СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА (ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к пищевой промышленности, медицине и микробиологии и может быть использовано при оценке пищевых добавок, биологически активных и фармацевтических веществ.

За последние десятилетия создается огромное количество биологически активных пищевых добавок и фармацевтических препаратов. Поэтому в настоящее время актуален поиск экспресс-метода, позволяющего в короткий срок и достаточно объективно оценить биологическую активность этих препаратов.

Известен способ оценки биологической активности пищевых добавок и фармацевтических препаратов. При этом культуру клеток обрабатывают исследуемым и контрольным веществами, выдерживают 3-е суток в ростовой среде для их размножения и подсчитывают количество живых клеток с помощью оптического микроскопа, либо с помощью электронного счетчика (Р.Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983, с.93-96).

Недостатком данного способа, в первом случае, является его трудоемкость, т.к. требует многих часов наблюдения за клетками под микроскопом, а также недостаточная точность оценки активности препаратов, т.к. оценка зависит от опытности наблюдателя. А во втором случае, когда учет результатов ведется с помощью счетчика, недостатком является исходный отбор клеточной суспензии, который следует проводить с большой тщательностью, а также большой расход дорогостоящей ростовой среды.

Известен способ оценки активности биологически активных пищевых добавок и фармацевтических препаратов путем введения исследуемого вещества различной концентрации в питательную среду для роста бактерий и подсчет выросших колоний. А также известен метод, когда высевают на питательную среду выращивают бактерии, а затем на них помещаются кружки фильтровальной бумаги, пропитанные исследуемыми веществами, и по наличию или отсутствию зоны роста определяют биологическую активность исследуемого вещества (Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-МЕД., 2001).

Недостатком данного способа является его недостаточно объективная точность результатов, т.к. колонии можно только сфотографировать, а также большой расход питательных сред, т.к. для каждого исследуемого вещества готовится отдельная питательная среда.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения фагоцитарной и адгезивной активности клеток периферической крови (P.M.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов. Экологическая иммунология. - М., 1995, с.149-155). При этом исследуемое вещество вводят опытным мышам, через 24 часа отбирают у них перитонеальный экссудат, готовят лейкоцитарную суспензию и вносят ее в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов, в триплетах для каждого образца. После 60 мин инкубации надосадок забирают, а образовавшийся клеточный монослой трижды отмывают фосфатным буфером (PBS, рН 7.2-7.4). Полученные клетки фиксируют на пластике 96% этиловым спиртом в течение 30 мин, а затем окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 30 мин. Окрашенный клеточный монослой трижды отмывают от не включившегося красителя PBS, высушивают и растворяют, внутриклеточно расположенный краситель 40 мМ, раствором HCl в изопропаноле. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab") при референсной волне 405 нм. По величине оптической плотности определяют количество клеток.

Определение активности исследуемого вещества данным способом основано на влиянии биологической активности вещества на фагоцитарное звено иммунитета.

Недостатком данного способа является необходимость использовать животных, а также увеличение времени исследования.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в исключении указанных недостатков и в создании высокоэффективных способов определения биологической активности вещества, лишенного недостатков, свойственных прототипу, а также упрощении способов и повышении достоверности оценки.

Это достигается тем, что в способе определения биологической активности вещества по варианту №1, включающем приготовление препарата тест-объекта живого организма, добавление испытуемого вещества в препарат тест-объекта живого организма, инкубацию препарата тест-объекта живого организма, приготовление из него испытуемого раствора, определение его оптической плотности и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества, согласно изобретению в качестве препарата тест-объекта живого организма используют клеточную взвесь перевиваемой культуры Vero, в препарат тест-объекта живого организма добавляют контрольное вещество, испытуемое вещество добавляют в количестве 0.001-1.0 мг/мл, инкубируют в течение от 15 до 120 мин, получают контрольный и испытуемый растворы, перед приготовлением испытуемого раствора из препарата тест-объекта живого организма удаляют испытуемое вещество, вносят ростовую среду и выдерживают его в течение 6-7 суток при температуре 36-37°С для накопления клеточной массы, определяют показатели оптической плотности контрольного и испытуемого растворов, степень биологической активности испытуемого вещества выражают в виде индекса стимуляции, который рассчитывают по формуле:

I=Хэксп/Хк·100,

где I - индекс стимуляции;

Хэксп - средняя оптическая плотность испытуемого раствора;

Хк - средняя оптическая плотность контрольного раствора.

Клеточную взвесь перевиваемой культуры Vero непосредственно размещают в лунки плоскодонного планшета для иммунологических анализов в триплетах для каждого образца.

В качестве ростовой среды используют ростовую среду 199, а в качестве контрольного вещества используют физиологический раствор в количестве 10-20 мкл.

В способе определения биологической активности вещества (Вариант 2), включающем приготовление препарата тест-объекта живого организма, добавление испытуемого вещества в препарат тест-объекта живого организма, инкубацию препарата тест-объекта живого организма, приготовление из него испытуемого раствора, определение его оптической плотности и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества, согласно изобретению в качестве тест-объекта живого организма используют бактерии, в количестве 1 мл с концентрацией 10⁹ микробных клеток на мл, в препарат тест-объекта живого организма добавляют контрольное вещество, испытуемое вещество добавляют в количестве 0.1, 0.5 и 1.0 мг/мл, инкубируют в течение 15-45 мин, получают контрольный и испытуемый растворы, при этом перед приготовлением испытуемого раствора из препарата тест-объекта живого организма удаляют испытуемое вещество и инкубируют в течение 24 часов, определяют показатели оптической плотности контрольного и испытуемого растворов, а степень биологической активности испытуемого вещества выражают в виде индекса стимуляции, который рассчитывают по формуле

I=Хэксп/Хк·100,

где I - индекс стимуляции;

Хэксп - средняя оптическая плотность испытуемого раствора;

Хк - средняя оптическая плотность контрольного раствора.

В качестве контрольного вещества используют физиологический раствор.

Изобретение связано одним изобретательским замыслом.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как биологическую активность вещества, определяют с помощью микропроцессора по величине оптической плотности раствора.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.

Вариант 1. Для определения биологической активности исследуемых веществ клеточную взвесь перевиваемой культуры Vero в концентрации 200 тыс.кл/мл (подобная концентрация клеток оптимальна для их беспрепятственного размножения в лунке) вносят в лунки плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 20 мкл в лунку, в триплетах для каждого образца. Затем в клеточную взвесь вносят контрольное вещество (физиологический раствор) и в концентрациях 0,001-1.0 мг/мл и выдерживают в течение 15-120 мин. Экспериментально установлено, что при совместной инкубации действие вещества выявляется после 15 мин контакта и через 120 мин это действие не изменяется.

Для ограничения воздействия исследуемых препаратов на клеточную взвесь исследуемое вещество удаляют из рабочих проб тест-объекта живого организма двукратным промыванием монослоя. Для накопления клеточной массы в рабочие пробы вносят ростовую среду и выдерживают в термостате при 36-37°С течение 6-7 суток. В качестве ростовой среды используют среду 199 (производство НИИ ЭМ РАМН им. Гамалея, г.Москва) с добавлением 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота аминокислот (146,2 мг/л L-глутамина, 3,91 мг/мл L-аланина) и антибиотиков (0,2-1,5 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептоминсульфат).

Полученные клетки фиксируют на пластике 96% этиловым спиртом в течение 30 мин, а затем окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 30 мин. Окрашенный клеточный монослой трижды отмывают от невключившегося красителя раствором Хенкса без фенолового красного, высушивают, а имеющийся внутриклеточно расположенный краситель растворяют 40 мМ раствором HCl в изопропаноле. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре "Multiscan" при референсной волне 405 нм. Вычисляется средняя оптическая плотность у контрольного и рабочего препаратов. Полученную величину выражают в виде индекса стимуляции по формуле

I=Хэксп/Хк·100,

где I - индекс стимуляции;

Хэксп - средняя оптическая плотность опытного образца;

Хк - средняя оптическая плотность контрольного образца.

По изменению величины индекса стимуляции во всех пробах судят о биологической активности исследуемого вещества. При этом отсутствие изменений в контрольной пробе свидетельствует об отсутствии биологически активного вещества.

Увеличение или уменьшение процента индекса стимуляции свидетельствует о величине воздействия биологически активного вещества, которое способно оказывать влияние на процесс размножения клеток.

О степени биологической активности вещества судят по величине индекса стимуляции, которая при показателях выше 100 указывает на наличие стимулирующей активности испытуемого вещества, а ниже - ингибирующей.

При этом испытуемое вещество на уровне целого организма имеет действие то же, что и на уровне клетки. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о биологической активности исследуемого вещества.

Вариант 2. Для оценки биологической активности исследуемых веществ приготавливают препарат тест-объекта живого организма. Для этого на чашках Петри с агаром высевают бактерии в количестве 1 мл с концентрацией 10⁹ м.т. на мл и инкубируют для накопления бактериальной массы в течение 24-26 часов при температуре 37°С. Одновременно готовят субстрат-кружки фильтровальной бумаги d=0,5 см, пропитывают его исследуемым веществом с концентрацией 0,1, 0,5 и 1,0 мг/мл и физиологическим раствором, выкладывают на поверхность агара в одной и той же чашке Петри и выдерживают в течение 15-45 мин. После чего удаляют исследуемое вещество и инкубируют бактерии в течение 24 ч. Затем с чашки Петри вырезают участки агара, вместе с субстратом, площадью 1 см². Субстрат убирают и аккуратно, 1 мл физиологического раствора, смывают бактерии с одного участка агара и помещают в отдельную лунку плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 100 мкл в лунку, в триплетах для каждого образца. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре "Multiscan" при референсной волне 405 нм. Вычисляется средняя оптическая плотность у контрольного и рабочего препаратов. Полученную величину выражают в виде индекса стимуляции по формуле

I=Хэксп/Хк·100,

где I - индекс стимуляции;

Хэксп - средняя оптическая плотность опытного образца;

Хк - средняя оптическая плотность контрольного образца.

Вычисляется средняя оптическая плотность у контрольного и рабочего тест-объекта и затем индекс стимуляции в процентах, равный отношению рабочей к контролю, умноженный на 100.

По изменению величины индекса стимуляции судят о биологической активности исследуемого вещества. При этом отсутствие изменений в контрольной пробе свидетельствует об отсутствии биологически активного вещества.

Увеличение или уменьшение индекса стимуляции свидетельствует о величине воздействия биологически активного вещества.

О степени биологической активности вещества судят по величине индекса стимуляции, которая при показателях выше 100 указывает на наличие стимулирующей активности испытуемого вещества, а ниже - ингибирующей.

При этом испытуемое вещество на уровне целого организма имеет действие то же, что и на уровне клетки. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о биологической активности исследуемого вещества.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

Выписка из протокола №18. Оценивалась биологическая активность вещества фармацевтического препарата «Винбластин» производства «Годеон Зихтер А.О. Будапешт, Венгрия». Клеточную взвесь перевиваемой культуры Vero при концентрации 200 тыс.кл/мл вносят в 96 лунок плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 200 мкл в лунку, в триплетах для каждого образца. Испытуемое вещество в количестве 20 мкл растворяют в среде 199 концентрацией: 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 и добавляют к клеточной взвеси. В качестве контроля используют физиологический раствор в количестве 20 мкл. Пробы с фармацевтического препарата «Винбластин» и контрольные пробы инкубируют в течение 15, 30, 45, 60 и 120 мин, затем удаляют надосадок и вносят ростовую среду 199 (производство НИИ ЭМ РАМН им. Гамалея, г.Москва) с добавлением 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота аминокислот (146,2 мг/л L-глутамина, 3,91 мг/мл L-аланина) и антибиотиков (0,2-1,5 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептоминсульфат) и оставляют на 7 сут в термостате при 37°С для накопления клеточной массы. Полученные клетки промывали раствором Хенкса без фенолового красного, высушивали в течение 15 мин при 50°С абсолютным этанолом, а затем высушивали насухо в течение 10 мин при 50°С. В лунки вносили по 100 мкл красителя Романовского-Гимзе на 30 мин с последующей отмывкой раствором Хенкса не связавшегося красителя трижды, высушивали и растворяли, расположенный внутриклеточно краситель 40 мМ раствором HCl в изопропаноле. У полученного раствора измеряли оптическую плотность на микропроцессоре «MULTISCAN» при референсной волне 405 нм. Вычисляется средняя оптическая плотность у контрольного и испытуемого растворов. Полученную величину выражали в виде индекса стимуляции по формуле:

I=Хэксп/Хк·100

Параллельно просчитывали концентрацию клеток под микроскопом и также вычисляли индекс стимуляции.

Данные представлены в таблице 1.

Пример 2.

Выписка из протокола №19. Оценка биологической активности вещества фармацевтического препарата «Винкристин» производства «Годеон Зихтер А.О. Будапешт, Венгрия) производилась аналогично примеру 1. Данные представлены в таблице 2.

Пример 3.

Выписка из протокола №20. Оценка биологической активности вещества, зарегистрированного как пищевая добавка «Ритайд» (биологически активного вещества, полученного из морского беспозвоночного асцидии и произведенного OOO «Ковчег-3», г.Владивосток) производилась аналогично примеру 1.

Данные представлены в таблице 3.

Пример 4. Выписка из протокола 17/а. Оценивалась биологическая активность вещества фармацевтического препарата «Винкристин» (Годеон Зихтер А.О. Будапешт, Венгрия). Для определения биологической активности испытуемого вещества готовили 9 чашек Петри с агаром, на них высевали тест-объект живого организма - бактерии Staphylococcus aureus в количестве 1 мл с концентрацией 10⁹ м.т. на мл. В каждую чашку Петри на поверхность агара выкладывали субстраты, кружки фильтровальной бумаги ⊘=0,5 см, пропитанные испытуемым веществом «Винкристин» в концентрации 0.01, 0,05, 1,0 мг/мл в количестве трех на каждую точку и выдерживали в течение 15-45 мин при температуре 37°С. В качестве контроля использовали субстрат, пропитанный физиологическим раствором. После чего субстарты удаляли и инкубировали бактерии в течение 24 ч. На местах контакта бактерий с испытуемым веществом и контрольным веществом (физиологическим раствором) вырезали участки агара, площадью 1 см² и с каждого участка аккуратно, 1 мл физиологического раствора, смывали все бактерии, затем их по 100 мкл разносили в лунки плоскодонного планшета для иммунологических реакций, в триплетах для каждого образца.

С помощью микропроцессора "Multiscan" измеряли оптическую плотность растворов при референсной волне 405 нм. Полученную величину выражали в виде индекса стимуляции по формуле

I=Хэксп/Хк·100

Цифры составили: 15 мин - 95±0,08; 30 мин - 90±0,07; 45 мин - 40±0,05.

Дополнительно осуществляли визуальный учет роста колоний бактерий, обработанных исследуемым препаратом. Отсутствие воздействия испытуемого вещества обозначалось как «+», наличие - «-». При контакте с бактериями - 15 и 30 минут отмечался рост бактерий - «-». При контакте 45 мин он отсутствовал - «+».При контакте контрольного вещества с бактериями он отсутствовал.

По сравнению с общепринятым способом определения бактериостатического действия препарата предлагаемый способ позволяет более точно и объективно оценить результаты биологического действия веществ.

Остальная часть эксперимента с другими видами бактерий сведена в таблицу 4.

Пример 5. Выписка из протокола 17/б. Аналогично примеру 4. Оценивалась биологическая активность препарата «Винбластин» (Годеон Зихтер А.О. Будапешт, Венгрия). Данные представлены в таблице 5.

Пример 6. Выписка из протокола 17/в. Аналогично примеру 4 проводилась оценка биологической активности вещества, зарегистрированного как пищевая добавка «Ритайд» (биологически активного вещества, полученного из морского беспозвоночного асцидии и произведенного ООО «Ковчег-3», г.Владивосток). Данные представлены в таблице 6.