УЛУЧШЕННЫЙ ВЕКТОР, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ TOLL-ПОДОБНЫЙ РЕЦЕПТОР И АГОНИСТ, И ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПИИ РАКА

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к способам лечения рака.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Toll-подобные рецепторы отвечают за распознавание наиболее распространенных структур бактериальных и вирусных патогенов. Их активация приводит к усилению врожденного и впоследствии приобретенного иммунного ответа. Ключевым фактором эффективного иммунного ответа являются клетки иммунной системы с рецепторами, которые распознают местонахождение антигенов. Именно по этой причине иммунизация включает применение адъювантов различного типа. Несмотря на то экспрессию опухолеспецифических антигенов в большинство опухолей, в них используется ряд механизмов, позволяющих им избегать иммунного распознавания. Недавно на мышиных моделях продемонстрировано, что в результате активации TLR5 его лигандом и агонистом, т.е. бактериальным флагеллином, индуцируется противоопухолевый эффект в отношении тех опухолей, которые экспрессируют функциональные TLR5. Это открывает широкие возможности для применения агонистов TLR5 в иммунотерапии рака. Существует два главных препятствия на пути осуществления этой идеи на практике. Первым из них является редкая встречаемость опухолей, экспрессирующих функциональные TLR5, что ограничивает применение этого подхода лишь небольшой подгруппой опухолей. Во-вторых, системное введение агониста TLR5 приводит к активации передачи сигналов TLR5 во всех клетках, которые имеют функциональный рецептор, что делает ответ не сфокусированным и не опухолеспецифическим. Следовательно, в технике существует потребность в механизме или способе аутокринной активации передачи сигналов TLR в инфицированных или опухолевых клетках с минимальным системным эффектом и возможностью тем самым привлекать естественный иммунный ответ конкретно к инфицированной клетке или опухоли. Также существует потребность в создании усовершенствованных способов доставки TLR5 и его лиганда в раковые клетки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] В изобретении предложен вектор, содержащий первую и вторую нуклеиновые кислоты. Первая нуклеиновая кислота может кодировать toll-подобный рецептор, а вторая нуклеиновая кислота может кодировать агонист toll-подобного рецептора. Первая нуклеиновая кислота также может кодировать секретируемую форму toll-подобного рецептора. Toll-подобным рецептором может являться TLR5. Последовательность TLR5 может представлять собой последовательность SEQ ID NO: 99.

[0004] Агонистом toll-подобного рецептора может являться флагеллин. Флагеллин может представлять собой секретируемую форму флагеллина. Последовательность флагеллина может представлять собой последовательность SEQ ID NO: 101. Флагеллин также может быть не гликозилирован и может содержать последовательность SEQ ID NO: 102.

[0005] Вектором может являться вектор экспрессии, который может являться экспрессирующим вектором млекопитающих. Источником экспрессии вектора может являться аденовирус, лентивирус или липосома. Вектор может содержать промотер убиквитина С, который может быть оперативно связан со второй нуклеиновой кислотой.

[0006] В изобретении также предложен способ лечения рака у млекопитающих, который может включать введение содержащего вектор агента нуждающемуся в этом млекопитающему. Раковые клетки могут характеризоваться высоким уровнем экспрессии рецепторного белка вируса Коксаки и аденовируса. Раком может являться рак мочевого пузыря, простаты, тонкого кишечника, щитовидной железы, яичка или толстой кишки. Рак может представлять собой опухоль. Агент может вводиться извне опухоли. Агент может вводиться непосредственно в опухоль. Агент также может вводиться в комбинации с иммуностимулятором, которым может являться гормон роста, пролактин или витамин D. Гормоном роста может являться соматотропин. Агент может вводиться в комбинации с цитокином, которым может являться фактор стволовых клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] На фиг. 1А-1С изображены схематические карты аденовирусных векторов, экспрессирующих TLR5, CBLB502 и их комбинацию (TLR5 + CBLB502). Лидерной последовательностью Sseap-502 на фиг. 1С является SEQ ID NO: 100.

[0008] На фиг. 2 представлен относительный объем опухолей у мышей в течение нескольких дней на примере опухолевых клеток (А549), трансдуцированных контрольным вектором (без TLR5) или вектором, экспрессирующим TLR5, при этом в качестве лечения мыши в течение трех дней получали CBLB502 или PBS.

[0009] На фиг. 3 отображено подавление роста опухоли путем введения аденовируса, содержащего вектор, одновременно экспрессирующий CBLB502 и toll-подобный рецептор, при этом аденовирус вводили в карциному толстой кишки сингенным мышам СТ26, и проводили исследование цис- и транс-эффектов аденовирусных векторных конструкций.

[0010] На фиг. 4 показана структура доменов бактериального флагеллина; след Са основы, распределение гидрофобной сердцевины и информация о структуре F41; четыре различные гидрофобные сердцевины, которые определяют домены D1, D2a, D2b и D3. Все гидрофобные атомы в боковой цепи показаны с Са основой. Атомы в боковой цепи закодированы различными цветами: Ala - желтым; Leu, Ilе или Val - оранжевым; Phe и Tyr - пурпурным (атомы углерода) и красным (атомы кислорода); «с» означает положение и область различных структурных свойств в аминокислотной последовательности флагеллина. Сверху вниз показано: фрагмент F41 - синим цветом; три бета-складки - коричневым цветом; распределение вторичной структуры с альфа-спиралью - желтым цветом, бета-структура - зеленым цветом, бета-поворот - пурпурным цветом; галочка у каждого 50-го остатка - синим цветом; домены D0, D1, D2 и D3; область осевого контакта между субъединицами в протоэлементе - голубым цветом; высококонсервативная аминокислотная последовательность - красным цветом, вариабельная область - фиолетовым цветом; точечные мутации в F41, которые продуцируют элементы различных суперспиралей. Буквами внизу обозначена морфология мутантных элементов: L (D107E, R124A, R124S, G426A), прямая L-типа; R (A449V), прямая R-типа; С (D313Y, A414V, A427V, N433D), curly33.

[0011] На фиг. 5 схематически представлены домены флагеллина Salmonella, его фрагменты и их взаимодействие с TLR5. Темными штрихами обозначены области гена флагеллина, используемого для построения фрагментов, содержащих А, В, С, А' и В'.

[0012] На фиг. 6 показаны производные флагеллина; структура домена и приблизительные границы (координаты аминокислот) отдельных производных флагеллина (справа). Ген флагеллина FliC штамма Salmonella dublin закодирован в 505 аминокислотах (аа).

[0013] На фиг. 7 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности для следующих вариантов флагеллина: АА' (SEQ ID NO: 7-8), АВ' (SEQ ID NO: 9-10), BA' (SEQ ID NO: 11-12), BB' (SEQ ID NO: 13-14), CA' (SEQ ID NO: 15-16), CB' (SEQ ID NO: 17-18), A (SEQ ID NO: 19-20), В (SEQ ID NO: 21-22), С (SEQ ID NO: 23-24), GST-A' (SEQ ID NO: 25-26), GST-B' (SEQ ID NO: 27-28), AA'n1-170 (SEQ ID NO: 29-30), AA'n1-163 (SEQ ID NO: 33-34), AA'n54-170 (SEQ ID NO: 31-32), AA'n54-163 (SEQ ID NO: 335-36), AB'n1-170 (SEQ ID NO: 37-38), AB'n1-163 (SEQ ID NO: 39-40), AA'n1-129 (SEQ ID NO: 41-42), AA'n54-129 (SEQ ID NO: 43-44), AB'n1-129 (SEQ ID NO: 45-46), AB'n54-129 (SEQ ID NO: 47-48), AA'n1-100 (SEQ ID NO: 49-50), AB'n1-100 (SEQ ID NO: 51-52), AA'n1-70 (SEQ ID NO: 53-54) и AB'n1-70 (SEQ ID NO: 55-56). Лидерная последовательность pRSETb обозначена курсивом (лидер включает Met, который также представляет собой аминокислоту 1 FliC). N-концевая константная область выделена подчеркиванием. Линкерная аминокислотная последовательность выделена жирным шрифтом. С-концевая константная область выделена подчеркиванием. GST, если она присутствует, выделена ярким шрифтом.

[0014] На фиг. 8А и 8В представлено сравнение консервативных N-концевых (фиг. 8А) и С-концевых (фиг. 8В) последовательностей у бактерий 21 вида. 13 консервативных аминокислот, важных для активности TLR5, выделены штриховкой. Указаны идентификационные номера аминокислотных последовательностей в TrEMBL (первая буква = Q) или Swiss-Prot (первая буква = Р). Для каждого из 21 вида бактерий N-концевыми последовательностями являются SEQ ID NOs: 57-77, соответственно, а С-концевыми последовательностями являются SEQ ID NOs: 78-98, соответственно.

[0015] На фиг. 9 показана аминокислотная последовательность toll-подобного рецептора 5 человека (SEQ ID NO: 99).

[0016] На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность одного из вариантов флагеллина, известного как CBLB502 (SEQ ID NO: 101) с четырьмя сайтами гликозилирования, в которых аспарагин (N) находится в положениях, соответствующих положениям 19, 101, 128 и 475 в последовательности SEQ ID NO: 1.

[0017] На фиг. 11 представлена эффективность заражения аденовирусом, содержащим вектор, коэкспрессирующий CBLB502 и toll-подобный рецептор в раковых клетках. На фиг. 11А показана эффективность заражения Ad-mCherry (флюоресценция во втором и четвертом ряду), определенная в линии опухолевых клеток простаты мышей (TRAMP-C2) через 24 и 48 часов после заражения. В верхней части фиг. 11А показана множественность заражения (MOI, число вирусных частиц на клетку). На фиг. 11В показана экспрессия CAR в клетках С2 (иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител против CAR).

[0018] На фиг. 12 показана экспрессия CAR в здоровых и опухолевых клетках простаты человека. Часть микропанели опухоли простаты человека (Т - опухоль, N - образцы здоровой ткани простаты) окрашена с использованием антител к CAR).

[0019] На фиг. 13 показано иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител к CAR. Связанный с мембраной рецептор к CAR обозначен стрелками. Фиг. 13А - MOSEC (карцинома яичника), фиг. 13В - СТ26 (карцинома толстой кишки).

[0020] На фиг. 14 показан анализ методом вестерн-блоттинга клеток MOSEC (карциномы яичника у мышей), инфицированных аденовирусом, экспрессирующим флагеллин и TLR5. На фиг. 14А показано обнаружение с помощью антител к TLR5: 1 - неинфицированные клетки, 2 - инфицированные клетки. На фиг. 14В показано обнаружение с помощью антител к CBLB502: 1 - необработанный лизат инфицированных клеток, 2 - лизат инфицированных клеток, обработанных смесью ферментов дегликозилирования (полученных от New England Biolabs).

[0021] На фиг. 15 схематически представлены аденовирусные конструкции; Р - промотер, Т - терминатор транскрипции. На фиг. 15А показано строение конструкции 1-го поколения под названием Mobilan.

[0022] На фиг. 16 показана экспрессия CBLB502 (фиг. 16А) и hTLR5 (фиг. 16В) в клетках НЕК293, инфицированных оригинальным Mobilan и его производными (фиг. 16В-D).

[0023] На фиг. 17 показана выработка CBLB502 репортерными клетками, обработанными исходными растворами Mobilan UbiC-1 и UbiC-2. Для обнаружения CBLB502 в клеточных культурах HEK293-hTLR5-LacZ через 15 часов после заражения двумя видами Mobilan применяли метод иммуноферметного анализа ELISA с захватом. Измеряли фракцию секретированного CBLB502 (фиг. 17А) в супернатантах клеточной культуры перед добавлением буфера для лизиса клеток; после лизиса отбирали другую серию проб для исследования, в которую входили как секретированный, так и внутриклеточный CBLB502 (фиг. 17В).

[0024] На фиг. 18 представлено сравнение исходных растворов аденовируса Mobilan методом анализа активации in vitro репортерных клеток. Разводили два отдельно полученных исходных раствора Mobilan UbiC-1 и UbiC-2 до получения одинаковых титров согласно их спецификациям и испытывали на активацию репортерных клеток НЕK293-hTLR5-LacZ.

[0025] На фиг. 19 представлены результаты экспериментов, проведенных на подкожно выращенных опухолях 4Т1, в которые в день 0 путем инъекции вводили указанные испытываемые вирусы и контрольные вещества (контроль - буфер, M-Cherry - аденовирус, экспрессирующий флуоресцентный белок). На фиг. 19А показан процент выживших животных (объем опухоли менее 2000 мм³).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0026] Присутствие toll-подобного рецептора, такого как toll-подобный рецептор 5 (TLR5), в комбинации с агонистом toll-подобного рецептора, таким как флагеллин, приводит к возникновению цис- и транс-эффектов, в которые вовлечены клетки, участвующие во врожденном (цис-эффект) и приобретенном (транс-эффект) специфическом иммунном ответе, приводящем к уничтожению раковых клеток и инфицированных патогеном клеток путем NF-κВ-опосредованного апоптоза. Авторами изобретения неожиданно обнаружено, что при экспрессии в клетках млекопитающих негликозилированной мутантной формы флагеллина в комбинации с TLR5, он проявляет значительно бóльшую специфическую активность, чем гликозилированные формы флагеллина. Авторами изобретения также обнаружено, что использование промотора убиквитина С (UbiC) для стимуляции экспрессии аденовирусным вектором флагеллина или экспрессии аденовирусным вектором и флагеллина, и TLR5 неожиданно повышает эффективность лечения рака. Кроме того, авторами изобретения обнаружено, что совместное применение флагеллина и TLR5, экспрессируемых аденовирусным вектором, для лечения раковых заболеваний с высоким уровнем экспрессии рецептора вируса Коксаки и аденовируса (CAR) неожиданно повышает эффективность лечения.

1. Определения

[0027] Используемая в настоящем изобретении терминология имеет целью исключительно описание конкретных вариантов осуществления изобретения, а не его ограничение. Используемая в описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа включает форму множественного числа, если контекстом явно не диктуется иное.

[0028] В приведенные числовые диапазоны в прямой форме входит каждое промежуточное число с аналогичной степенью точности. Например, в диапазон 6-9 входят числа 7 и 8 помимо 6 и 9, а в диапазон 6,0-7,0 входят числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.

[0029] Термин "вводить" может относиться к разовой дозе или множеству доз какого-либо средства.

[0030] Термин "аналог" применительно к пептиду или полипептиду может означать пептид или полипептид, содержащий одну или несколько нестандартных аминокислот или других структурных разновидностей типового набора аминокислот.

[0031] Термин "антитело" может означать антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или их фрагменты или производные, включая Fab, F(ab')2, Fd и одноцепочные антитела, диатела, биспецифические антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антителом может являться моноклональное антитело, поликлональное антитело, аффинно-очищенное антитело или их смеси, которые проявляют достаточную связывающую специфичность в отношении желаемого эпитопа или выделенной из него последовательности. Антителом также может являться химерное антитело. Антитело может быть получено путем присоединения одного или нескольких химических, пептидных или полипептидных фрагментов, известных из техники. Антитело может быть конъюгировано с химическим фрагментом.

[0032] Термин "производное" может означать пептид или полипептид, отличающийся чем-либо помимо первичной структуры (из аминокислот и аналогов аминокислот). Производные могут отличаться гликозилированием - одной из форм посттрансляционной модификации. Например, у пептидов или полипептидов могут демонстрировать профили гликозилирования, обусловленные экспрессией в гетерологичных системах. Такие пептиды или полипептиды являются производными, в соответствии с настоящим изобретением, если у них сохранен, по меньшей мере, один тип биологической активности. Другие производные могут включать гибридные пептиды или гибридные полипептиды, имеющие ковалентно модифицированный N- или С-конец, пегилированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, связанные с липидными фрагментами, алкилированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, связанные с другими пептидами, полипептидами или химическими веществами посредством функциональной группы боковой цепи аминокислоты, и дополнительные модификации, известные из техники.

[0033] Термин "фрагмент" может означать часть исходного пептида или полипептида.

[0034] Термин "гомолог" может означать пептид или полипептид, имеющий общего эволюционного предшественника.

[0035] Термин "лидерная последовательность" может означать нуклеиновую кислоту, кодирующую любую пептидную последовательность, которая связана с рассматриваемым пептидом или полипептидом и транслирует его, что позволяет рассматриваемому пептиду или полипептиду проходить по надлежащему пути через эндоплазматическую сеть эукариотической клетки и комплексы Гольджи для внеклеточной секреции из клеточной мембраны. Лидерная пептидная последовательность может быть выделена из щелочной фосфатазы. Лидерная последовательность может иметь следующую последовательность ДНК: atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc.

[0036] Термин "липосома" может означать очень маленький пузырек (везикулу) из того же материала, что и клеточная мембрана. Липосома может быть наполнена лекарственными препаратами и использоваться для доставки лекарственных препаратов против рака и других болезней. Липосома может быть наполнена вектором. Липосомная мембрана может состоять из фосфолипидов, которые являются молекулами, имеющими головную группу и хвостовую группу. Головная группа липосомы может иметь положительное сродство к воде, а ее хвостовая группа, которая состоит из длинной углеводородной цепи, имеет отрицательное сродство к воде. Хвостовые группы могут отталкиваться водой и выстраиваться в линию с образованием поверхности вне воды. Липиды в плазматической мембране могут представлять собой, главным образом, фосфолипиды, такие как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин. Липосомы могут состоять из природных фосфолипидов со смешанными липидными цепями (как яичный фосфатидилэтаноламин) или из чистых поверхностно-активных компонентов, таких как DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин).

[0037] Термин "пептид" или "полипептид" может означать связанную последовательность аминокислот, при этом он может, быть естественного происхождения, синтетическим или представлять собой модификацию или комбинацию натурального и синтетического пептида или полипептида.

[0038] Термин "преимущественно идентичный" может означать, что первая и вторая аминокислотные последовательности состоят из, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 аминокислот.

[0039] Каждым из терминов "лечебный", "лечение" или "лечить" может обозначаться облегчение, подавление, сдерживание, устранение, предотвращение или замедление проявления симптомов, клинических признаков или лежащей в их основе патологии состояния или заболевания на временной или постоянной основе. Предотвращение состояния или заболевания включает введение субъекту средства согласно настоящему изобретению до начала болезни. Подавление состояния или заболевания включает введение субъекту средства согласно настоящему изобретению после возбуждения состояния или заболевания, но до его клинического проявления. Подавление состояния или заболевания включает введение субъекту средства согласно настоящему изобретению после клинического проявления болезни.

[0040] Термин "вариант" может означать пептид или полипептид, аминокислотная последовательность которого отличается инсерцией, делецией или консервативным замещением аминокислот, но который сохраняет биологическую активность, по меньшей мере, одного типа. Типичные примеры "биологической активности" включают способность связывать toll-подобный рецептор и быть связанным специфическим антителом. Вариант может также означать белок, аминокислотная последовательность которого преимущественно идентична исходному белку, аминокислотная последовательность которого сохраняет биологическую активность, по меньшей мере, одного типа. Принято считать, что консервативное замещение аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой с идентичными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей) обычно предусматривает незначительное изменение. Эти незначительные изменения можно идентифицировать, исходя отчасти из индекса гидрофобности аминокислот, как это известно из техники (смотри Kyte и др., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на ее предполагаемой гидрофобности и заряде. Из техники известно, что аминокислоты со сходными индексами гидрофобности могут быть замещены и сохранять при этом функцию белка. Согласно одной из особенностей замещают аминокислоты, имеющие индексы гидрофобности ±2. Гидрофильность аминокислот также может использоваться для выявления замещений, которые приводят к сохранению белками биологической функции. Учет гидрофильности аминокислот применительно к пептиду позволяет рассчитать наибольшую среднюю локальную гидрофильность такого пептида, что является полезным показателем, который, как известно, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью (смотри патент US 4554101, в порядке ссылки целиком включенный в настоящую заявку). Замещение аминокислот, имеющих сходные показатели гидрофильности, может приводить к сохранению пептидами биологической активности, например, иммуногенности, как это известно из техники. Замещения могут осуществляться аминокислотами, имеющими показатели гидрофильности с отклонением в пределах ±2 друг от друга. Как индекс гидрофобности, так и показатель гидрофильности аминокислот находятся под влиянием конкретной боковой цепи такой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением предполагается, что замещения аминокислот, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот, в частности, боковых цепей этих аминокислот, которое выявлено на основании гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и других свойств.

[0041] Термин "вектор" может означать последовательность нуклеиновых кислот, содержащую источник репликации. Вектором может являться плазмида, дрожжи или искусственная хромосома млекопитающего. Вектором может являться РНК- или ДНК- вектор. Вектором может являться либо самореплицирующийся экстрахромосомный вектор, или вектор, который интегрируется в геном хозяина.

3. Toll-подобный рецептор

[0042] В изобретении предложен toll-подобный рецептор (TLR), который может представлять собой образ-распознающий рецептор (PRR, от английского - pattern recognition receptor) одного из типов. Toll-подобный рецептор может распознавать молекулы, которые являются консервативными молекулярными продуктами, выделенными из патогенов, которые включают грамположительные, грамотрицательные бактерии, грибки и вирусы, но являются отличимыми от молекул хозяина и собирательно именуются молекулярной структурой, ассоциированной с патогеном (РАМР, от английского - pathogen-associated molecular patterns). Toll-подобный рецептор также может распознавать эндогенные молекулы, которые высвобождаются из поврежденных или умирающих клеток и собирательно именуются молекулярной структурой, ассоциированной с повреждением (DAMP, от английского - damage-associated molecular pattern). РАМР или DAMP может являться агонистом toll-подобного рецептора, как дополнительно описано далее. Toll-подобный рецептор может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное, которое привлекает адаптерные молекулы в пределах цитоплазмы клеток с целью распространения сигнала. Источником происхождения toll-подобного рецептора может являться человек или млекопитающее другого вида, такое как резус-обезьяна, мышь или крыса. Toll-подобный рецептор может быть, по меньшей мере, на 30-99% идентичен toll-подобному рецептору, который привлекает адапторные молекулы в цитоплазме клеток с целью распространения сигнала.

[0043] Toll-подобным рецептором может являться один из 10-15 типов toll-подобных рецепторов, которые предположительно существуют в организме млекопитающих большинства видов. Toll-подобным рецептором может являться один из 13 toll-подобных рецепторов (называемых просто TLR1-TLR13), которые выявлены как у человека, так и у мышей, или эквивалентная форма, которая обнаружена у млекопитающих других видов. Toll-подобным рецептором может являться один из 11 TLR (TLR1-TLR11), выявленных у человека.

[0044] Toll-подобный рецептор может быть экспрессирован иммунными клетками различных типов, и он может находиться на поверхности клеток или в клеточной цитоплазме. Toll-подобный рецептор могут экспрессировать раковые клетки. Toll-подобный рецептор могут экспрессировать нормальные эпителиальные клетки пищеварительной системы, нормальные кератиноциты, эпителиальные клетки легочных альвеол и бронхов, а также эпителиальные клетки женских половых путей. Эти клетки, выстилающие орган, могут служить первой линией обороны от инвазии микроорганизмов, а toll-подобные рецепторы, экспрессируемые эпителиальными клетками, могут играть решающую роль в регулировании пролиферации и апоптоза.

[0045] Экспрессирующая TLR раковая клетка может быть выбрана из следующей таблицы:

[0046] Toll-подобный рецептор, экспрессируемый раковыми клетками, может активировать каскад NF-κВ и продуцировать антиапоптозные белки, которые способствуют карциногенезу и пролиферации раковых клеток.

[0047] Известно, что в передаче сигналов участвуют четыре адапторные молекулы TLR. Эти белки известны как фактор миелоидной дифференциации 88 (MyD88), Tirap (также называемый Mal), Trif и Tram. Адаптерные молекулы активируют другие молекулы в клетке, включая некоторые протеинкиназы (IRAK1, IRAK4, ТВK1 и IKKi), которые усиливают сигнал, что в конечном итоге приводит к индукции или супрессии генов, которые координируют воспалительную реакцию. Сигнальные пути TLR во время распознавания патогена могут индуцировать иммунные реакции по внеклеточным и внутриклеточным путям посредством MyD88, фактора транскрипции NF-κВ и митоген-ассоциированной протеинкиназы (МАРК). При передаче сигналов TLR активируются тысячи генов, и TLR в целом образуют одни из самых плейотропных, но при этом строго регулируемых путей генной модуляции.

[0048] Toll-подобные рецепторы вместе с рецепторами интерлейкина-1 образуют суперсемейство рецепторов, известное как "суперсемейство рецепторов интерлейкина-1/toll-подобных рецепторов". Все члены этого суперсемейства имеют общий так называемый TIR-домен (Toll-IL-1-рецептор). Могут существовать три подгруппы TIR-доменов. Белки, содержащие TIR-домены подгруппы I, являются рецепторами интерлейкинов, которые продуцируются макрофагами, моноцитами и дендритными клетками, при этом все они имеют внеклеточные домены иммуноглобулина (Ig). Белки, содержащие TIR-домены подгруппы II, представляют собой классические TLR и прямо или косвенно связывают молекулы микробного происхождения. Третья подгруппа белков, содержащая TIR-домены (III), состоит из адаптерных белков, которые являются исключительно цитозольными и являются посредниками при передаче сигналов от белков подгрупп 1 и 2. Toll-подобным рецептором может являться фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное, которое сохраняет TIR-домен подгруппы I, TIR-домен подгруппы II или TIR-домен подгруппы III.

[0049] Toll-подобный рецептор может действовать как димер. Например, хотя большинство Toll-подобных рецепторов, по-видимому, действуют как гомодимеры, TLR2 образует гетеродимеры с TLR1 или TLR6, при этом каждый димер имеет отличающуюся специфичность в отношении лиганда. Полная чувствительность toll-подобного рецептора в отношении лиганда также может зависеть от других корецепторов как в случае, когда TLR4 распознает липополисахарид (LPS), для чего требуется MD-2. Известно, что CD14 и LPS- связывающий белок (LBP) способствуют презентации липополисахарида MD-2.

a. TLR1

[0050] Toll-подобным рецептором может являться TLR1, который распознает РАМР и обладает специфичностью в отношении грамположительных бактерий. TLR1 также обозначается как CD281.

b. TLR5

[0051] Toll-подобным рецептором может являться TLR5. Белок, который кодирует TLR5, может играть фундаментальную роль в распознавании патогенов и активации врожденного иммунитета. TLR5 может распознавать РАМР, которые экспрессированы на инфекционных агентах и опосредуют выработку цитокинов, необходимых для создания эффективного иммунитета. TLR5 может распознавать бактериальный флагеллин, являющийся основным компонентом бактериального жгутика и фактора вирулентности. Активация TLR может мобилизовать фактор транскрипции NF-κВ и стимулировать продукцию фактора некроза опухоли-альфа.

4. Агонист TRL

[0052] В настоящем изобретении также предложен агонист TLR. Агонистом TLR может являться РАМР, которым может являться консервативный молекулярный продукт, выделенный из патогена. Патогеном может являться грамположительная бактерия, грамотрицательная бактерия, грибок или вирус. Агонистом TLR может являться лиганд с молекулярной структурой, ассоциированной с повреждением (DAMP), которым может являться эндогенная молекула, высвобожденная из поврежденных или умирающих клеток. DAMP или РАМР могут инициировать иммунный ответ посредством TLR сигналов и привлекать адаптерные молекулы в цитоплазме клеток с целью распространения сигнала. Агонистом TLR может являться лиганд из следующей Таблицы 2.

[0053] Агонистом TLR может являться фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное РАМР или DAMP, которое связывает TLR и индуцирует TLR-опосредованную активность, такую как активация действия NF-κВ. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное агониста TLR может быть, по меньшей мере, на 30-99% идентичным аминокислотам агониста TLR и индуцировать TLR-опосредованную активность.

[0054] Агонист TLR может быть нацелен на TLR, такой как TLR5. Агонист TLR может представлять собой агонист TLR5 и может стимулировать активность TLR5. Агонистом TLR может являться антитело против TLR5 или другая малая молекула. Агонистом TLR может являться флагеллин.

[0055] Флагеллином также может являться флагеллин или связанный с флагеллином полипептид. Флагеллин может иметь любой источник происхождения, включая разнообразные грамположительные и грамотрицательные бактерии. Флагеллином может являться полипептид на основе флагеллина, выделенный из грамположительных или грамотрицательных бактерий, включая без ограничения полипептид на основе флагеллина, описанный в публикации патентной заявки US 2003/000044429, содержание которой в порядке ссылки целиком включено в настоящую заявку. Например, флагеллин может иметь аминокислотную последовательность бактерий, показанную на фиг. 7 публикации патентной заявки US 2003/0044429. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды на основе флагеллина, которые показаны на фиг. 7 публикации патентной заявки US 2003/0044429, находятся в свободном доступе в таких источниках, как база данных Genbank Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Флагеллином также может являться пептид на основе флагеллина, соответствующий идентификационному номеру, указанному в результатах BLAST на фиг. 25 публикации патентной заявки US 2003/000044429, или его вариант. Флагеллином также может являться полипептид на основе флагеллина, описанный публикации патентной заявки US 2009/0011982, содержание которой в порядке ссылки целиком включено в настоящую заявку. Флагеллином может являться любой из полипептидов на основе флагеллина, представленных на фиг. 6 и 7 из описания настоящего изобретения.

[0056] Флагеллином может являться фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина, который связывает TLR5 и индуцирует TLR5-опосредованную активность, такую как активация действия NF-κB. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина может быть, по меньшей мере, на 30-99% идентичным аминокислотам флагеллина, который связывает TLR5 и индуцирует TLR5-опосредованную активность.

[0057] Флагеллин может, быть из одного из видов бактерий Salmonella, одним из типичных примеров которых является вид S.dublin (идентификационный номер М84972 в GenBank). Связанным с флагеллином полипептидом может являться фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина М84972 или их сочетание, которое связывает TLR5 и индуцирует TLR5-опосредованную активность, такую как активация действия NF-κB. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина может быть получено путем конструктивной разработки, основанной на доменной структуре флагеллина и консервативной структуре, распознаваемой TLR5.

[0058] Флагеллин может содержать, по меньшей мере, 10, 11, 12 или 13 из 13 консервативных аминокислот, представленных на Фиг. 5 (положения 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 и 452). Флагеллин может быть, по меньшей мере, на 30-99% идентичен аминокислотам 1-174 и 418-505 флагеллина М84972. На Фиг. 26 публикации патентной заявки US 2009/0011982, содержание которой целиком включено в настоящую заявку, показан процент идентичности амино-конца и карбокси-конца флагеллина с известной стимулирующей TLR5 активностью и флагеллина М84972.

[0059] Флагеллин может являться основным компонентом бактериального жгутика. Флагеллин может состоять из трех доменов (Фиг. 4). Домен 1 (D1) и домен 2 (D2) могут быть не непрерывными и могут формироваться, когда остатки в амино-конце и карбокси-конце соприкасаются при образовании шпилькообразной структуры. Амино-конец и карбокси-конец, содержащие домены D1 и D2, могут являться наиболее консервативными, тогда как срединный гипервариабельный участок (D3) может быть высоко вариабельным. Исследования рекомбинантного белка, содержащего домены D1 и D2 на амино-конце и домены D1 и D2 на карбокси-конце, разделенные шарниром из Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2), показывают, что D1 и D2 могут проявлять биоактивность при сцеплении в элемент ЕСН. Эта химера, а не шарнир как таковой, может индуцировать деградацию IkBa, активацию NF-κB и продуцирование NO и IL-8 в двух линиях эпителиальных клеток кишечника. Неконсервативный домен D3 может присутствовать на поверхности жгутикового филамента и может содержать крупные антигенные эпитопы. Высококонсервативным N- и С-концам, содержащим D1 и D2, может быть свойственна мощная противовоспалительная активность флагеллина (смотри Фиг. 4).

[0060] Флагеллин может индуцировать активность NF-κB путем связывания toll-подобного рецептора 5 (TLR5). TLR может распознавать консервативную структуру, которая свойственна флагеллину. Консервативную структуру может образовывать большая группа остатков, до некоторой степени допускающих изменения в содержании аминокислот. В работе Smith и др., Nat Immunol. 4:1247-53 (2003), содержание которой в порядке ссылки включено в настоящую заявку, во флагеллине идентифицированы 13 консервативных аминокислот, которые являются частью консервативной структуры, распознаваемой TLR5. На Фиг. 5 показаны 13 консервативных аминокислот флагеллина, которые могут быть важными для стимуляции активности TLR5.

[0061] Созданы многочисленные мутанты флагеллина с делецией, которые сохраняют, по меньшей мере, часть стимулирующей TLR5 активности. Флагеллином может являться такой мутант с делецией, в частности, мутант с делецией, описанный в Примерах настоящего изобретения. Флагеллин может содержать последовательность, транслированную из последовательности под идентификационным номером D13689 в GenBank путем делеции аминокислот 185-306 или 444-492, или последовательность, транслированную из последовательности под идентификационным номером М84973 в GenBank путем делеции аминокислот 179-415, или ее вариант.

[0062] Флагеллин может содержать инсерции транспозонов и изменения в вариабельном домене D3. Домен D3 может быть частично или целиком замещен шарнирным или линкерным полипептидом, который позволяет доменам D1 и D2 складываться надлежащим образом с целью стимуляции активности TLR5. Варианты шарнирного элемента можно обнаружить в белке MukB E.coli, при этом они могут иметь такую последовательность, как SEQ ID NOS: 3 и 4 или ее вариант.

[0063] Описанный выше флагеллин может дополнительно содержать лидерную последовательность. Флагеллином, дополнительно содержащим лидерную последовательность, может являться CBLB502 (SEQ ID NO: 101).

[0064] Флагеллин также может иметь пониженный уровень гликозилирования или быть не гликозилирован, а также может содержать мутацию в сайте гликозилирования, которая может усиливать специфическую активность флагеллина. Сайт гликозилирования может содержать аминокислотную последовательность NKS, NGT, NQT или NMS. Мутация может представлять собой остаток аспарагина (N) в сайте гликозилирования, мутировавший в отличающийся остаток. Мутация в сайте гликозилирования может находиться в положениях N19, N101, N128 или N475 последовательности флагеллина SEQ ID NO: 1. N-остаток может быть заменен любой другой аминокислотой, включая аланин, пролин или глутамин. В частности, флагеллин может содержать мутацию N в Q в сайте гликозилирования. Флагеллин может содержать последовательность SEQ ID NO: 102, которая является такой же, как на фиг. 10, за исключением того, что N-остатки, которые находятся в отмеченных кругом прогнозированных сайтах гликозилирования в положениях, эквивалентных положениям 19, 101, 128 и 475 последовательности SEQ ID NO: 1, изменены на Q.

5. Средство

[0065] Настоящее изобретение также относится к средству, содержащему терапевтически эффективное количество TLR и агониста TLR. Средство может доставлять TLR отдельно от агониста TLR. Средством может являться вектор. Вектор может содержать первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR, и вторую нуклеиновую кислоту, представляющую собой агонист TLR. Вектор может быть способен трансформировать клетки млекопитающих.

[0066] Вектор может быть способен к бицистронной экспрессии TLR и/или агониста TLR в силу того, что TLR и/или агонист TLR способен оперативно связывать сильный промотор. Вектор может содержать только ген, кодирующий TLR, который может быть способен оперативно связывать сильный промотор. Промотором может являться промотор убиквитина С (UbiC), промотор цитомегаловируса (CMV) или промотор фактора элонгации трансляции 1 альфа (EF1A). Промотор UbiC может иметь последовательность, содержащуюся в pDSL_hpUGIH (идентификационный номер 10326379 в Американской коллекции типовых культур). Вектор может доставляться в клетку млекопитающего вирусом или липосомной векторной системой. Векторной системой вируса может являться аденовирус или цитомегаловирус.

[0067] Средством может являться липосома, в которой содержится вектор. Липосома может быть способна преобразовывать клетки млекопитающих и доставлять вектор с целью экспрессии.

[0068] Средством может являться лекарственная композиция, которая одновременно индуцирует экспрессию и активирует TLR, обнажая тем самым опухолевые или инфицированные клетки для иммунной системы хозяина, что имитирует ситуацию массового проникновения через стенку кишечника. Средством может являться лекарственная композиция, которая экспрессирует TLR в комбинации с агонистом TLR и может системно доставляться в растворе для введения, такого как внутримышечное введение. Средством может являться лекарственная композиция, которая экспрессирует TLR в комбинации с агонистом TLR, которые могут экспрессироваться одни и тем же вектором, таким как векторная система аденовируса или цитомегаловируса. Средством может являться лекарственная композиция, которая экспрессирует TLR в комбинации с агонистом TLR в форме наночастицы, которая может переносить функциональный агонист к поверхности клетки млекопитающего.

[0069] Средством может являться фармацевтическое средство, содержащее вышеописанную лекарственную композицию, которая может быть изготовлена способами, хорошо известными из техники. Средство также может содержать сопутствующее средство.

[0070] Вектор может содержать первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR5, и вторую нуклеиновую кислоту, представляющую собой флагеллин. Вектор может быть способен экспрессировать TLR5 и/или флагеллин с использованием сильного промотора. Вектор экспрессии может дополнительно содержать лидерную последовательность, клонированную в положении до гена, кодирующего TLR или TLR5 и/или флагеллин. Экспрессирующим вектором может являться векторная система на основе pCD515. Вектором экспрессии может являться pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502, показанный на Фиг. 1А. Вектором экспрессии может являться pCD515-CMV-hTLR5, показанный на фиг. 1В. Экспрессирующим вектором может являться pCD515-CMV-Sseap-502, показанный на Фиг. 1С.

[0071] Экспрессирующий вектор может содержать последовательность, кодирующую TLR и агонист TLR в одной и той же открытой рамке считывания, в результате чего TLR и агонист TLR экспрессируют в качестве гибридного вектора трансляции. Последовательности, кодирующие TLR и агонист TLR, могут быть разделены саморасщепляющимся пептидом 2а и сайтом фуриновой протеазы с целью удаления in vivo пептида 2а на С-конце агониста TLR, как это описано в работе Fang J, и др., 2005, Nat Biotechnol.; 23(5):584-90, содержание которой в порядке ссылки включено в настоящую заявку. Экспрессирующий вектор может содержать TLR и агонист TLR в одной и той же открытой рамке считывания, как показано на Фиг. 15D.

[0072] Средством может являться лекарственная форма, которая одновременно индуцирует экспрессию и активирует TLR, обнажая тем самым опухолевые или инфицированные клетки для иммунной системы хозяина, что имитирует ситуацию массового проникновения через стенку кишечника. Лекарственная форма может быть в форме вирусной экспрессирующей системы, содержащей вектор. Лекарственной формой может являться экспрессируемый аденовирусом функциональный TLR5 человека в комбинации:

[0073] с агонистом TLR, системно доставляемым в растворе для введения, такого как внутримышечное введение;

[0074] с агонистом TLR, экспрессируемым тем же аденовирусным вектором, что и TLR, или

[0075] с агонистом TLR, экспрессируемым в форме наночастиц, несущих на своей поверхности функциональный агонист TLR, такой как флагеллин, который может быть выделен из CBLB502. Основой наночастиц может являться бактериофаг Т7, или они могут целиком сохранять свою биологическую активность. Состав из наночастиц может обеспечивать зависящую от дозы, восприимчивую к NF-κВ активацию репортерного гена и может приводить к интернализации клеток путем эндоцитоза с целью эффективной иммунизации (Mobian АР-А).

а. Введение средства

[0076] Введение средств описанным в изобретении способом может осуществляться перорально, парентерально, подъязычно, чрескожно, ректально, через слизистую оболочку, местно, путем ингаляции, трансбуккально или путем сочетания перечисленного. Парентеральное введение включает без ограничения внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, внутриоболочечное и внутрисуставное введение. В целях ветеринарного применения средство может вводиться в форме приемлемого состава в соответствии с принятой ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить дозировку и способ введения, наиболее приемлемый для конкретного животного. Средства могут вводиться человеку, кошкам, собакам, крупным животным или птицам.

[0077] Средство может вводиться одновременно с другими терапиями или периодически в противофазе с другими терапиями. Используемый термин "одновременный" или "одновременно" означает, что средство и другую терапию применяют с интервалом 48 часов, предпочтительно 24 часа, более предпочтительно 12 часа, еще более предпочтительно 6 часов, наиболее предпочтительно 3 часа или менее. Используемый термин "периодически в противофазе" означает введение средства в моменты, отличающиеся от моментов применения другой терапии, и с определенной повторяющейся частотой.

[0078] Средство может вводиться в любой момент, предшествующий другой терапии, в том числе приблизительно за 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часа, 112 часа, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 ч, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту. Средство может вводиться в любой момент, предшествующий второй терапии, в том числе приблизительно за 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часа, 112 часа, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 ч, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часа, 12 часа, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту.

[0079] Средство может вводиться в любой момент после другой терапии, в том числе приблизительно через 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 4 минуты, 5 минут, 6 минут, 7 минут, 8 минут, 9 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 25 минут, 30 минут, 35 минут, 40 минут, 45 минут, 50 минут, 55 минут, 1 час, 2 часа, 3 час, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 22 часа, 24 часа, 26 часов, 28 часов, 30 часов, 32 часа, 34 часа, 36 часов, 38 часов, 40 часов, 42 часа, 44 часа, 46 часов, 48 часов, 50 часов, 52 часа, 54 часа, 56 часов, 58 часов, 60 часов, 62 часа, 64 часа, 66 часов, 68 часов, 70 часов, 72 часа, 74 часа, 76 часов, 78 часов, 80 часов, 82 часа, 84 часа, 86 часов, 88 часов, 90 часов, 92 часа, 94 часа, 96 часов, 98 часов, 100 часов, 102 часа, 104 часа, 106 часов, 108 часов, 110 часов, 112 часа, 114 часа, 116 часов, 118 часов и 120 часов. Средство может вводиться в любой момент после второй терапии, в том числе спустя приблизительно 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часа, 112 часа, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 ч, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту.

b. Состав

[0080] Способ может заключаться в введении средства. Средства, предложенные в настоящем изобретении, могут быть в форме таблеток или пастилок, имеющих традиционно разработанный состав. Например, таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать традиционные наполнители, такие как связующие вещества, наполнители, смазывающие вещества, дезинтегранты и увлажнители. Связующие вещества включают без ограничения сироп, аравийскую камедь, желатин, сорбитол, трагакант, клейкое вещество крахмала и поливинилпирролидон. Наполнителями могут являться лактоза, сахар, микрокристаллическая целлюлоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбитол. Лубриканты включают без ограничения стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и диоксид кремния. Дезинтегрантами могут являться картофельный крахмал и крахмалгликолят натрия. Увлажнителем может являться лаурилсульфат натрия. Таблетки могут иметь покрытие, нанесенное хорошо известными из техники способами.

[0081] Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут, быть в форме жидких составов, таких как водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры. Средства также могут быть в форме сухого продукта для его восстановления водой или другим применимым носителем перед употреблением. Такие жидкие препараты могут содержать добавки, такие как суспендирующие средства, эмульгаторы, неводные носители и консерванты. Суспендирующим средством может являться сорбитоловый сироп, метилцеллюлоза, сироп из глюкозы/сахара, желатин, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гелеобразный стеарат алюминия и гидрогенизированные пищевые жиры. Эмульгаторами могут являться лецитин, сорбитан моноолеат и аравийская камедь. Неводными носителями могут являться пищевые жиры, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, сложноэфирные масла, пропиленгликоль и этиловый спирт. Консервантами могут являться метил- или пропил-р-гидроксибензоат и сорбиновая кислота.

[0082] Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут, быть в форме суппозиториев, которые могут содержать основу, такую как кокосовое масло или глицериды. Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть в форме состава для ингаляции, который представлять собой раствор, суспензию или эмульсию, которая может вводиться в виде сухого порошка или аэрозоля с использованием сжатой среды, такой как дихлордифторметан или трихлорфторметан. Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть в форме составов для чрескожного введения, содержащих водные или неводные носители, такие как кремы, мази, лосьоны, пасты, содержащий лекарственное средство пластырь, повязку или оболочку.

[0083] Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут, быть в форме составов для парентерального введения, такого как путем инъекции, внутриопухолевой инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать вещества, включающие без ограничения суспендирующие, стабилизирующие и дисперсирующие вещества. Средство также может находиться в форме порошка для его восстановления приемлемым носителем, включая без ограничения стерильную апирогенную воду.

[0084] Средства, предложенные в настоящем изобретении, также могут, быть в форме в депо-препарата, который может вводиться путем имплантации или внутримышечной инъекции. В состав средств могут входить применимые полимерные или гидрофобные материалы (такие как, например, эмульсия в приемлемом масле), ионообменные смолы или умеренно растворимые производные (такие как, например, умеренно растворимая соль).

с. Дозировка

[0085] Способ может заключаться в введении терапевтически эффективного количества препарата нуждающемуся в этом пациенту. Терапевтически эффективное количество, требуемое для применения в терапии, варьирует в зависимости от характера соответствующего состояния, времени, желательного для активации действия TLR, и возраста/состояния пациента. Тем не менее, обычно дозы, используемые для лечения взрослых пациентов, находятся в диапазоне от 0,001 мг/кг до около 200 мг/кг в день. Доза может составлять от около 1 мг/кг до около 100 мг/кг в день. Желаемую дозу может быть удобно ввести однократно целиком или разбив на несколько введений с соответствующими интервалами, например, разбив дозу на введение ее в два, три, четыре или более приема в день. Многократный прием может быть желательным или необходимым.

[0086] Возможна любая дозировка, например, около 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0.4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 125 мг/кг, 150 мг/кг, 175 мг/кг, 200 мг/кг, 225 мг/кг, 250 мг/кг, 275 мг/кг, 300 мг/кг, 325 мг/кг, 350 мг/кг, 375 мг/кг, 400 мг/кг, 425 мг/кг, 450 мг/кг, 475 мг/кг, 500 мг/кг, 525 мг/кг, 550 мг/кг, 575 мг/кг, 600 мг/кг, 625 мг/кг, 650 мг/кг, 675 мг/кг, 700 мг/кг, 725 мг/кг, 750 мг/кг, 775 мг/кг, 800 мг/кг, 825 мг/кг, 850 мг/кг, 875 мг/кг, 900 мг/кг, 925 мг/кг, 950 мг/кг, 975 мг/кг или 1 мг/кг.

7. Способ лечения рака

[0087] В изобретении предложен способ лечения рака путем введения средства нуждающемуся в этом млекопитающему. Способ предусматривает иммунотерапию рака путем обеспечения перехода опухолевых клеток в восприимчивое к агонисту TLR состояние за счет целевой внутриопухолевой стимуляции TLR, чтобы тем самым сосредоточить иммунный ответ на опухоли. Способ может использоваться для лечения первичных опухолей перед хирургическим удалением с целью снижения риска развития метастазов, а также лечения других опухолевых узелков. Способ может предусматривать внутриопухолевую инъекцию. Способ может включать стадию инъекции средства в первичную опухоль перед хирургическим удалением с целью снижения риска развития метастазов, а также лечения других опухолевых узелков. Способ может использоваться для лечения любой опухоли, доступной для внутриопухолевой инъекции аденовируса.

[0088] Согласно настоящему изобретению, можно лечить рак разных типов, включая карциному, рак мочевого пузыря (в том числе быстропрогрессирующий и метастазирующий рак мочевого пузыря), молочной железы, толстой кишки (в том числе колоректальный рак), почек, печени, легкого (в том числе мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого и легочную аденокарциному), яичников, простаты, семенников, половых путей, лимфатической системы, прямой кишки, гортани, поджелудочной железы (в том числе экзокринную карциному поджелудочной железы); пищевода, желудка, желчного пузыря, шейки матки, щитовидной железы и кожи (в том числе плоскоклеточный рак); гематопоэтические опухоли лимфоидной оболочки, в том числе лейкемию, острую лимфоцитарную лейкемию, острую лимфобластную лейкемию, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкинса, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому, гистиоцитарную лимфому и лимфому Буркетса; гематопоэтические опухоли миелоидной линии, острые и хронические миелогенные лейкемии, миелодиспластический синдром, миелоидную лейкемию и промиелоцитарную лейкемию, опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому, и другие опухоли, в том числе меланому, пигментную ксеродерму, кератоактантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы, тератокарциному и рак желудочно-кишечного тракта или брюшной и тазовой области.

[0089] Рак может характеризоваться высоким уровнем экспрессии белка CAR в оболочках раковых клеток. Высокий уровень может быть высоким по сравнению с раком системы кроветворения, мягких тканей, кожи, головы и шеи, мозга, шейки матки, молочной железы и пищевода, при которых уровни экспрессии CAR могут являться низкими. Высокий уровень также может быть высоким по сравнению с раком легкого, яичника, желудка, почек, меланомы, печени, эндокринной системы и мезотелиомой. Высокий уровень может, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз превышать уровень экспрессии CAR в клетках NCI-H1437, NCI-H2122 или СТ26 клетках. Раком может являться рак мочевого пузыря, простаты, тонкого кишечника, щитовидной железы, яичка или толстой кишки.

[0090] При раке с высоким уровнем экспрессии CAR может быть более высокая эффективность средства, если оно содержит вирусный экспрессирующий вектор, такой как аденовирус. В результате, множественность заражения раковых клеток описанным в изобретении вирусным средством может быть, по меньшей мере, в 100 или 1000 раз выше в раковых клетках с высоким уровнем экспрессии CAR, чем раковых клетках с низким уровнем экспрессии CAR, за счет чего в раковых клетках с высоким уровнем экспрессии CAR может использоваться меньшее эффективное количество средства. Эффективное количество вирусного средства может составлять менее около 109, 108, 107, 106 или 105 вирусных частиц.

[0091] Способ может сочетаться с другими способа лечения рака, включая применение иммуностимулятора, цитокина или химиотерапии. Иммуностимулятором может являться гормон роста, пролактин или витамин D.

2. Лечение инфицированных клеток

[0092] В настоящем изобретении предложен способ лечения инфекционной болезни путем одновременной доставки трансдуцированных клеток средством согласно изобретению. Способ может использоваться для лечения вирусной, бактериальной инфекции, инфекции, вызванной простейшими паразитами или грибками. Способ может использоваться для лечения любой инфекционной болезни путем внутриклеточной инъекции, которая приводит к аутокринной активации передаче TLR-сигналов инфицированных клеток с минимальным системным эффектом, что позволяет тем самым стимулировать врожденный иммунный ответ, специфический в отношении инфицированных клеток. Способ может сочетаться с другими терапиями для лечения вирусных, бактериальных инфекций, инфекций, вызванных простейшими паразитами или грибками.

[0093] Способ может включать введение средства. Способ может включать введение вакцины, содержащей средство, и может использоваться в сочетании с вакцинацией любыми другими вакцинами, которые могут содержать конструкцию, экспрессирующую выбранный антиген.

Пример 1

Синтез бицистронного экспрессирующего TLR5/флагеллин вектора и лечение опухолевых клеток

[0094] Были созданы векторные конструкции для экспрессии toll-подобного рецептора 5 (TLR5) и флагеллина CBLB502. В качестве основной цепи этих конструкций использовали вектор pCD515. По отдельности гибридизировали последовательность кДНК TLR5 человека и ДНК, кодирующую CBLB502 агониста toll-подобного рецептора, с лидерным пептидом, выделенным из щелочной фосфатазы, что позволило направить экспрессированный белок через эндоплазматическую сеть (ER) и комплексы Гольджи с целью внеклеточной секреции.

[0095] Векторная конструкция pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s экспрессировала на поверхности клеток секретируемую форму флагеллина CBLB502 (CBLB502) и toll-подобного рецептора 5 (TLR5). Для достижения эффективного синтеза и секреции этого аденовирусного вектора клетками млекопитающего требовалась модификация CBLB502. Аденовирусная конструкция имела лидерную последовательность нуклеиновых кислот (Atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc) (SEQ ID NO: 100), выделенную из щелочной фосфатазы, и была клонирована в положении до усеченного гена флагеллина (fliC) Salmonella (смотри Burdelya и др., Science 320:226-230 (2008) с целью кодирования секретируемой формы флагеллина (то есть CBLB502). Клонировали промотор EF1 (фактор элонгации 1а) в положении до этой кассеты, кодирующей CBLB502. Выделили из организма человека ген TLR5, который имеет последовательность аминокислоты, показанную на фиг. 9 (SEQ ID NO: 99). Клонировали промотор CMV в положении до гена TLR5. Эта конструкции, которая одновременно экспрессирует TLR5 и CBLB502, показана на Фиг. 1А.

[0096] Сконструировали вектор экспрессии pCD515-CMV-hTLR5 с целью экспрессии TLR5 человека (смотри Фиг. 9). Аденовирусная конструкция содержала сильный промотор CMV, клонированный в положении до кассеты hTLR5. Эта конструкции показана на Фиг. 1В.

[0097] Сконструировали pCD515-CMV-Sseap-502 экспрессирующий вектор для экспрессии секретеруемого флагеллина CBLB502 и toll-подобного рецептора. Аденовирусная конструкция содержала сильный промотор CMV, клонированный в положении до лидерной последовательности SEAP 502 гена флагеллина (fliC). Эта конструкции показана на Фиг. 1С.

Пример 2

Синтез бицистронного экспрессирующего TLR5/флагеллин вектора и лечение опухолевых клеток

[0098] Осуществили трансдукцию двух репортерных линий клеток млекопитающего, которые экспрессировали восприимчивый к NF-κB GFP и различались своим TLR5-статусом, векторными конструкциями pCD515, pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s, pCD515-CMV-hTLR5-502, pCD515-CMV-hTLR5 и pCD515-CMV-Sseap-502 (смотри Таблицу 3 далее).

Таблица 3. Активность аденовирусных конструкций в качестве активаторов передачи сигналов, опосредуемых TLR5

Активность аденовирусных конструкций в качестве активаторов передачи сигналов TLR5

[0099] Вектор, одновременно экспрессирующий TLR5 и агонист TLR5 CBLB502, был достаточным, чтобы индуцировать экспрессию репортера NF-κB в линии клеток 293-null, которые не экспрессируют ни один из известных TLR и не могут быть активированы только агонистом TLR5. Этот эксперимент показывает, что TLR5 и флагеллин CBLB502 могут как в транс-, так и в цис-положении активировать сигнальный путь TLR5.

Пример 3

[0100] С целью испытания антиопухолевых эффектов бицистронного аденовируса, содержащего векторную конструкцию pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s, мышам линии Balb/c вводили 10 мл суспензии аденовируса (1012-1011 МЕ/мл) в одну из двух сингенных опухолей, подкожно выращенных из клеток карциномы толстой кишки мышей линии СТ26, когда опухоли достигли 3-5 мм в диаметре, и контролировали размер опухолей до тех пор, пока контрольные опухоли без введения инъекций не достигали предельного размера, требующего прекращения эксперимента. Инъецировали в толстую кишку мышей (и в этом случае в одну из двух опухолей у каждой мыши) аденовирусный вектор, экспрессирующий красный флуоресцентный белок (RFP). На Фиг. 4 представлены результаты одного из типичных экспериментов. У одного и того же животного наблюдалось почти полное отсутствие роста опухоли, в которую ввели pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s, и снижение роста опухоли без введения по сравнению с опухолями у контрольных животных, получивших инъекцию экспрессирующего RFP аденовируса. Этот результат демонстрирует (i) мощный эффект в цис-положении и (ii) заметный эффект в транс-положении pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s, что является признаком усиления как врожденного (цис-эффект), так и приобретенного (транс-эффект) иммунного ответа. Ни один из других контрольных вирусов, перечисленных в Таблице 1 (то есть AD5 (контроль) и Ad5 (TLR5)), введенных по отдельности, не оказывал на опухоли эффекта подавления роста.

[0101] Таким образом, принудительная эктопическая экспрессия TLR5 придает опухолевым клеткам различных типов с изначальным дефицитом TLR5 высокую восприимчивость к стимуляции TLR5, что приводит к нарушению иммунологической толерантности опухоли, мощной стимуляции врожденного иммунного ответа, который способствует эффективному развитию приобретенного иммунного ответа с последующим общим противоопухолевым эффектом.

Пример 4

Влияние уровней экспрессии CAR на эффективность экспрессии аденовирусного вектора в раковых клетках

[0102] В этом примере продемонстрирована более высокая эффективность лечения опухолей с более высокими уровнями экспрессии CAR аденовирусом, содержащим вектор, экспрессирующий как флагеллин, так и TLR5. Для эффективного заражения аденовирусом серотипа 5 и его производными, такими как аденовирус, содержащий вектор, экспрессирующий как флагеллин, так и TLR5, необходима мембранная экспрессия рецептора вируса Коксаки и аденовируса (CAR). Известно, что в опухолях нескольких типов (например, меланоме и рабдомиосаркоме) уровень экспрессии CAR снижается по мере их развития, тогда как в случае эстрогенозависимого рака молочной железы наблюдается противоположная ситуация. Использовали набор линий опухолевых клеток мыши и человека, и определили корреляцию высокого уровня экспрессии CAR (путем окрашивании антителами против CAR) методом измерения эффективности заражения аденовирусом Ad-mCherry (контрольным аденовирусом, экспрессирующим флуоресцентный белок mCherry). Это было сделано путем подсчета числа положительно реагирующих на красную флуоресценцию клеток под микроскопом или путем анализа FACS. Инфицировали клетки аденовирусом Ad-mCherry с различной степенью множественности заражения (MOI), и анализировали эффективность заражения в различные моменты времени. Из CAR-позитивных клеток мыши была обнаружена сильная экспрессия мембранного CAR клетками рака яичника (MOSEC), рака молочной железы (4Т1, LM3) и рака простаты (TRAMP-C2), которые могли быть эффективно инфицированы аденовирусом Ad-mCherry (Фиг. 11).

[0103] Для определения типов опухолей человека, которые выраженно экспрессируют CAR, окрасили антителами против CAR массивы опухолевых тканей, состоящие из образцов опухолей различного тканевого происхождения и здоровых тканей (Roswell Park Pathology Core). Первичный анализ экспрессии CAR в опухолях показал, что тестируемые опухоли можно разделить на три категории: (I) с низким уровнем экспрессии CAR (система кроветворения, мягкие ткани, кожа, голова и шея, мозг, шейка матки, молочная железа, пищевод; (II) с высоким уровнем экспрессии CAR: (мочевой пузырь, рак простаты, тонкий кишечник, щитовидная железа, яички, толстая кишка) и (III) со средним уровнем экспрессии CAR (легкие, яичник, желудок, почки, меланома, печень, эндокринная система, мезотелиома). Соответственно, окрасили антителами против CAR специфические массивы опухолевой ткани простаты (состоящие из 134 образцов опухоли простаты, 134 образцов здоровой простаты и 68 образцов здоровой ткани). 90% опухолей простаты (а также здоровые ткани простаты) являлись CAR-позитивными (Фиг. 12).

[0104] Подтвердили эффективность аденовирусной инфекции, сопровождающейся более высокой экспрессией CAR, на клетках простаты. Противоопухолевой эффект аденовируса, содержащего вектор, экспрессирующий как флагеллин, так и TLR5, наблюдался в клетках СТ26 карциномы толстого кишечника только в случае введения высокой дозы вируса (3×1010 вирусных частиц, вч) в опухоли СТ26, в то время как при меньших дозах (5×109 вч) не наблюдался какой-либо значимый эффект. Вероятно, это объясняется недостаточной функциональной экспрессией CAR клетками СТ26. В действительности, экспрессия CAR значительно ниже на поверхности клеток СТ26, чем у клеток линии MOSEC (Фиг. 13). Кроме того, для заражения клеток СТ26 аденовирусом Ad-mCherry и обнаружения экспрессии mCherry (не показано) требовался в 100-1000 раз более высокий уровень множественности заражения, чем в случае клеток MOSEC. Испытание дополнительных клеточных линий подтвердило, что, несмотря на яркое окрашивание цитоплазмы клеток всех тестируемых линий антителами против CAR, окрашивание мембранно-ассоциированного CAR хорошо коррелировало со способностью инфицировать клетки аденовирусом при меньшей множественности заражения (MOI).

[0105] Таким образом, опухоли простаты, а также другие опухоли с высокими уровнями экспрессии CAR являются хорошими кандидатами для лечения аденовирусом, содержащим вектор, экспрессирующий как флагеллин, так и TLR5.

Пример 5

Гликозилирование флагеллина влияет на эффективность комбинации флагеллина и TLR5 для лечения рака

[0106] В этом примере продемонстрировано, что гликозилированный флагеллин обладает меньшей активностью в клетках млекопитающих, чем негликозилированый флагеллин. Для оценки уровня экспрессии как TLR5, так и CBLB502 в «инфицированных» Мобиланом клетках MOSEC использовали анализ методом вестерн-блоттинга (Фиг. 14). Этот анализ подтвердил экспрессию обоих белков (Фиг. 14), хотя общий уровень экспрессии являлся не очень высоким (по сравнению с сигналами стандартных белков по данным анализа методом вестерн-блоттинга, не показано). Как в лизатах инфицированных клеток (Фиг. 14В), так и в питательных средах (не показано) был обнаружен CBLB502, что подтверждает его секрецию, которая предположительно необходима для передачи сигналов, поскольку область TLR5, участвующая в связывании флагеллином, находится в его внеклеточном домене. Тем не менее, наблюдавшийся размер CBLB502 как в лизатах, так и в питательных средах, был, по меньшей мере, на 6-7 кДа бóльшим, чем ожидалось. С помощью наблюдения соответствующего сдвига в подвижности геля CBLB502 после обработки лизатов предлагаемыми на рынке гликозилирующими ферментами (Фиг. 14В) продемонстрировано, что это является следствием гликозилирования. Гликозилированием флагеллинов можно объяснить наблюдавшуюся относительно низкую специфическую биологическую активность флагеллина, продуцируемого в клетках MOSEC, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим как флагеллин, так и TLR5. В действительности, согласно объединенным данным ИФА и анализа биопроб сигнализации (с использованием репортерных клеток НЕК293-hTLR5-LacZ), которые являются двумя стандартными анализами, специфическими в отношении флагеллина, специфическая активность CBLB502, секретируемого клетками MOSEC, являлась приблизительно в 50 меньшей, чем активность продуцированного бактериями контрольного эталона CBLB502. Путем анализа аминокислотной последовательности флагеллина, было спрогнозировано присутствие четырех эукариотических N-связанных сайтов гликозилирования (Фиг. 10). Примечательно, что поскольку один из этих сайтов находится на участке, участвующем в интерфейсе первичного уровня взаимодействия TLRS-флагеллина, он может снижать аффинность и активность флагеллина.

Пример 6

Промоторы влияют на эффективность аденовируса, экспрессирующего флагеллин и TLR5

[0107] Этот пример показывает, что в результате экспрессии флагеллина аденовирусным вектором с использованием промотора UbiC повышается эффективность лечения рака с использованием аденовируса, экспрессирующего флагеллин и TLR5. Ввели в аденовирусную конструкцию, кодирующую как TLR5, так и флагеллин (под названием Мобилан и показанную на Фиг. 15А), ряд модификаций, чтобы оптимизировать уровень экспрессии, эффективность секреции, стабильность и биологическую активность обоих компонентов комплекса передачи сигналов CBLB502-TLR5. Сначала испытали в созданные конструкции на диагностических клеточных линиях, а затем на мышиных опухолевых моделях.

[0108] Чтобы предотвратить гликозилирование CBLB502 (показанное на Фиг. 10), который экспрессируется в клетках млекопитающих, ввели в его нуклеотидную последовательность соответствующие мутации с целью замещения глютаминами четырех остатков аспарагина в идентифицированных потенциальных сайтах гликозилирования (все сайты мутировали одновременно). Мутантный белок был назван CBLB502NQs (Фиг. 15)(SEQ ID NO: 102). Продуцировали His-меченные мутантные белки в Е. coli, очистили и испытали на специфическую биологическую активность в сравнении с оригинальным CBLB502 путем клеточного анализа биопроб (измерения NF-κB-зависимой экспрессии репортера). Оптимизировали модифицированную кодирующую последовательность для экспрессии в клетках человека, синтезировали (на заказ в GenScript) и использовали для создания новых версий вектора Мобилан.

[0109] Помимо модификации CBLB502-компонента Мобилана с целью исключения его потенциала гликозилирования, как описано выше (смотри Фиг. 15А), мы проверили следующие модификации конструкции Мобилан: (i) с добавлением сайта полиаденилирования в положении после последовательности hTLR5 с целью стабилизации мРНК (Фиг. 15В); (ii) с замещением промотора EF1α альтернативным промотором UbiC (Фиг. 15С); и (iii) с экспрессией CBLB502NQs и hTLR5 в форме транскрипта, гибридизированного с "саморасщепляющимся" петидом 2а и сайтом фуриновой протеазы с целью удаления in vivo пептида 2а, остающегося на С-конце CBLB502NQs (Фиг. 15D). Были получены маломасштабные Ad-preps, которые были охарактеризованы с точки зрения: (i) относительных количеств hTLR5 и CBLB502, продуцированных инфицированными клетками в культуре (путем анализа методами вестерн-блоттинга и ИФА, Фиг. 16 и 17), и (ii) специфической биологической активности CBLB502, выделяющегося в питательную среду (активации NF-κВ-зависимой сигнализации в линии репортерных клеток, Фиг. 18). Наконец, проверили все версии Мобилана на способность подавлять in vivo рост сингенных опухолей молочной железы 4Т1, моделированных на мышах (Фиг. 19). Эти эксперименты показывают, что применение UbiC приводит к получению усовершенствованного вектора Мобилан.