Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ШТАММОВ Corynebacterium diphtheriae биовара gravis

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний.

Эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией предусматривает наблюдение за биологическими свойствами возбудителя - токсигенными Corynebacterium diphtheriae (C.diphtheriae), основной фактор патогенности которых - дифтерийный токсин определяет патогенез заболевания (1, 2, 4, 5). Известно, что вид C.diphtheriae по способности разлагать крахмал подразделяется на два биоварианта - биовар gravis и биовар mitis. Определение принадлежности к тому или иному биовару является составной частью идентификации и наблюдения за возбудителем дифтерии (3). Вместе с тем, многочисленные исследования показали, что степень тяжести заболевания коррелирует с выделением того или иного биовара и наиболее тяжелое течение наблюдается при биоваре gravis (2, 4). Поэтому до настоящего времени существует проблема ускоренного определения биовара, что будет способствовать назначению своевременного и адекватного лечения.

Задачей настоящего изобретения является разработка ускоренного и специфичного способа дифференциации штаммов C.diphtheriae биовара gravis, основанного на выявлении генетической мишени в гене амилазы (amy), определяющем способность продуцировать фермент амилазу.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ дифференциации штаммов C.diphtheriae по принадлежности к биовару gravis, основанный на выявлении фрагмента гена амилазы (amy) размером 839 п.о. с помощью полимеразной цепной реакции при использовании специфических для этого фрагмента пары праймеров AmyF1 5′-TTGATCCGCACCTCGGTTCC-3′ и AmyR1 5′-GTACCTTGTCATCATTATCA-3′, последующим электрофорезом продуктов амплификации и дифференциации путем сравнения электрофоретической подвижности этих ампликонов с подвижностью маркерных фрагментов ДНК; при наличии специфической светящейся полосы на уровне 839 п.о. данные штаммы регистрируются как C.diphtheriae биовар gravis.

Проанализировав последовательность нуклеотидов гена DIP0357 (amy), определив генетическую мишень (последовательность нуклеотидов), сконструировали 10 пар праймеров, которые фланкировали, 10 взаимно перекрывающихся участков гена amy, размер которых варьировал от 749 до 840 пар оснований (п.о.). После проведения амплификации этих фрагментов ДНК выявлялись специфические светящиеся полосы у штаммов C.diphtheriae биовара gravis. Секвенирование всех 10 полученных фрагментов соответствовали базе данных EMBL/GenBank (BX248353), что указывает на специфичность сконструированных праймеров. Исследования последовательности нуклеотидов гена DIP0354 (pseudogene), предшествующего amy гену, показали, что данный ген и amy ген у штаммов C.diphtheriae биовара mitis отсутствует. Исследований по изучению генетической детерминанты амилазной активности у штаммов C.diphtheriae нигде в мире не проводилось.

Таким образом, данные исследования показали, что штаммы C.diphtheriae биовара mitis имеют делецию участка генома, что объясняет факт невозможности штаммами биовара mitis продуцировать фермент амилазу. Обнаружение этого факта явилось основанием для выбора специфического фрагмента внутри amy гена и разработки способа дифференцирования штаммов C.diphtheriae по биовару gravis, основанного на полимеразной цепной реакции.

Для постановки ПЦР использовали праймеры AmyF1 5′-TTGATCCGCACCTCGGTTCC-3′ и AmyR1 5′-GTACCTTGTCATCATTATCA-3′, которые фланкируют участок гена amy размером 839 п.о. Последовательность нуклеотидов:

Продукты ПЦР были подвергнуты электрофорезу в агарозном геле и дифференциации полученных ампликонов путем сравнения электрофоретической подвижности ампликонов фрагментов ДНК исследуемых штаммов C.diphtheriae с подвижностью маркерных фрагментов ДНК. В дорожке, соответствующей штамму C.diphtheriae биовара gravis, должна быть яркая специфическая светящаяся полоса на уровне 839 п.о. Таким образом, положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 839 п.о. большей или меньшей интенсивности, и данные штаммы регистрируются как C.diphtheriae биовар gravis.

Апробация данного способа дифференцирования штаммов C.diphtheriae была проведена на 99 штаммах C.diphtheriae биоваров gravis и mitis, и C.ulcerans. Общепринятыми фенотипическими методами показано, что среди них было 30 токсигенных штаммов биовара gravis, 20 нетоксигенных штаммов биовара gravis, 19 токсигенных штаммов биовара mitis, 21 нетоксигенных штаммов биовара mitis (свежевыделенные и музейные культуры из коллекции ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора) и 9 штаммов C.ulcerans.

Сравнительные исследования по фено- и генотипированию полностью коррелировали и точно дифференцировали штаммы биовара gravis (50 штаммов C.diphtheriae принадлежали к биовару gravis). Проведенные исследования свидетельствуют о том, что применение данного способа дифференцирования штаммов C.diphtheriae, основанного на ПЦР, позволяет точно отличать штаммы C.diphtheriae биовара gravis.

Техническим результатом заявленного изобретения является точный, ускоренный и высокоспецифичный способ дифференцирования штаммов C.diphtheriae по генетической детерминанте, ответственной за синтез фермента амилазы, с целью выявления принадлежности штаммов к биовару gravis, что является необходимой составляющей эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией и будет способствовать назначению своевременного и адекватного лечения.

Пример.

Штаммы C.diphtheriae выращивали на сывороточном агаре. Через 24 часа после появления роста изолированных колоний отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 300 мкл деионизованной воды, выдерживали 15 мин при 95°С, центрифугировали при 13000 оборотов 1 мин и 1 мкл супернатанта добавляли в реакционную смесь. ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации. ПЦР смесь содержала 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris/HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.0 мкМ каждого праймера, 200 мкМ каждого нуклеотида и 1 U Taq DNA полимеразы в окончательном объеме 30 мкл. Полученные ампликоны подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа. Гель окрашивали стандартным раствором этидия бромида и результат реакции выявляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали. Учет результатов реакции осуществляли путем определения размеров ампликонов. В качестве маркера молекулярных весов использовали DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Так, если у исследуемого образца ДНК штамма C.diphtheriae регистрировалась специфическая полоса на уровне 839 п.о., то он соответствовал биовару gravis. Таким образом, результат данного исследования - дифференциация штаммов C.diphtheriae биовара gravis.

Литература

1. Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова Н.Н., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou A. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2001, 3, 3-8.

2. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Герасимова С.В., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П. «Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae». в сборн. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)". - 2000. - стр.52-55.

3. Методические указания «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. МУ 4.2.698 - 98». Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Жилина Н.Я. - МЗ России. - 1998. - 48 стр.

4. Платонова Т.В., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г. «Биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпипроцесса». в сборн. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)". - 2000. - стр.52-59.

5. Popovic Т., Kombarova S.J., Reeves M.W., Mazurova I.K., Nakao H., Wachsmuth I.K., Wenger J.D. Molecular epidemiology of diphtheriae in Russia, 1984-1994. Journal of Infectious diseases. - 1996. - vol.174. - p.1064-1072.