Противотуберкулезное средство на основе n-[4-(4-аминобензсульфанил)-фенил]-2-бензоиламинобензамида, обладающее низкой токсичностью

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии и касается соединений, которые могут быть использованы для создания лекарственных средств активных в отношении Mycobacterium tuberculosis, обладающих низкой токсичностью.

Предшествующий уровень техники.

Известно, что для лечения туберкулеза используют препараты: изониазид, этионамид, а также антибиотики рифампицин, клофазимин, офлоксацин, моноциклин [http://apps.who.int/medicinedocs/en/d/Jh2988e/]. Рекомендуемые ВОЗ схемы лечения туберкулеза включают препарат 4,4'-димаинодифенилсульфон («Дапсон»), выбранный нами в качестве прототипа. Однако этот препарат обладает значительными побочными эффектами, среди которых метгемоглобинемия, гемолитическая анемия, гипопластическая анемия с летальным исходом. Длительное использование 4,4'-димаинодифенилсульфон приводит к появлению резистентных штаммов, что требует поиска высокоэффективных и малотоксичных лекарственных средств. Соответственно к основным недостаткам этого препарата можно отнести высокую токсичность, и длительность курса терапии. Кроме того высокий риск неблагоприятного действия на организм сопряжен и с применением «классических» противотуберкулезных средств I ряда - изониазида и рифампицина.

Вследствие этого актуальной задачей является поиск новых соединений, обладающих выраженной противотуберкулезной активностью в сочетании с низкой токсичностью.

N-[4-(4-аминобензсульфанил)-фенил]-2-бензоиламинобензамид (соединение ПЯТd1) обладает бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении M.lufu, в сочетании с низкой токсичностью (патент РФ №2638926), что делает данное соединение перспективным для изучения на предмет антибактериальной активностью в отношении M.tuberculosis.

Целью изобретения является поиск эффективного и малотоксичного антимикобактериального средства для лечения туберкулеза.

Оценка специфической фармакологической активности

Оценку специфической антимикобактериальной активности соединения ПЯТd1 проводили с применением in vitro и in vivo методов.

Пример 1. Активность соединения ПЯТd1 исследовали in vitro в отношении M.tuberculosis H₃₇Rv - чувствительный к применяемым противотуберкулезным препаратам и M.tuberculosis MS-115 - мультирезистентный штамм (штаммы предоставлены ЦНИИТ) методом серийных разведений. Штаммы высевали в среду Школьниковой, содержащую соответствующую концентрацию соединения и/или препаратов сравнения. Параллельно ставили контроли без воздействия и контроль чистоты среды (без культур Mtb). Инкубацию проводили 14 дней при t=37°C, далее пробирки центрифугировали, супернатант отбрасывали, осадок дважды стерильно отмывали, затем пересевали (200 мкл) на твердую питательную среду Левенштейна-Йенсена. Через 30 суток оценивали характер и степень роста культур [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: методич. рекомендации./Под ред. А.Н. Миронова. Москва: Гриф и К, 2012, 963-978 с].

Результаты показали, что соединение ПЯТd1 способно активно подавлять рост M.tuberculosis в диапазоне 2,0 мкг/мл - 0,25 мкг/кг. Так как к активным препаратам относятся соединения, вызывающие 95% ингибирование роста микобактерий, соединение ПЯТd1 может рассматриваться как перспективное. Особенно важно, что ПЯТd1 демонстрирует высокую активность в отношении мультирезистентного штамма, а его действующие концентрации являются достаточно низкими. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Исследование in vivo выполнено на 45 беспородных белых мышах (самцы) весом 21-25 г. Все животные были разделены на группы: 1 - не зараженные (5); 2 - зараженные M.tuberculosis H₃₇Rv, не получавшие лечения (10); 3 - зараженные M.tuberculosis H₃₇Rv, получавшие лечение соединением ПЯТd1 (10), 4 - зараженные M.tuberculosis H₃₇Rv, получавшие изониазид (ОАО «Фармасинтез» Россия) (10); 5 - зараженные M.tuberculosis H₃₇Rv, получавшие рифампицин (ОАО «Фармасинтез» Россия) (10). Соединения и препараты вводили через две недели после заражения один раз в день per os в дозе 50 мг/кг. Заражение животных осуществляли внутривенно дозой 5X10⁶ микобактерий в 0,5 мл физиологического раствора.

С начала эксперимента осуществляли мониторинг за поведением, внешним видом, весом, выживаемостью животных. По истечении двух месяцев с момента заражения часть животные были выведены из эксперимента путем дислокации шейных позвонков. Забирали кровь, исследовали лейкоцитарную формулу в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Животных вскрывали, проводили макроскопическую оценку внутренних органов [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: методич. рекомендации./Под ред. А.Н. Миронова. Москва: Гриф и К, 2012, 963-978 с].

Все манипуляции с животными осуществляли согласно правилам Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.))

Результаты обрабатывали статистически с применением t-критерия Стьюдента.

Наблюдение за животными свидетельствовало, что по истечении 2-х недель с момента заражения у животных тускнела шерсть, у ряда особей наблюдали ее прорежение на отдельных участках, мыши становились менее активными. В контрольной группе, не получавшей лечения, пали 30% мышей. В группах, получавших соединения и препараты, падежа животных не наблюдали. По истечении двух месяцев с момента заражения по 5 мышей из каждой группы были взвешены и выведены из эксперимента. Животные, не получавшие лечения, статистически достоверно теряли в весе: относительно интактных и получавших ПЯТd1 мышей. На фоне лечения у мышей наблюдали активизацию пищевого поведения. В группе, получавших ПЯТd1 (более выражено) и рифампицин улучшался внешний вид животных. Данные представленные в таблице 2.

Исследование лейкоцитарной формулы свидетельствовало, что в крови всех зараженных животных относительно интактных мышей наблюдается значительное преобладание нейтрофилов, в частности, молодых палочкоядерных форм. Наиболее выраженный сдвиг «влево» выявлен в группах, не получавшей лечение и получавшей изониазид. Статистически достоверно более низкое содержание палочкоядерных форм отмечается в сравнении с нелечеными животными в группах, получавших ПЯТd1 и рифампицин, при этом под действием ПЯТd1 данный показатель значительно ниже. Данные представлены в таблице 3.

При макроскопическом исследовании пораженность паренхиматозных органов в группе без лечения составила в среднем 1,8±0,37 баллов, что статистически достоверно было выше в сравнении с данным показателем в группах, получавших соединение ПЯТd1 (0,4±0,24) и рифампицин (0,6±0,24). В группе, получавшей изониазид, данный показатель был также ниже, но статистически достоверных отличий не выявлено.

Таким образом, результаты проведенного исследования наглядно демонстрируют, что применение соединения ПЯТd1 в условиях микобактериального инфицирования животных сопряжено с высокой эффективностью, выражаемой в стабильности веса животных за наблюдаемый период, улучшении их внешнего вида, выживаемости, значительно меньших изменениях в лейкоцитарной формуле и статистически достоверно низком индексе поражения паренхиматозных органов.

Исследование хронической токсичности

Оценку хронической токсичности соединения ПЯТd1 производили при 30-ти дневном пероральном введении данного соединения в дозе 50 мг/кг крысам линии Wistar обоего пола с исходной массой тела 200 -210 грамм (20 самцов и 20 самок), путем определения изменения массового коэффициента внутренних органов экспериментальных животных (общетоксическое действие) и их поведения в тесте «открытое поле», что характеризует нейротоксическое действие патентуемого соединения. Результаты обрабатывали статистически с применением t-критерия Стьюдента.

Пример 3. Определение массового коэффициента внутренних органов проводили после эвтаназии животных методом декапитации под наркозом. Производили вскрытие крыс и отделение внутренних органов, которые затем взвешивали. Искомый массовый коэффициент равнялся частному от деления полученной массы органа на вес животного в граммах.

На фоне хронического введения животным обоего пола соединения ПЯТd1 статистически значимых изменений массовых коэффициентов внутренних органов не выявлено. Результаты представлены в таблице 4.

Пример 4. Тест «Открытое поле» - методика основана на проявлении у крыс ориентировочно-исследовательской и защитно-оборонительной поведенческих реакций. В период до тестирования, животные находились в тихом, слабо освещенном помещении, исключались: перегруппировка, кормление, взятие в руки и другие активные манипуляции. Установка для проведения теста представляет собой круглую площадку диаметром 97 см, в которой пол разделен на 19 секторов и имеет 12 отверстий диаметром 2 см. [Установка «Открытое поле» (НПК Открытая Наука, Россия)] Тестирование проводили в течение 3 мин, помещая животных в освещаемый центр установки. Фиксировали: уринацию, дефекацию, груминг, фризингу, количество пристеночных и свободных стоек, количество пробегов и переходов из сегмента в сегмент. Показатели группировали по функциональным признакам: «эмоциональное напряжение» и «двигательная активность» (Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: методич. рекомендации./Под ред. Р.У. Хабриева. Москва: ОАО Издательство «Медицина», 2005, 258 с.])

Результаты исследования показали отсутствие нейротоксического влияния соединения ПЯТd1, поскольку значимых отличий в двигательной и эмоциональной активности у животных, получавших ПЯТd1, и контрольными крысами не установлено. Данные представлены в таблице 5.

Примечание: * - р≤0,05 относительно не леченных мышеи.

Примечание: * - р<≤0,05 относительно не леченных мышей; ∧ - относительно интактных мышей; + - р≤0,05 - между группами «ПЯТd1» и «Рифампицин».