Результат интеллектуальной деятельности: БРОМИД 1-ГЕКСАДЕЦИЛ-R-(-)-3-ОКСИ-1-АЗОНИАБИЦИКЛО[2.2.2]ОКТАНА - ИММУНОМОДУЛЯТОР С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ, БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИМИ И АНТИАГРЕГАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана (далее вещество I) относится к кватернатам оптически активных бициклических аминоспиртов и может быть использован: в медицине в качестве химио- и радиопротектора в сочетании с химио- и лучевой терапией для улучшения качества жизни больных и уменьшения интервалов между курсами специфического лечения рака, при хирургическом лечении химиорезистентных форм рака (рак легкого, пищевода, желудка и т.д.) в качестве стимулятора противоопухолевого иммунитета у больных в послеоперационном периоде; для профилактики онкологических заболеваний у лиц с высоким фактором риска (генетическая предрасположенность к раку, профессиональные факторы и т.д.) на фоне мониторинга противоопухолевых составляющих иммунитета; при лечении иммунодефицитов и хронических инфекций различной природы; в качестве антикоагулянта у больных с повышенной свертываемостью крови для профилактики тромбообразования; в лабораторной практике: в качестве активатора натуральных киллеров и индуктора цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухолей, интерферонов и т.д.)

В качестве аналогов вещества I могут рассматриваться иммуномодуляторы цитокиновой природы с противоопухолевой активностью. К таким соединениям относятся препараты интерлейкина-2 (Ронколейкин, Россия и Пролейкин, Голландия) и интерферона (Реоферон, Россия, Интрон-А, США). Эти препараты при воздействии в терапевтических дозах могут вызывать побочные реакции в виде лихорадки, снижения уровня артериального давления, почечной и дыхательной недостаточности (Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. /Под ред. В.Т.ДеВита, С.Хеллмана, С.А.Розенберга. - М.: Медицина, 2002. - Д.Дж.Шварцентрубер. Биологические методы лечения интерлейкином-2: клиническое применение, - с.247-262; К.А.Фун Биологические методы лечения интерфероном-α и -β: клиническое применение - с.382-390; X.Р.Кесада. Биологические методы лечения интерфероном-γ, с.452-460). Побочные эффекты этих рекомбинантных пептидов требуют проведения длительных (до 18 ч) инфузий или подкожных введений, при которых происходит потеря до 30% активности действующего начала (Справочник для иммунотерапии для практического врача./ Под ред. А.С.Симбирцева. - С.-П.: Диалог, 2002. - В.К.Козлов Ронколейкин: биологическая активность, иммунокорригирующая эффективность и клиническое применение). Кроме того, эти препараты при длительном применении вызывают образование антител, что снижает их эффективность (G. Sama at al. A comparative study of intravenous versus intralymphatic interleukin-2, with assessment of effects of interleukin-2 on both peripheral blood and thoracic-duct lymph. J. Immunother, 1994. - №15 - P.140-146). Рекомбинантные цитокины требуют особых условий хранения и транспортирования и не могут храниться в водных растворах. Известны также иммуномодуляторы не белковой природы (ликопид, полиоксидоний, иммунофан, неовир), которые используются для коррекции иммунного статуса у онкологических больных, однако их противоопухолевое действие не установлено (Добрица В.П., Ботерашвили Н.М., Добрица Е.В. Современные иммуномодуляторы для клинического применения: Руководство для врачей. -С.-П.: Политехника, 2001. - 251 с.; Справочник для иммунотерапии для практического врача. /Под ред. А.С.Симбирцева. - С.-П.: Диалог, 2002. - А.А.Старченко. Общая характеристика иммунотропных препаратов - с.100-151).

Вещество I в отличие от рекомбинантных цитокиновых противоопухолевых препаратов характеризуется низкой токсичностью и в дозах, в тысячи раз превышающих терапевтические, не оказывает токсического действия на системы жизнеобеспечения у лабораторных животных. Вещество I не вызывает гипертермических реакций у животных, не оказывает аллергезирующего действия и не обладает кумулятивным эффектом. Препарат высоко стабилен в водных растворах, не требует особых условий транспортирования и хранения, сохраняет свою биологическую активность в растворах не менее 3 лет. Вещество I наряду с иммуномодулирующим действием обладает противоопухолевой и бактериостатической активностью. Вещество I хотя и является синтетическим соединением с низкой молекулярной массой, наиболее близким по спектру биологической активности для него является рекомбинантный пептид ИЛ-2, который может рассматриваться в качестве его прототипа.

Препарат представляет собой индивидуальное органическое вещество - бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана, см. фиг.1.

Способ получения. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана (I) получают кватернизацией R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (II) бромистым гексадецилом (III) по схеме 1 при нагревании в органическом растворителе, например, этаноле или изопропаноле. По окончании реакции продукт I отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.

Схема 1

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октан (I) имеет R- абсолютную конфигурацию хирального центра, и поэтому исходным веществом для его получения по схеме 1 является R(-)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ол (II).

Исходное вещество - R(-)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ол (II) выделяют при расщеплении RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) через диастереомерные соли с хиральной кислотой (например, с R(-)- или S(+)-энантиомерами миндальной кислоты) в органическом растворителе(например, в ацетоне или метилэтилкетоне). При использовании для расщепления RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) в качестве хирального расщепляющего реагента кислого характера R(-)- миндальной кислоты (VIII) по схеме 2 происходит преимущественная кристаллизация R(-)•R(-) - диастереомерной соли (IX), которую отфильтровывают и очищают от второй S(+)•R(-)-диастереомерной соли кристаллизацией.

Схема 2

Разложение диастереомерных солей производится в следующем порядке (схема 3). В начале из водного раствора диастереоизомерной соли действием разбавленной соляной кислоты регенерируют хиральный реагент (УТЛ), извлекая его эфиром. Затем из водного кислого раствора действием твердого едкого кали выделяют энантиомер 1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ола (II), который отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.

Схема 3

Используемые для получения бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) PS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, бромистый гексадецил и R(-)- и S(+)-миндальные кислоты являются доступными реагентами для органического синтеза.

Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) представляет собой мелкокристаллическое химически и оптически стабильное вещество с температурой плавления Т_пл.=228-230°С и удельным вращением (с 1.5, 50% С₂Н₅OH), (с 1.5, C₅H₅N-CH₃OH, 1:1). Вещество растворимо в воде, метаноле, этаноле, хлороформе, пиридине, диметилсульфоксиде.

Пример 1. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана.

Раствор 12,7 г (0,1 моля) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 33,6 мл (33,6 г, 0,11 моля) бромистого гексадецила в 50 мл изопропанола нагревают в колбе с обратным холодильником в течение 16 ч. Осадок отфильтровывают, промывают изопропанолом и сушат. Перекристаллизовывают из изопропанола. Получают 39,5 г. (91,3%) бромида 1-гексацедил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана в виде мелкокристаллического вещества с Т_пл. 229,2°С, (с 1.5, 96% С₂Н₅OH), (с 1.5, 50% С₂Н₅OH), (с 1.5, 50% C₅H₅N- СН₃ОН, 1:1)

Найдено, %: С64,18; Н 10,97; N 3,18; Br 18,60.

С₂₃Н₄₆BrNO

Вычислено, %: С 63,87; Н 10,72; N 3.24; Br 18,47.

Пример 2.

R(-)- и S(+) - энантиомеры 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (расщепление RS (±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола R(-)- и S (+) - миндальными кислотами).

К раствору 30,4 г (0,2 моля) R(-)- миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 25,4 г (0,2 моля) RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Перемешивание продолжают до полного растворения 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×30 мл) и сушат. Получают 27,8г кристаллов с Т_пл. 111,8-112,3°С и (с 3, Н₂О), которые растирают в порошок и перекристаллизовывают из 1200 мл ацетона. Через 12 ч отфильтровывают 21,4 г (-)•(-) - соли с (с 3, Н₂О). Вторую кристаллизацию проводят из 1000 мл ацетона. Через 12 ч выделяют 19,0 г (68,0%) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл.=120,8°С, (с 3, Н₂О). Последующая кристаллизация не приводит к изменению Т_пл. и соли.

Найдено, %: С 65,11; Н 7,52; N 4,89. С₇H₁₃NO•C₇Н₈О₃.

Вычислено, %: С 64,54; Н 7,58; N 5.05.

К 50, 4 мл 6%-ной соляной кислоты (0,085 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,0 г (0,068 моля) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. После полного растворения соли R(-) - миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл). Эфирные экстракты промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан- ацетон (5:1). Получают 9,8 г R(-) - миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл.=133,2°С, (c 3, Н₂О).

К водному слою, оставшемуся после отделения R(-)- миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 24,7 г (0,44 моля) твердого едкого кали. Всплывший осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола. Получают 7,9 г (91,3%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл=222.3°С, (с 2, 1 н. СН₃СО₂Н).

Первый ацетоновый маточный раствор, полученный после отделения 27,8 г (-)•(-)-соли, упаривают на водяной бане, и из остатка действием 6%-ной соляной кислоты выделяют 14,4 г R(-)- миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл.=133,4°С (из смеси гептан- ацетон (5:1)), (с 3, Н₂О), а затем действием едкого кали - 11,6 г 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+) - энантиомером, Т_пл.=222,5°С (из толуола), (с 2, 1 н. СН₃CO₂Н, о. ч. 85,7%).

К раствору 13,9 г (0,091 моля) S(+) - миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 11,6 г (0,091 моля 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+)-энантиомером с (с 2, 1 н. СН₃СО₂Н). Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×20 мл) и сушат. Получают 21,9 г (+)•(+)- соли с (с 3, Н₂О). Последующая кристаллизация приводит к 19,4 г (82,0%) S(+) - манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т_пл=121,0°С, (c 3, Н₂О).

К 51,5 мл 6%-ой соляной кислоты (0,087 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,4 г (0,069 моля) S(+) - манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, S(+) - миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл). Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан- ацетон (5:1). Получают 10,0 г S(+) - миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Т_пл.=131,1°С, (c 3, H₂O).

К водному слою, оставшемуся после отделения S(+) - миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 25,2 г (0,45 моля) твердого едкого кали. Всплывшее вещество отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола.

Получают 8,1 г (91,7%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ола, Т_пл=222,4°С, (с 2, 1 н. СН₃СО₂Н).

Таким образом, при расщеплении 25,4 г RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола получают 7,9 г (62,2%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 8,1 г (63,8%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола.

Цель патентуемой разработки: создание нового синтетического низкомолекулярного препарата, обладающего выраженным стимулирующим действием на систему противоопухолевого иммунитета, не уступающего, а по возможности превосходящего по эффективности современные отечественные и зарубежные препараты - иммуномодуляторы, которые являются природными высокомолекулярными биологически активными веществами, полученными с помощью методов генной инженерии.

Была проведена оценка токсической и биологической активности вещества I.

Оценка испытаний вещества I на острую токсичность.

Результаты проведенных испытаний показали отсутствие половых различий в чувствительности животных к токсическому действию вещества I. Категории доз острой токсичности препарата для мышей и крыс представлены в таблице 1.

В соответствии с табуляцией классов токсичности (Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия), М., 1970, стр.16) вещество I относится к классу «малотоксичных» веществ.

Влияние вещества I на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров.

На фиг. 1.1., 1.2, 1.3 и 1.4 показано стимулирующее действие вещества I на продукцию цитокинов интерлейкина-1β (ИЛ-1β), интерферона-α (ИФН-α), интерлейкина-2 (ИЛ-2), фактора некроза опухоли (ФНО-α) мононуклеарными клетками здоровых доноров, выделенных из периферической крови согласно методике [Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. /Под ред. В.В.Меньшикова: Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии». - М.: «Медицина», 1987. - с.307].

Количественное определение цитокинов в супернатанте мононуклеарных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10^-4-10^-8 М), по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И., ж. «Клиническая лабораторная диагностика», №2, 2000. - с.20-23], проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента [«Иммунология» под ред. У.Пола в 3-х т. - М., «Мир», 1989, т.3, гл. 28, с.260, Ed.W.Paul «Fundamental Immunology» - Raven Press, N.Y., 1984 ].

Соотношение клеток - мишеней и клеток - эффекторов 1:10, контроль - с добавлением физиологического раствора хлорида натрия (0,9% NaCl).

Динамика роста опухоли у животных, леченных препаратом Пролейкин и веществом I, была достоверно меньше по сравнению с контрольной группой.

Вещество I оказывало тормозящее влияние на динамику роста опухоли меланомы В-16 у мышей гибридов F1 и увеличивал продолжительность их жизни. В частности, в дозе 0,005 мг/кг отмечено торможение опухолевого роста на 80%. Гибель животных в контрольной группе наступала на 19 сут., в то время как мыши, получавшие вещество I в указанной дозе, оставались живы до 25 сут. (см. фиг.3.1 и 3.2).

Таким образом, вещество I в дозах 0,05-0,005 мг/кг оказывает сходное цитостатическое действие по сравнению с препаратом Пролейкин при испытании на мышах с привитыми опухолями и вызывает стимуляцию противоопухолевого иммунитета.

Противоопухолевую активность также изучали на мышах-самцах линии СВА, которым подкожно перевивали аденокарциному яичников СаО-1. Опухоль была получена на потомстве мышей-самок линии СВА, которым во время беременности вводили эстрогены. Опухоль по гистологическому строению, клиническому течению и даже антигенному строению близка к раку яичника человека (БЭБиМ. - 2000 г., №129, стр.456-459). Опухолевые клетки перевивали в количестве 1 млн. клеток/ мышь.

Лечение осуществляли по схеме:

Мышам (30 штук) через 24 часа после перевивки опухолевых клеток начинали вводить разведенный в физиологическом растворе вещество I подкожно в 0.2 мл в нечетные дни (1-й, 3-й, 5-й и т.д.). Всего 7 введений. В контрольной группе животным вводили в этом же режиме физиологический раствор (растворитель препарата) (20 штук). Препарат вводили в трех дозах: 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг.

Оценку действия препарата на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста опухоли. Расчет объема опухоли осуществляли по формуле:

V=ав² (усл.ед).

Объем опухоли измеряли на 10,12 и 15 дни после перевивки. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Вещество I замедляет рост аденокарциномы яичников СаО-1.

Торможение роста опухоли на 10-й день измерения составило 42%, 45%, 52%, на 12-й день 43%, 49%, 45%, а на 15-й день 32%, 42%, 40% для режимов 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг соответственно. Данный эффект является пограничным эффектом для цитостатиков. Токсического действия препарата не обнаружено.

Приведенные выше примеры свидетельствуют о выраженной противоопухолевой активности вещества I

Изучение влияния вещества I на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов крови здоровых доноров.

Данное исследование проводилось в 2 этапа: изучение влияния препарата на бактерицидную активность нейтрофилов и воздействие вещества I на способность нейтрофилов к захвату частиц латекса.

Для выделения нейтрофилов из венозной крови здорового донора получали лейкоконцентрат по методике [Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии/Под редакцией профессора А.И.Карпищенко. - Санкт-Петербург: Интермедика, 2002. - 408 с.]. Его разводили физиологическим раствором рН 7,2 до концентрации 5×10⁴ лейкоцитарных клеток в 1 мкл. Полученную суспензию по 180 мкл разливали в лунки 24-х луночной плашки Falcon, получая, таким образом, 4 параллельных ряда по 6 лунок. Затем в лунки добавляли вещество I в различной концентрации действующего вещества (10^-3-10^-7 М) по 20 мкл, в последние в ряду лунки вносили 0,9% р-р хлорида натрия в качестве контроля.

Для изучения бактерицидной активности клеток вносили во все лунки по 10 мкл взвеси суточной агаровой дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae (2×10¹¹ кл/мл). Описанные манипуляции проводились с соблюдением условий стерильности.

Планшет с клетками термостатировали в течение 6 часов при 37°С. Далее удаляли пипеткой супернатант из лунок, из осадка готовили тонкие мазки, которые фиксировали в смеси Никифорова (5-10 мин) и окрашивали по Романовскому - Гимзе [В.С.Ронин, Г.М.Старобинец, Н.Л.Утевский/Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований. - М.: Медицина, 1977, 335 с.].

Учет результатов проводили следующим образом: при микроскопировании окрашенных мазков учитывают 100 нейтрофилов, в которых подсчитывают количество клеток с признаками фагоцитоза.

Поглотительную способность фагоцитов оценивают с помощью фагоцитарного показателя. Фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов.

Результаты исследований приведены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I достоверно повышает способность нейтрофилов к поглощению микроорганизмов по сравнению с контролем.

Кроме того, было проведено исследование влияния изучаемого препарата на способность нейтрофилов к захвату опсонизированных частиц латекса. Для этого в лунки с фагоцитами, активированными изучаемым препаратом, вносили по 10 мкл взвеси опсонизированных частиц латекса в физиологическом растворе (концентрация частиц составляла 5000 в 1 мл). Фагоциты инкубировали с латексом в течение 8 ч. Результаты проведенного теста представлены в таблице 5.

Из данных статистической обработки результатов таблиц 4 и 5 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I в действующих концентрациях 10^-4-10^-5 М достоверно повышает фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивая ФП по сравнению с контролем.

Бактериостатическая активность вещества I

В проведенной серии экспериментов была исследована чувствительность к веществу I штаммов микроорганизмов, выделенных из патологического материала от больных (экссудат, транссудат, кровь, моча, содержимое толстого кишечника, раневое отделяемое, слизь из зева) в послеоперационный период, и с предметов, окружающих больного в этот период - из воздуха, с предметов ухода за больными, с перевязочного материала, смывы с рук (санитарная группа микроорганизмов).

Видовой состав используемых штаммов бактериальных культур определялся исходя из того, что до недавнего времени основной причиной возникновения инфекций у больных являлись грамотрицательные бактерии, в частности псевдомонады, кишечная палочка, а в настоящее время все возрастающую отрицательную роль играют грамположительные бактерии (мецитиллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка, энтерококки и др.). Эти бактериальные штаммы характеризуются антибиотикорезистентностью к широкому спектру химиопрепаратов.

Бактериостатическое воздействие вещества I на рост штаммов микроорганизмов определяли согласно луночно - диффузной методике [В.S.Reisner, Gl. Woods, R.В.Thomson - Specium Processing in Manual of Clinical Microbiology - Washington, 1999, 64-104; Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. - Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. - 1999]

Вещество I характеризуется высокой бактериостатической активностью и широким спектром действия по отношению к большинству исследованных штаммов микроорганизмов.

Антитромбоцитагрегирующее действие вещества I

Вещество I оказывает активное антитромбоцитагрегирующее действие. Оно снижает агрегацию, вызываемую адреналином, АДФ и практически на 100% тормозит агрегацию, индуцируемую фактором агрегации тромбоцитов (ФАТ) и тромбином (см. фиг.4). Индекс антитромбоцитагрегирующей активности вещества I по тромбину и ФАТ равен 1×10^-11 М, что относит препарат к разряду активных антагонистов ФАТ.

Таким образом, к преимуществам вещества I можно отнести: высокую иммуномодулирующую и противоопухолевую активность, бактерицидное и антиагрегантное действие, низкую токсичность, высокую стабильность в водных растворах, простую технологию получения.

Результаты, представленные на фиг.1.1,1.2,1.3,1.4, свидетельствуют о стимулирующем влиянии вещества I на продукцию мононуклеарными клетками цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИФН-α и ФНО-α, обладающих иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами. Этот эффект выражен наиболее ярко при действующей концентрации вещества I в супернатанте в диапазоне 10^-4-10^-7 М.

Влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

На фиг. 2 показано стимулирующее влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров, выделенных согласно методике [«Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике.» под ред. В.В.Меньшикова: Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии». - М., «Медицина», 1987, с.307].

Количественное определение цитотоксической активности естественных киллерных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10^-4-10^-8 М) (контроль - с 0,9% NaCl), проводили с использованием МТТ-колориметрического теста по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И., ж. «Клиническая лабораторная диагностика», №2, 2000, с.20-23].

Наиболее оптимальные соотношения «опухолевая клетка/естественная киллерная клетка» - 1:10 и 1:5, при которых цитотоксическая активность МНК совместно инкубированных с тестируемым препаратом достигает наибольшего значения.

Максимальный, стабильно воспроизводимый эффект повышения противоопухолевой активности естественных киллеров отмечается при воздействии на МНК вещества I в диапазоне концентраций 10^-4-10^-6М.

Вещество I не оказывает прямого цитотоксического воздействия на изолированные мононуклеарные клетки крови и опухолевые клетки.

Изучение противоопухолевой активности вещества I

Исследование противоопухолевого эффекта проводили на мышах линии СВА и гибридах F1 весом 20-25 г. Животные содержались согласно «Правилам доклинических испытаний фармакологических препаратов» (PD 64-126-91).

Клетки опухоли Эрлиха вводили внутрибрюшинно (ip), а меланомы В 16 - подкожно (sc) в дозе 2 млн./мышь. Опытные и контрольные группы состояли из 6-10 животных. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Действие тестируемых образцов сравнивали с эффектом препарата Пролейкин, Голландия (ИЛ-2). Наблюдение осуществлялось в течение 1 мес после трансплантации опухоли. Оценку состояния животных производили визуально. Динамику роста опухолевой массы оценивали по весу животных.

Изучение противоопухолевой активности вещества I в отношении опухоли Эрлиха проводили на мышах линии СВА в дозе 0,05 мг/кг, а Пролейкин в дозе 10000 МЕ/ мышь. Тестируемые вещества вводили за 3-е сут. до и на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 17, 18 и 20 сут после трансплантации опухоли. В контрольной группе на 15-е сут осталась жива одна особь из 6. В группе мышей, получавших вещество I в указанной дозе, погибло 3 из 7 мышей. Среди животных, получавших Пролейкин к 20 сут. погибло 2 из 6 особей.