вирусы CELO-glRb и CELO-HIRGD-glRb при введении мышам индуцируют синтез высокого уровня специфических антител против гликопротеина G вируса бешенства.

Таким образом, получена вакцина, содержащая смесь гликопротеина вируса бешенства, а также рекомбинантных аденовирусов птиц, один из которых (CELO-glRb) экспрессирует секретируемую форму поверхностного гликопротеина вируса бешенства, а второй (CELO-glRb или CELO-HIRGD-glRb) - мембраннсвязанную, однократное пероральное введение которой приводит к эффективной защите от летальных доз вируса бешенства.