22.03.2019
219.016.ec2c

Полипептид и иммунное модулирование

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002682651
Дата охранного документа
20.03.2019
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Группа изобретений относится к медицине, в частности к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, включающей бактерии, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, включающей бактерии, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, для снижения воспаления у индивидуума. Также группа изобретений относится к фармацевтической композиции для снижения воспаления у индивидуума, содержащей флагеллин Roseburia и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. Также описаны питательная добавка, пищевое вещество, продукт питания, диетическая добавка, пищевая добавка, содержащие флагеллин Roseburia. Также описаны способ получения фармацевтичской композиции и питательной добавки, содержащей флагеллин Roseburia. Группа изобретений обеспечивает получение средства, обладающего противовоспалительной и терапевтически релевантной эффективностью. 12 н. и 108 з.п. ф-лы, 27 ил., 18 табл., 1 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к флагеллинам Roseburia, и/или полинуклеотидным последовательностям, кодирующим указанные флагеллины Roseburia, и/или к векторам, содержащим указанные полинуклеотидные последовательности, и/или к клеткам-хозяевам, включая бактерии, содержащим указанные векторы, и/или к клеткам-хозяевам, включая бактерии, содержащим указанные полинуклеотидные последовательности, для различных терапевтических и пищевых применений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Полагают, что кишечник человека является стерильным в утробе, однако подвергается воздействию различным материнским и внешним микроорганизмам сразу после рождения. После этого происходит динамичный период микробной колонизации и смены сообществ, на которые влияют такие факторы, как путь доставки, окружающие условия, режим питания и генотип хозяина, все из которых влияют на состав микробиоты кишечника, в частности, на ранних стадиях жизни. Затем микробиота стабилизируется и становится похожей на микробиоту взрослого человека (Spor, Koren & Ley 2011). Микробиота кишечника человека содержит более 500-1000 различных филотипов, принадлежащих по существу двум основным бактериальным группам: Bacteroidetes и Firmicutes (Eckburg et al. 2005). Успешные симбиотические взаимосвязи в результате колонизации бактериями кишечника человека обеспечили широкое множество метаболических, структурных, защитных и других благоприятных функций. Повышенная метаболическая активность колонизированного кишечника обеспечивает деградацию в ином случае неперевариваемых компонентов рациона с высвобождением побочных продуктов, обеспечивающих важный источник питательных веществ для хозяина. Аналогично, иммунологическая важность микробиоты кишечника является хорошо известной и проиллюстрирована у безмикробных животных, которые имеют нарушенную иммунную система, которая функционально восстанавливается после введения комменсальных бактерий (Macpherson et al. 2001, Macpherson, Martinic & Harris 2002, Mazmanian et al. 2005).

В противоположность продуцированию секреторного IgA кишечника, на который влияет сама по себе микробная колонизация (Chung, Kasper 2010, Macpherson 2006), развитие и дифференцировка T-клеток, по-видимому, требуют колонизации конкретными комменсальными микроорганизмами. Виды Clostridium, и, в частности, спорообразующие сегментированные нитчатые бактерии (SFB), по-видимому, являются мощным стимулом для дифференцировки и созревания тонкокишечных и толстокишечных Th1, Th17 и Treg (Gaboriau-Routhiau et al. 2009, Ivanov et al. 2009). Недавние исследования продемонстрировали, что другие бактерии кишечника, включая бактерии кластеров Clostridium IV и XIVa и измененную флору Шедлера (ASF), могут влиять на образование de novo Treg, в то время как моноколонизация Bacteroides fragilis может корректировать дисбаланс Th1/Th2 у безмикробных мышей путем стимуляции экспансии Treg (Mazmanian et al. 2005, Geuking et al. 2011, Atarashi et al. 2011). Эти данные подразумевают важные иммунорегуляторные эффекты других резидентных бактерий кишечника. Очевидно, эффекты комменсальных бактерий на пути дифференцировки T-клеток варьируют и, как описано выше, на них может влиять ряд лигандов TLR, для которых было обнаружено, что они ассоциированы с определенными бактериями (Nutsch, Hsieh 2012). Например, механизм, посредством которого SFB влияет на T-клеточные ответы, в настоящее время неизвестен, однако недавние геномные исследования, подтвердившие присутствие генов флагеллина, указывают на то, что врожденные ответы, опосредуемые взаимодействиями TLR5-флагеллин, могут быть важными (Prakash et al. 2011, Sczesnak et al. 2011). Более того, эффекты усиления Treg B. fragilis связывают с PSA и опосредованием событий передачи сигнала TLR2 (Round et al. 2011).

Значительные изменения композиции микробиоты были документально подтверждены при желудочно-кишечных нарушениях, таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD). Например, уровни бактерий Clostridium кластера XIVa является сниженным у пациентов с IBD, в то время как число E. coli увеличено, что указывает на сдвиг равновесия симбионтов и патобионтов в кишечнике (Frank et al. 2007, Scanlan et al. 2006, Kang et al. 2010, Machiels K. et al. 2013). Интересно, что этот микробный дисбиоз также ассоциирован с дисбалансом популяций эффекторных T-клеток.

Roseburia относится к филогенетическому кластеру XIVa типа Firmicutes. В настоящее время в роде Roseburia идентифицировано и охарактеризовано пять видов: Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans (Stanton and Savage 1983, Duncan et al 2006). Эти бактерии представляют собой жгутиковые комменсальные анаэробы и также являются основными продуцентами бутирата (Duncan et al. 2006). Хотя точные количества этих бактерий, колонизирующих кишечник человека, не было точно оценено, Roseburia spp. являются преобладающими в здоровом кишечнике человека и представлены в меньшем количестве у пациентов с IBD (Machiels K. et al. 2013).

Описаны роли бактериальных генов, в частности флагеллина, участвующих в колонизации и адаптации к кишечнику мыши, а также иммунные гены хозяина, отвечающие на колонизацию бактериями Roseburia. Авторы изобретения показывают, что определенные структуры флагеллина Roseburia, таких как R. hominis и R. intestinalis, индуцируют отчетливые ответы в виде передачи сигнала как в эпителиальных клетках, так и в дендритных клетках относительно других жгутиковых кишечных бактерий. Продемонстрирована важность взаимодействий TLR5-Roseburia, таких как TLR5-R.hominis, при направлении адаптивного ответа хозяина, в частности, ответов Treg. Полная геномная последовательность и аннотация для R. hominis, описанных в настоящем описании, представлена в GenBank под номером доступа CP003040 (версия 1). Для R. intestinalis (номер доступа GenBank для гена 16S рРНК штамма L1-82: AJ312385), описанных в настоящем описании, эталонная геномная последовательность представлена в GenBank под номером доступа ABYJ02000000 (версия 2) и она состоит из последовательностей ABYJ02000001- ABYJ02000409.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что белки-флагеллины Roseburia, являются важными для модулирования иммунного ответа.

Кроме того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что белки-флагеллины, происходящие или получаемые из Roseburia hominis или Roseburia intestinalis, являются важными для модулирования иммунного ответа.

Настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для модулирования воспаления ткани или органа (такого как кишечник) у индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для модулирования продукции T-клеток (например, регуляторных T-клеток, таких как регуляторные T-клетки, способные экспрессировать TLR5) у индивидуума.

Настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для восстановления иммунологической толерантности.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции иммунной системы индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для лечения нарушения у индивидуума, где указанное нарушение представляет собой воспалительное нарушение и/или аутоиммунное нарушение.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для модулирования дендритных клеток (таких как дендритные клетки костного мозга) и/или эпителиальных клеток в ткани или органе индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции продукции IL-10 и/ или TGFβ в клетке или клетках индивидуума.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции продукции маркеров клеточной поверхности, вовлеченных в иммунные ответы и распознавание антигена, таких как CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 и/или Siglec-H и/или их видовые эквиваленты в клетке или клетках индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких генов IFN типа I (таких как, но не ограничиваясь ими, один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из IFN-β1, IFN-β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 и Irf4), в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение, в следующем аспекте, относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких провоспалительных генов (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими, IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNγ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 и TNF-α) в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение в другом аспекте относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для улучшения микробиоты кишечника у индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции аппетита у индивидуума.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для регуляции (например, подавления) экспрессии гена, кодирующего холицистокинин (Cck) и/или экспрессии гена, кодирующего глюкагон (Gcg) в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение, в следующем аспекте, относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для улучшения здоровья пищеварительного тракта у индивидуума.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к фармацевтической композиции, содержащей флагеллин Roseburia, и/или полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный флагеллин Roseburia, и/или вектор, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор, и/или клетку-хозяина, содержащую указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой добавке, содержащей флагеллин Roseburia, и/или полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный флагеллин Roseburia, и/или вектор, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор, и/или клетку-хозяина, содержащую указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и диетологически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к пищевому веществу, продукту питания, диетической добавке или пищевой добавке, содержащим флагеллин Roseburia, и/или полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный флагеллин Roseburia, и/или вектор, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор, и/или клетку-хозяина, содержащую указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis).

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к способу получения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает смешение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), с фармацевтически приемлемым эксципиентом, носителем или разбавителем; причем необязательно указанный флагеллин Roseburia, и/или указанная полинуклеотидная последовательность, и/или указанный вектор, и/или указанная клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, и/или указанная клетка-хозяин, содержащая указанную полинуклеотидную последовательность, и/или указанные Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis) являются инкапсулированными.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевой добавки в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает смешение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), с диетологически приемлемым эксципиентом, носителем или разбавителем; причем необязательно указанный флагеллин Roseburia, и/или указанная полинуклеотидная последовательность, и/или указанный вектор, и/или указанная клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, и/или указанная клетка-хозяин, содержащая указанную полинуклеотидную последовательность, и/или указанные Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), являются инкапсулированными.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу модулирования воспаления ткани или органа (такого как кишенчник) у индивидуума, причем указанный способ включает введение индивидууму флагеллина Roseburia, или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит модулирование воспаление ткани или органа (такого как кишечник) у индивидуума.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к способу модулирования продукции T-клеток (например регуляторных T-клеток, таких как регуляторные T-клетки, способные экспрессировать TLR5) у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит модулирование продукции T-клеток (например регуляторных T-клеток, таких как регуляторные T-клетки, способные экспрессировать TLR5) у индивидуума.

Настоящее изобретение, в следующем аспекте, относится к способу регуляции иммунной системы индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит регуляция иммунной системы индивидуума.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения нарушения у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), где указанное нарушение представляет собой воспалительное нарушение и/или аутоиммунное нарушение.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу модулирования дендритных клеток (таких как дендритные клетки костного мозга) и/или эпителиальных клеток у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит модулирование дендритных клеток (таких как дендритные клетки костного мозга) и/или эпителиальных клеток у индивидуума.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к способу регуляции продукции IL-10 и/или TGFβ в клетке или клетках индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектор, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, и/или клетка-хозяин, содержащая указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), индивидууму, и где происходит регуляция продуцирования IL-10 и/или TGFβ в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к способу регуляции продукции маркеров клеточной поверхности, вовлеченных в иммунные ответы и распознавание антигена, таких как CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 и/или Siglec-H и/или их видовые эквиваленты, в клетке или клетках индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), индивидууму, и где происходит регуляция продукции маркеров клеточной поверхности, вовлеченных в иммунные ответы и распознавание антигена, таких как CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 и/или Siglec-H и/или их видовые эквиваленты, в клетке или клетках индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких генов IFN типа I (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IFN-β1, IFN-β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 и Irf4) в клетке или клетках индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), где происходит регуляция экспрессии одного или нескольких генов IFN типа I (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IFN-β1, IFN-β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 и Irf4) в клетке или клетках индивидуума.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких провоспалительных генов (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNγ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 и TNF-α в клетке или клетках индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), где происходит регуляция экспрессии одного или нескольких провоспалительных генов (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNγ, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 и TNF-α) в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к способу улучшения кишечной микробиоты у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит улучшение микробиоты кишечника.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу регуляции аппетита у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит регуляция аппетита у индивидуума.

Настоящее изобретение в другом аспекте относится к способу регуляции (например, подавления) экспрессии гена, кодирующего холицистокинин (Cck), и/или экспрессии гена, кодирующего глюкагон (Gcg), в клетке или клетках индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит регуляция экспрессии гена, кодирующего холицистокинин (Cck), и/или экспрессии гена, кодирующего глюкагон (Gcg), в клетке или клетках индивидуума.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу улучшения здоровья пищеварительного тракта у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит улучшение здоровья пищеварительного тракта у индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для модулирования воспаления ткани или органа (такого как кишечник) у индивидуума.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для модулирования продукции T-клеток (например регуляторных T-клеток, таких как регуляторные T-клетки, способные экспрессировать TLR5) у индивидуума.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции иммунной системы индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для лечения нарушения у индивидуума, где указанное нарушение представляет собой воспалительное нарушение и/или аутоиммунное нарушение.

Настоящее изобретение, в другом аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для модулирования дендритных клеток (таких как дендритные клетки костного мозга) и/или эпителиальных клеток в ткани или органе индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции продукции IL-10 и/или TGFβ в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение, в следующем аспекте, относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции продукции маркеров клеточной поверхности, вовлеченных в иммунные ответы и распознавание антигена, таких как CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 и/или Siglec-H и/или их видовые эквиваленты, в клетке или клетках индивидуума.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких генов IFN типа I (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IFN-β1, IFN-β3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 и Irf4) в клетке или клетках индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции (например, подавления) экспрессии одного или нескольких провоспалительных генов (таких как один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из, но не ограничивающейся ими IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNγ, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 и TNF-α) в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для улучшения кишечной микробиоты у индивидуума.

Настоящее изобретение в другом аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции аппетита у индивидуума.

Настоящее изобретение в следующем аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для регуляции (например, подавления) экспрессии гена, кодирующего холицистокинин (Cck), и/или экспрессии гена, кодирующего глюкагон (Gcg), в клетке или клетках индивидуума.

Настоящее изобретение в другом аспекте относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для улучшения здоровья пищеварительного канала у индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения в медицине.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к флагеллину Roseburia, и/или к полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или к вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор, и/или к клетке-хозяину, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или к Roseburia (таким как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для применения для восстановления иммунологической толерантности.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению флагеллина Roseburia, и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (такие как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), для изготовления лекарственного средства для восстановления иммунологической толерантности у индивидуума.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу восстановления иммунологической толерантности у индивидуума, причем указанный способ включает введение флагеллина Roseburia и/или полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный флагеллин Roseburia, и/или вектора, содержащего указанную полинуклеотидную последовательность, и/или клетки-хозяина, содержащей указанный вектор, и/или клетки-хозяина, содержащей указанную полинуклеотидную последовательность, и/или Roseburia (таких как вид бактерий Roseburia hominis или вид бактерий Roseburia intestinalis), и где происходит восстановление иммунологической толерантности у индивидуума.

ЧЕРТЕЖИ

Фигура 1. Последовательность и аннотация генома R. hominis. Была получена полная геномная последовательность R. hominis A2-183. Она представлена одной хромосомой размером 3592125 п.н. с четырьмя рибосомальными оперонами, 66 РНК и 3273 прогнозируемыми белками. (A) Карта кольцевого генома R. hominis с указанием положения областей экспериментов ПЦР (таблица S1), на которые были нацелены праймеры. Дорожки на карте генома, начиная с наружной дорожки 0, представляют собой: дорожка 0 (синяя) - эксперименты ПЦР в реальном времени, указанные пронумерованными метками; дорожка 1 (голубой) - прямая CDS; дорожка 2 (голубой) - обратная CDS; дорожка 3 (серый) - рРНК; дорожка 4 (зеленый) - тРНК; дорожка 5 (красный) - маркирующие STS области, на которые нацелена ПЦР в реальном времени; кривая 1 - содержание GC; кривая 2 - смещение в сторону GC. (B) Функциональная аннотация генома R. hominis демонстрирует, что наибольшее число генов относится к генам углеводов, метаболизма белков, аминокислотам и производным.

Фигура 2. R. hominis отвечает на среду кишечника генами активации подвижности, мобилизации и хемотаксиса. Безмикробным самцам мышей GF C3H/HeN вводили культуру R. hominis через зонд в течение 28 суток и сравнивали с контрольными безмикробными животными. На 14 сутки и 28 сутки животных, которым вводили R. hominis (N=5), и контрольных животных (N=4) умерщвляли и подвздошную кишку, ободочную кишку и слепую кишку извлекали. (A) Подтверждение способом ПЦР в реальном времени генов, вовлеченных в переход конъюгация/мобилизация. (B) Подтверждение способом ПЦР в реальном времени генов, вовлеченных в подвижность и хемотаксис. (C) Вестерн-блоттинг R. hominis, выращенных in vitro в присутствии УФ-облученного стандартного корма для мышей, подвергнутых иммунному окрашиванию антителом Fla1, подвергнутым аффинной очистки, специфичной к Fla2 антисывороткой и антителом против ДНК-гиразы A (дорожка 1: без корма, дорожка 2: 0,01 г корма/10 мл культуры R. hominis, дорожка 3: 0,02 г корма /10 мл, дорожка 4: 0,05 г корма/10 мл, дорожка 5: 0,1 г корма/10 мл, дорожка 6: 0,2 г корма/10 мл, дорожка 7: 0,5 г корма/10 мл, дорожка 8: 1 г корма/10 мл). Изображение R. hominis, полученное с использованием электронной микроскопии (EM), демонстрирующее жгутики (черные стрелки). Иммуногистохимия, проведенная для бактерий из содержимого просвета колонизированных мышей и для R. hominis, выращенных in vitro с использованием специфичной к FlaA1 и FlaA2 антисыворотки. Исходное увеличение x1000. (D) Подтверждение с использованием ПЦР в реальном времени генов, вовлеченных в метаболизм бутирата. (E) Анализ с использованием ПЦР в реальном времени транскриптов R. hominis в процессе воздействия in vitro эпителиальных клеток кишечника человека. Результаты ПЦР в реальном времени представлены в качестве кратности изменения, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Фигура 3. Идентификация транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в кишечнике мыши после моноассоциации с R. hominis. (A) Анализ на микрочипах Affymetrix дифференциально экспрессируемых генов у мышей, колонизированных R. hominis (N=5), относительно GF (N=4). Столбиковые диаграммы соответствуют числу генов, выше или ниже экспрессируемых после 14 и 28 суток. (B) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов с функциональной значимостью между мышами GF и мышами, колонизированными R. hominis, на 14 сутки и 28 сутки. (C) Подтверждение с использованием ПЦР в реальном времени генов, для которых было показано, что они значимо различаются между мышами, колонизированными R. hominis, и мышами GF. Результаты ПЦР в реально v времени представлены в качестве кратности изменения, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Фигура 4. Индукция клеток FoxP3+ Treg посредством Roseburia hominis. Проточно-цитометрический анализ клеток FoxP3+ Treg в собственной пластинке (P=0,0425 между контрольным введением и введением R. hominis) и брыжеечных лимфатических узлах (P=0,0683) общепринятых C3H/HeN, которым проводили введение R. hominis в течение 14 суток.

Фигура 5. Маркеры T-клеток ободочной кишки в значительной степени индуцируются моноколонизацией R. hominis. (A) Иммунофлуоресцентный анализ клеток собственной пластинки восходящей ободочной кишки с помощью антител против CD3 и антител против FoxP3 у безмикробных мышей и мышей, моноколонизированных C3H/HeN R. hominis (N=8) и мышей C57Bl/6 (N=3). (B) Иммунофлуоресцентный анализ клеток собственной пластинки с использованием (i) антитела против Ly6G, (ii) антитела против CD11b, (iii) антитела против CD3, и (iv) антитела против CD3 и антитела против FoxP3 в восходящей ободочной кишке мышей C3H/HeN GF и мышей C3H/HeN, которым вводили R. hominis. Данные выражали в качестве числа положительных клеток на поле зрения у мышей GF (N=7-8) и у мышей, которым вводили R. hominis (N=8-10). *P<0,05. Исходное увеличение x630.

Фигура 6. Флагеллин RH1 R. hominis имеет определенные эффекты на эпителиальные клетки кишечника и происходящие из костного мозга мыши дендритные клетки. (A) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессированных генов в эпителиальных клетках кишечника Caco-2 (N=1), обработанных различными бактериальными флагеллинами Salmonella enteritidis (SE), E. coli K12 (EC), RH1 и RH2. (B) Экспрессия (i) CD40; (ii) I-A/I-E и (iii) CD103 происходящими из CD11c+B220+CD317+ Flt3L дендритными клетками из общепринятых C3H/HeN, контролей (синий) и после инкубации в течение 24 с рекомбинантным флагеллином (SE, K12, RH1, RH2; зеленый), определенная проточной цитометрией. Гистограмма, на которой представлены данные трех экспериментов. (C) Частоты обработанных рекомбинантным флагеллином (SE, K12, RH1, RH2) полученных с помощью Flt3L и GMCSF дендритных клеток из общепринятых C3H/HeN, улавливаемых в качестве CD11c+B220+CD317+ клеток и CD11c+CD11b+B220- клеток, соответственно. Данные представлены в качестве среднего значения ± SEM процента от всех, живых и единичных клеток, для всех трех экспериментов. (D) Белковую экспрессию цитокинов IL-10 и IL-12 измеряли посредством CBA в супернатантах контрольных (нестимулированные DC; N=3) и обработанных RH1 DC (N=3), происходящих из C3H/HeN и C57Bl/6. Данные представлены в качестве среднего значения ± SD. ***P<0,001. (E) Количественный анализ посредством иммунофлуоресцентного мечения клеток собственной пластинки ободочной кишки антителами против CD3 и антителами против FoxP3 у безмикробных мышей TLR5KO и моноколонизированных посредством R. hominis мышей TLR5KO (N=2).

Фигура 7. R. hominis ослабляет воспаление в экспериментальной модели колита. Двадцать двух самок мышей C57BL/6 использовали для оценки терапевтического эффекта R. hominis в ходе индуцируемого DSS колита. Мышам, которым проводили введение, дозировали каждые сутки 109 к.о.е. R. hominis в течение 14 суток. Начиная с 8 суток мышам вводили DSS в их питьевой воде в течение 6 суток. Животных умерщвляли на 14 сутки и проводили взятие образцов ткани кишечника. (A) У мышей DSS без введения (N=8) происходило выраженное увеличение экспрессии всех генов по сравнению с контрольными мышами (N=4), в то время как дифференциальная экспрессия генов была более низкой у животных, которым вводили R. hominis (N=10). Результаты ПЦР в реальном времени представлены в качестве кратного изменения, ***P<0,001. (B) Гистопатологическая оценка ткани, представленная в качестве среднего процента полей зрения с данной степенью. Введение DSS значительно изменяло все поля зрения со степенями 0, 2, 3 и 4. R. hominis значительно снижали % полей зрения для патологии степени 4 (p=0,02) и увеличивали % полей зрения для степени 0. Данные представлены в качестве среднего значения ± SD. (C) Восходящая ободочная кишка (окрашенная гематоксилином/эозином) контрольных животных IL-10KO, которым вводили DSS, и животных IL-10KO, которым вводили DSS/R. hominis. Представленные изображения представляют собой репрезентативные поля зрения для каждой группы введения. Исходное увеличение x100.

Дополнительные Фигуры

Фигура S1. R. hominis предпочтительно колонизируют восходящую ободочную кишку моноколонизированных мышей. (A) R. hominis колонизировали восходящую ободочную кишку кишечника мышей с тесной ассоциаций бактерий с эпителием хозяина, обнаруженной посредством FISH с использованием A2-183 (зонд, специфический для R. hominis; FITC), Eub338 (универсальный зонд 16S; Cy3) и DAPI (ядра; синий). Также показано наложение A2-183 + Eub338 и Eub338 + DAPI. Величина гамма для красного канала была увеличена для наложения Eub338 + DAPI для иллюстрации меченных бактерий. Original magnification x630. (B) ПЦР с использованием праймеров, специфических для R. hominis, продемонстрировала положительный сигнал в ДНК фекалий после колонизации, в то время как фекалии животных GF были отрицательными в отношении присутствия каких-либо бактерий. (C) Анализ способом ПЦР в реальном времени, демонстрирующий уровни колонизации R. hominis/г фекалий. Бактериальную ДНК, выделенную из фекалий, сравнивали с известными стандартными концентрациями R. hominis, выращенных в культуре. Аналогичные уровни бактерий были обнаружены у всех моноколонизированных мышей, приближаясь к 1x1010 бактерий/г фекалий. Результаты исследования фекалий животных GF были отрицательными в отношении присутствия каких-либо бактерий.

Фигура S2. Анализ генной онтологии, проведенный для генов, активированных через 28 суток в восходящей ободочной кишке кишечнике. Функциональную интерпретацию данных генной онтологии (GO) проводили с использованием DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov). Значимо отличающиеся транскрипты (P<0,05) были отнесены к категории GO "биологический процесс", чтобы найти значительно увеличенные значения GO. Снижались биологические процессы GO для "полимеризации актина" (GO:0030041) и "отрицательной регуляции каскада I-каппа B киназа/NF-каппа B" (GO:0043124).

Фигура S3. Идентификация транскриптов, дифференциально эксперссируемых в кишечнике мыши после моноассоциации с E. coli. (A) Анализ на микрочипах Affymetrix дифференциально экспрессируемых генов у мышей, колонизированных E. coli и R. hominis с течением времени. Столбиковые диаграммы соответствуют числу генов, выше или ниже экспрессируемых после 22 и 28 суток, соответственно. (B) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов с функциональной значимостью у мышей, колонизированных E. coli, на 22 сутки против 10 суток.

Фигура S4. Идентификация транскриптов, дифференциально экспрессируемых в кишечнике мышей TLR5KO после моноассоциации с R. hominis. (A) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов в восходящей ободочной кишке мышей TLR5KO, колонизированных R. hominis (N=3), и мышей дикого типа (N=3) на 28 сутки. (B) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов, ассоциированных с иммунитетом, в восходящей ободочной кишке мышей TLR5KO, колонизированных R. hominis, и мышей дикого типа на 28 сутки. (C) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов в подвздошной кишке мышей TLR5KO, колонизированных R. hominis, и мышей дикого типа на 28 сутки. (D) Тепловая карта, полученная для дифференциально экспрессируемых генов, ассоциированных с иммунитетом, в восходящей подвздошной кишке мышей TLR5KO, колонизированных R. hominis, и мышей дикого типа на 28 сутки.

Фигура S5. Анализ генной онтологии, проведенный на генах, подавляемых через 28 суток в восходящей кишке. В наибольшей степени снижались биологические процессы GO, вовлеченные в регуляцию аппетита, такие как "отрицательная регуляция ответа на пищу" (GO:0032096), "отрицательная регуляция аппетита" (GO:0032099) и "регуляция секреции катехоламинов" (GO:0050433).

Фигура S6. Колонизация R. hominis влияет на гены сытости и массы тела. Анализ сухой массы тела и липидного каркаса. (A) Сухая масса туши мышей, которым вводили R. hominis, была значительно большей по сравнению с животными GF. (B) Анализ массы туши показал, что общая тучность также была значительно более высокой у животных, которым вводили R. hominis, через 14 суток. Данные представлены в качестве среднего значения ± SD.

Фигура 1A. Представление клонирующего вектора PCR-Blunt II-TOPO, использованного для клонирования рекомбинантных флагеллинов, нерастворимых после лизиса клеток. На нем показано высокоэффективное клонирование ДНК продуктов ПЦР с тупыми концами. Она кодирует гены устойчивости канамицина и зеоцина для селекции в E. coli, и вкладыш фланкируется множеством участков рестрикции для вырезания.

Фиг.2A. Представление экспрессирующего вектора T7-MAT-Tag-FLAG-, использованного для клонирования рекомбинантных флагеллинов, нерастворимых после лизиса клеток. Участок множественного клонирования (MCS) фланкируется последовательностью MAT (металлсодержащая аффинная метка) и последовательностью пептида FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), которая приводит к продукции флагеллина с двойным мечением, который далее может быть очищен с использованием аффинных колонок. Этот экспрессирующий вектор также кодирует промотор pT7/lac (lac-оперон фага T7) для индуцируемой IPTG экспрессии на высоком уровне рекомбинантных флагеллинов MAT-ORF-FLAG, внутреннего гена lacI, который подавляет транскрипцию в базальном состоянии в любом хозяине E. coli, и ген AmpR для селекции с ампициллином.

Фигура 3A. Визуализация на SDS-PAGE рекомбинантного флагеллина, клонированного с использованием клонирующего вектора PCR-Blunt II-TOPO и экспрессированного с использованием экспрессирующего вектора pT7-MAT