Результат интеллектуальной деятельности: БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНЫХ СРЕД ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к биотехнологии и экологии и может быть использовано при ликвидации нефтяных загрязнений в местах разливов нефти и нефтепродуктов при добыче, транспортировке и хранении, в том числе в заболоченных районах Севера.

В настоящее время для ликвидации загрязнений нефтепродуктами успешно применяют биологические методы. Используемые биопрепараты включают различные нефтеокисляющие микроорганизмы - бактерии и реже грибы.

Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов «Нафтокс» (патент RU 2053206, МПК В09С 1/10), включающий нефтеокисляющие бактерии, нормальные парафины С12-С18, щавелевокислый аммоний и воду. Недостатком данного биопрепарата является его невысокая эффективность при очистке от нефти и дизельного топлива, а также биопрепарат рекомендуется использовать при оптимальной температуре в поверхностном слое воды не ниже 20°С и при спокойной воде.

Известен биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2174496, МПК C02F 3/34, В09С 1/10) на основе R-диссоциантов штаммов Rhodococcus rubber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, выращиваемых на средах с высоким содержанием морской соли. Недостатком данного биопрепарата является наличие в консорциуме штаммов только прокариотических микроорганизмов (бактерий), что сужает возможности при очистке окружающей среды от углеводородов.

Наиболее близким к заявляемому является биопрепарат для очистки окружающей среды от углеводородов (патент RU 2384616, МПК C12N 1/26, C02F 3/34), состоящий из консорциума штаммов микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. ВКПМ AC-1258 и дрожжей Candida sp. ВСБ-616. Недостатком биопрепарата является недостаточная эффективность при очистке от высоких концентраций нефти и водорастворимых углеводородов (утилизация объемного 1% нефти).

Техническим результатом настоящего изобретения является создание биопрепарата, представляющего собой консорциум микроорганизмов, который эффективно очищает объекты окружающей среды от нефти и водорастворимых нефтепродуктов при повешенной их концентрации.

Технический результат достигается тем, что биопрепарат представляет собой консорциум микроорганизмов, включающий биомассу культур бактерий Rhodococcus eqvi Р-72-00, дрожжевого гриба Rhodotorula glutinis 2-4 М и мицелиального гриба Trichoderma lignorum F-98, а также микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer.

Преимуществом предлагаемого биопрепарата является объединение биомассы бактериальной культуры, дрожжевой культуры и мицеального гриба, а также культуры микроводрослей. При этом в консорциуме при биодеструкции участвуют активные микроорганизмы-нефтедеструкторы (дрожжи и бактерии), микроорганизмы (микроводоросли), адаптированные к водным условиям, устойчивые к токсическому воздействию и способствующие биодеструкции углеводородов в воде, и микроорганизмы (мицелиальный гриб), проявляющие устойчивость и нефтедеструктивную активность к углеводородам только в композиции, но повышающие эффективность биодеструкции биопрепарата в целом.

Используемые культуры микроорганизмов: бактериальная - штамм Rhodococcus eqvi Р-72-00, депонированный в ФГУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» под регистрационным номером В-1117 (справка о депонировании №2705 от 18.11.2005); дрожжевая - штамм дрожжевого гриба Rhodotorula glutinis 2-4 М, депонированный в ФГУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» под регистрационным номером Y-1112 (справка о депонировании №2205 от 18.11.2005); грибная культура - штамм мицеллиального гриба Trichoderma lignorum F-98 (синоним Trichoderma viride F-98) с паспортом ВКПМ (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов); культура зеленых микроводорослей - Chlorella vulgaris Beijer находятся в лаборатории Радиоэкологии Института биологии Коми научного центра УрО РАН. Микроорганизмы, входящие в биопрепарат, и их консорциумы характеризуются как экологически нетоксичные.

Используемые культуры бактерий Rhodococcus eqvi и дрожжей Rhodotorula glutinis избирательны в отношении биодеградации углеводородов разных классов (Маганов, Маркарова, Муляк и др., 2006: Природоохранные работы на предприятиях нефтегазового комплекса. Часть 1. Рекультивация загрязненных нефтью земель в Усинском районе Республики Коми. - Сыктывкар, 2006. - 208 с.). Бактерии рода Rhodococcus относятся к липофильным микроорганизмам, которые за счет вырабатывания биосюрфактантов (поверхностно-активных веществ) способны развиваться непосредственно в нефтяной пленке. Дрожжевой гриб Rhodotorula glutinis имеет отличный от бактериального путь энзиматической биодеградации углеводородов, поэтому в сочетании с бактериальной культурой более полно разлагает нефтяные углеводороды. Используемая термофильная культура одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer отличается очень высокой экологической пластичностью к антропогенным факторам (перепадам рН, температур и содержанию минеральных солей в воде), выполняет функцию ассимиляции кислорода в зону окисления углеводородов, применяется в ассоциации микроорганизмов, т.к. культура наиболее адаптирована к стрессовым условиям водного загрязнения. Используемый штамм Trichoderma lignorum F-98 (синоним Trichoderma viride F-98) относится к целлюлозолитическим микромицетам, но при абсорбционном способе питания именно в сочетании с бактериальной культурой проявляет нефтедеструктивную активность, являясь матрицей для бактериальных клеток.

Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические характеристики микроорганизмов обоснованы паспортными и идентификационными данными.

Каждую культуру консорциума штаммов микроорганизмов получают и хранят отдельно. Соотношение различных микроорганизмов определяется в зависимости от вида загрязнения и способа применения (температура, рН окружающей среды и др.). Концентрация жизнеспособных аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в биопрепарате не менее 5·10^7-9кл/мл достаточна для его эффективного применения. Расход смешанного биопрепарата зависит от концентрации загрязняющих веществ, в частности, расходуется не менее 10 л препарата на тонну очищаемой нефтезагрязненной воды при нефтезагрязнении 3% от объема воды, что соответствует 20 кг нефти/1 т воды.

Пример 1. Получение биопрепарата.

Монокультуры аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов накапливали глубинным культивированием на индивидуальной питательной среде при контроле и соблюдении оптимальных параметров культивирования.

Среда Чапека (Rhodococcus equi P-72-00):10,0 г сахарозы; КН2РO4 1,0; NaNO3 3,0; KCl 0,5; MgSO4×7H2O 0,5; FeSO4×7H2O 0,01; 0,5% ДТ.

Среда Ридер (Rhodotorula glutinis 2-4 M):10,0 г сахарозы; (NH4)2 SO4 3,0 г;

MgSO4×7H20 0,7 г; NaCl 0,5 г; KH2PO4 1,0 г; К2НРO4 0,1 г; Ca(NO3)2 0,4 г; 0,5% ДТ.

Среда Кнопа (Trichoderma lignorum F-98):10,0 г сахарозы, Ca(NO3)2×4Н2O 1,44;

KNO3 0,25; KCl 0,12; KH2PO4 0,25; MgSO4·7H2O 0.51; 0,5% ДТ.

Среда Тамия (Chlorella vulgaris Beijer) г/л: KNO3 5,0; MgSO4×7H2O 2,5;

KH2PO4×3H2O - 1,25; FeSO4 - 0,003 (при естественном освещении).

Биопрепараты бактериальный, дрожжевой и грибной после глубинного культивирования на индивидуальной для каждой культуры комбинированной (углеводно-углеводородной) питательной среде содержат монокультуры в концентрации не менее 1-10¹⁰ КОЕ/мл или биомассу микроорганизмов 3-6 г/л. Накопительную культуру зеленых водорослей Chlorella vulgaris Beijer получали культивированием простым и малозатратным способом на среде Тамия при естественном освещении или по методике (Григорьев Ю.С., Андреев А.А. «Устройство для выращивания микроводорослей». Патент №2165973), концентрировали центрифугированием при 2000 об/мин с показателями по биомассе не менее 3 г/л.

Пример 2. Испытание биопрепарата.

В колбы заливают минеральную среду Раймонда следующего состава: Na2CO3 0,1; СаСl2×6 Н2O 0,01; MnSO4 X 7 H2O - 0,02; FeSO4 0.01; Na2HPO4 1,5; KH2PO4 1,5; KH2PO4 1,0; MgSO4×7 Н2O 0,2; NH4Cl 2,0; NaCl 5,0, pH 6,5. В качестве единственного источника углерода добавляют нефть (использовали тяжелую нефть, с высоким содержанием парафинов и смолисто-асфальтовых веществ Возейского месторождения Усинского района Республики Коми) в количестве 3 об.% (20 г/л). По вариантам добавляют накопительные культуры микроорганизмов из расчета, чтобы общее количество вносимого биопрепарата при соотношении монокультур не более 2 об.% (0,1 г сухого вещества) с исходным титром от 10⁷ до 10⁹. Колбы в динамичных условиях (при 220 об/мин и температуре 25°С) наблюдаются в течение 10 суток.

В таблице представлено снижение концентрации нефтепродуктов (по отношению к исходному содержанию нефти) и накопление биомассы и общей микробной численности (ОМЧ по количеству колониеобразующих единиц КОЕ/мл) накопительных монокультур в минеральной среде Раймонда, загрязненной нефтью из расчета 20 г/л воды, где в качестве единственного источника питания и энергии использованы нефтяные углеводороды (НУГВ).

Наилучшие результаты по снижению в вариантах 6 и 4, 5, но по внешним данным в колбе с бактериально-грибной ассоциацией (вариант 4) на стенках колбы и в воде не было нефтяной пленки. Образовался конгломерат из биомассы мицелия и бактерий бурого цвета (гриб сорбировал нефть и являлся матрицей для бактерий, которые находились и в воде, и на грибном мицелии). В 6 варианте с четырьмя культурами принудительного освещения оказалось достаточно для развития водорослей и более полного разложения нефти консорциумом микроорганизмов.

Представленные данные показывают высокую эффективность биопрепарата, составленного из 4 монокультур, относящихся к различным таксономическим группам микроорганизмов. Сочетание бактериальной и дрожжевой монокультур, являющихся высокоактивными нефтедеструкторами, с мицелиальным грибом и зелеными микроводорослями, относящимися к устойчивым к нефтяным углеводородам микроорганизмам, является особенностью данного биопрепарата и проявляется способностью к соокислению нефтяных углеводородов в ассоциации микроорганизмов и высокой жизнеспособностью данного консорциума микроорганизмов.