Результат интеллектуальной деятельности: ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ

Изобретение предназначено для лечения вирусных инфекций и относится к комбинациям противовирусных агентов, обладающих активностью против ВИЧ, а именно к комбинации ламивудина (3ТС) с фосфазидом (5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль; Никавир^®).

ВИЧ-инфекция - длительно текущая инфекционная болезнь, развивающаяся в результате инфицирования вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). При ВИЧ-инфекции прогрессирует поражение иммунной системы, приводящее к состоянию, известному под названием «синдром приобретенного иммунного дефицита» (СПИД), при котором у больного развиваются «оппортунистические заболевания»: тяжелые формы инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями, и некоторые онкологические заболевания.

Зараженный человек остается источником инфекции пожизненно. ВИЧ-инфекция без лечения прогрессирует в течение 3-20 лет и заканчивается гибелью зараженного лица.

Разнообразие клинических проявлений ВИЧ-инфекции и возникающих на ее фоне оппортунистических заболеваний, длительное течение болезни сделало актуальным разработку лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом. В настоящее время известны следующие группы препаратов: нуклеозидные, нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы вирусной обратной транскриптазы; протеазные ингибиторы; ингибиторы фузии. В разработке находится ряд соединений, активных в отношении других участков жизнедеятельности ВИЧ.

Наиболее широкое применение нашли нуклеозидные ингибиторы вирусной обратной транскриптазы. В их числе - зидовудин (АЗТ), ламивудин (3ТС), диданозин (DDI) и др. Причем до сих пор наиболее широко применяется первый из разработанных препаратов - зидовудин.

Необходимость длительного, практически пожизненного применения препаратов приводит к токсическим проявлениям и развитию лекарственной устойчивости вируса (резистентности). По некоторым данным резистентность к АЗТ развивается через 6 инфекционных циклов, к 3ТС - через 4 инфекционных цикла. Известен препарат фосфазид (5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль, Никавир^®) [Кравченко А.В. Применение Никавира в составе антиретровирусной терапии // Медицинская кафедра, 2004. - №2. - С.90-92, 166-172], применение которого характеризуется лучшей переносимостью и меньшей скоростью возникновения резистентности к нему по сравнению с зидовудином [Machardo J., Salomon H., Oliveiro M., et al. Antiviral activity and resistance profile of phosphazide, a novel prodrug of AZT. Nucleosides & Nucleotides; 1999; 18: 901-906]. Отмеченные преимущества могут быть объяснены данными по метаболизму фосфазида [Y. Skoblov et al. / Antiviral Research 63 (2004) 107-113].

Использование комбинаций противовирусных препаратов позволяет более эффективно воздействовать на ВИЧ за счет возникающего синергического эффекта. Так авторами патента [Патент RU №2139059] показано, что в сочетании со вторым компонентом, ламивудин (3ТС) либо усиливает действие второго компонента (синергический эффект), либо снижает цитотоксическое действие второго компонента, либо обладает и тем и другим из указанных свойств.

К недостаткам известной комбинации ламивудина с зидовудином можно отнести:

- токсичность, проявляющуюся в основном в развитии анемии, нейтропении и лейкопении;

- мутагенный эффект, проявляющийся в способности индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro;

- недостаточная эффективность лечения.

Задачей изобретения является разработка комбинированного средства, обладающего активностью в отношении ВИЧ-инфекции, лишенного указанных недостатков.

Авторами настоящей заявки было установлено, что замена зидовудина на фосфазид в известной комбинации с ламивудином приводит к существенному снижению токсических проявлений, характерных для больных, получающих зидовудин, отсутствию мутагенного эффекта при учете генных мутаций на микроорганизмах и достоверному росту эффективности лечения. В связи с тем, что фосфазид в организме млекопитающего частично генерирует зидовудин [Y. Skoblov et al. / Antiviral Research 63 (2004) 107-113], его использование в известной комбинации вместо зидовудина не должно было приводить к перечисленным преимуществам. Поэтому полученные результаты могут быть отнесены к неожиданным, предсказать которые заранее было невозможно.

Средство согласно изобретению может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала комбинацию нуклеозидных ингибиторов вирусной обратной транскриптазы ламивудина (а) и фосфазида (б) или набор, где компоненты (а) и (б), каждый, предложены в форме (которая может быть одинаковой или разной), подходящей для введения в сочетании друг с другом.

Выполненное по любому из вариантов средство содержит комбинацию ламивудина и фосфазида при соотношениях активных компонентов от 1:250 до 250:1, предпочтительно 1:5-50:1, а более предпочтительно около 1:10-10:1.

Предлагаемая в настоящем изобретении противовирусная комбинация может быть использована в способе лечения ВИЧ-инфекции. При этом оба соединения могут быть введены либо одновременно, в смеси или раздельно, либо последовательно. Как и в прототипе при последовательном введении промежуток времени между введением ингибиторов не должен быть слишком большим. Он может составлять от нескольких минут до 3 часов. Предпочтительным является одновременное введение. Количество ламивудина и фосфазида, необходимое для лечения, может варьироваться в зависимости от способа введения, особенностей протекания ВИЧ-инфекции, возраста и состояния пациента, и может быть определено в каждом конкретном случае лечащим врачом. При этом используемые дозы находятся в пределах от 2 до 750 мг на кг веса в день, предпочтительно в пределах 6-90 мг/кг/день, а наиболее предпочтительно 15-60 мг/кг/день каждого ингибитора.

Ламивудин и фосфазид могут быть использованы в терапевтических целях в виде субстанций: (2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксакисолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он и 5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль. Однако предпочтительно введение указанных ингибиторов в виде композиции с фармацевтически приемлемыми носителями.

В качестве приемлемых носителей могут быть использованы различные добавки, используемые при производстве готовых лекарственных форм (таблетки, капсулы, свечи, инфузионные растворы и др.), совместимые с другими ингредиентами препарата и не оказывающие неблагоприятное воздействие на пациента.

В силу свойств молекул ламивудина и фосфазида, особенностей механизма их воздействия на ВИЧ внутри клеток наибольший интерес представляют препараты для перорального, парентерального и ректального введения. Также препараты могут быть изготовлены любым из известных в фармацевтике способов, которые концептуально включают в себя ряд этапов: смешение и гранулирование ингибиторов с твердыми или жидкими носителями; формирование продукта в виде дискретных унифицированных лекарственных форм.

Для перорального введения могут использоваться таблетки, капсулы, растворы для приема внутрь и другие известные в фармацевтике стандартные лекарственные формы. Таблетки и капсулы могут содержать стандартные наполнители, необходимые как для технологии их изготовления, так и для достижения необходимых качественных и количественных показателей, отвечающих требованиям соответствующей фармакопеи. Примерами наполнителей могут быть лактоза, маннит, крахмалы, модифицированные крахмалы, целлюлоза и ее производные, желатин, стеариновая кислота или ее соли, увлажнители, отдушки, красители.

Пероральные жидкие препараты могут быть изготовлены либо в виде растворов (водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и др.), либо в виде сухих продуктов, которые перед непосредственным применением подлежат разведению водой или другими растворителями.

Препараты для парентерального введения (например, для инфузий) могут быть изготовлены в виде стандартных флаконов, ампул, заполненных шприцев и др. Также лекарства должны изготавливаться в условиях стерильности и могут содержать различные консерванты, буферирующие агенты, стабилизаторы, изотонические агенты. Лиофилизованные формы перед использованием должны смешиваться с апирогенным стерильным растворителем.

Готовые лекарственные формы для ректального введения могут изготавливаться в виде суппозиториев в унифицированных формах. Также твердые формы изготавливаются, как правило, с использованием подходящего носителя путем смешения ингибитора с твердым или расплавленным носителем с последующим формованием из расплава при охлаждении.

Помимо отмеченного, фармацевтические композиции могут быть изготовлены с использованием модифицированных соединений, приводящих к пролонгированному высвобождению ингибиторов внутри организма.

Настоящее изобретение иллюстрируется, но не ограничивается, приводимыми далее примерами.

Пример 1.

Капсулы следующего состава:

Фосфазид 300 мг

Ламивудин 150 мг

Лактоза 240 мг

Стеарат магния 20 мг

Пример 2.

Набор в виде блистерной упаковки, содержащей два ряда капсул по 10 штук разного цвета.

1 ряд - капсулы желтого цвета следующего состава:

Фосфазид 300 мг

Кальция карбонат 170 мг

Целлюлоза микрокристаллическая 55 мг

Аэросил 20 мг

Магния стеарат 15 мг

2 ряд - капсулы белого цвета следующего состава:

Ламивудин 150 мг

Лактоза 85 мг

Стеарат магния 5 мг

Пример 3.

Набор в виде блистерной упаковки, содержащей два ряда таблеток по 10 штук разного цвета.

1 ряд - таблетки желтого цвета следующего состава:

фосфазид 100 мг

кальция карбонат 55 мг

целлюлоза микрокристаллическая 18 мг

аэросил 6 мг

магния стеарат 6 мг

хинолиновый желтый Е104

2 ряд - таблетки белого цвета следующего состава:

ламивудин 200 мг

лактоза 21 мг

гидроксипропилметилцеллюлоза 45 мг

повидон 12 мг

стеарат магния 2 мг

Пример 4

Раствор для инъекций

Ламивудин 200 мг

Фосфазид 20 мг

Бензиловый спирт 100 мг

Глюкофурол 75 1000 мг

Вода для инъекций до 3 мл

Пример 5

Свечи следующего состава:

Ламивудин 2 мг

Фосфазид 500 мг

Витепсол 1498 мг

Пример 6.

Испытания in vitro комбинации ламивудина с зидовудином и ламивудина с фосфазидом с целью оценки мутагенной активности.

Использовали метод учета способности соединения индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro.

В качестве индикаторных микроорганизмов использовали ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimurium ТА 98, ТА 100 и ТА1537.

Водные растворы веществ (ламивудин + зидовудин; ламивудин + фосфазид) в концентрациях каждого от 0,2 до 2000 мкг/чашку стерилизовали с помощью мембранных фильтров с диаметром пор 0,2 микрон фирмы GELMAN. Селективный полуобогащенный агар в пробирках в объеме 2 мл плавили на водяной бане при температуре 100°С, охлаждали в термостатируемой водяной бане до температуры 44-45°С. В пробирки с агаром вносили 100 мкл раствора веществ, 100 мкл суспензии ночной культуры бактерий, 100 мкл фракции 59 печени крысы и кофакторы. Микросомальную фракцию печени крысы, индуцированной Aroclor, получали в виде лиофилизата у фирмы Labsystems (Финляндия). Проводили опыт как с полной микросомальной активирующей смесью ПАМС, так и с неполной активирующей микросомальной смесью НАМС. Указанные смеси вносили после извлечения пробирок из термостатирующей бани и тут же наносили полужидкий агар на слой минимального агара на чашках Петри. После полного застывания агара чашки переносили в термостат при 37°С. На каждую дозу препарата делали 3 повторности с ПАМС и 3 повторности с НАМС. Учет прототрофных ревертантов производили через 48 часов инкубации при 37°С. Для каждого варианта рассчитывали среднее геометрическое число ревертантов

Xi=³N Xi₁ Xxi₂ Xxi₃

где Xi - число ревертантов в чашках Петри 1, 2, 3 на дозе i.

Для каждого опытного варианта находили кратность превышения среднего геометрического числа ревертантов в опыте над контролем и сравнивали с критическим значением (1.9 для штамма ТА 1537 и 1.5 для штамма ТА 98 и ТА 100).

Мутагенный эффект растворов с зидовудином выявлен для штаммов ТА 98 и ТА 1537 как в присутствии микросомальной смеси, так и без нее в дозах 2 мкг на чашку и выше.

Растворы ламивудина с фосфазидом не обладают мутагенным действием в тесте Эймса.

Пример 7.

В ФНМЦ СПИД проанализирована эффективность и безопасность противоретровирусной терапии, включающей в себя в том числе комбинацию фосфазида - 0,6 г в сутки и ламивудина - 0,3 г (в соотношении по примерам 1, 2) в сутки у 23 больных ВИЧ-инфекцией женщин. Ни в одном случае не было отмечено нежелательных явлений, связанных с применением фосфазида или ламивудина и потребовавших коррекции терапии.

Анализ динамики лабораторных маркеров эффективности противоретровирусной терапии (количества в крови РНК ВИЧ и СВ4-лимфоцитов) дал следующие результаты:

- Медиана уровня РНК ВИЧ (вирусная нагрузка) до начала лечения составляла 15500 копий в мл (4,19 log10), максимальное значение в группах - 136000 копий в мл (5,13 log10), минимальное - 1510 копий в мл (3,10 log10). Через 12 недель лечения - медиана - ниже уровня определения (<400 копий в мл - 2,6 log10), максимум - 28200 копий/мл (4,45 log10).

- Значимое снижение уровня «вирусной нагрузки» (более чем на 0,7 log10) к 12 неделе лечения было отмечено в 13 из 13 случаев (100%) в первой группе и в 9 случаев из 10 во второй (90%).

- Количество пациентов с относительно высоким уровнем «вирусной нагрузки» (>30000 копий в мл) до лечения было 8 из 23 (35%), причем у 2 (9%) пациентов вирусная нагрузка была очень высокой (более 100000 копий в мл). Через 12 недель лечения вирусная нагрузка ни в одном случае не превышала 30000 копий в мл.

- Вирусная нагрузка выше 1000 копий в мл (показание к родоразрешению ВИЧ-инфицированной беременной путем планового кесарева сечения) до лечения отмечалось у всех пациенток, через 12 недель лечения - у 4 (17%).

- Вирусная нагрузка ниже уровня определения (400 копий в мл), не встречавшаяся до лечения ни в одном случае, через 12 недель лечения отмечена у 16 (70%) пациентов.

- Медиана уровня СD4-лимфоцитов до начала лечения составляла 0,35 млрд/л, максимальное значение в группе - 0,8 млрд/л, минимальное - 0,19 млрд/л. Через 12 недель лечения - медиана - 0,4, максимум - 0,87, минимум 0,15.

- Повышение уровня СD4-лимфоцитов к 12 неделе лечения имело место у 16 (70%) пациентов, снижение у 7 (30%).

- Количество пациентов с относительным уровнем СD4-лимфоцитов менее 0,35 млрд/л до лечения - 11 человек (48%), через 12 недель лечения - 7 человек (30%).

Таким образом, в обеих группах пациентов к 12 неделе лечения отмечалось статистически достоверное снижение «вирусной нагрузки». У 22 из 23 пациентов терапия по критерию снижения «вирусной нагрузки» была эффективна.

Анти-ВИЧ-1 активность комбинации изучали на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражали стоком вируса (штамм вич-1_EVK) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37° в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводили ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, до посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. Выявление и количественное определение антигенов вируса иммунодефицита человека типов 1 и 2. Вопр. вирусол. (1992). №3: 135-138].

Экспериментальные данные приведены в таблицах.

Таким образом, в результате изучения анти-ВИЧ активности нуклеозидных ингибиторов фосфазида (никавира), ламивудина (3ТС) и их комбинаций в отношении штамма ВИЧ-1 ГКВ 4005 на культуре клеток МТ-4 установлено, что сочетания никавира и ламивудина проявляют синегризм в отношении ингибирования репродукции ВИЧ-1.

При пассировании вируса в описанных условиях установлено, что падение действующей концентрации фосфазида в присутствии ламивудина наступает на 60-70 дней позже по сравнению с использованием одного лишь фосфазида. Концентрации фосфазида в сравнительных опытах были идентичны.