ХИМИЧЕСКИ УСТОЙЧИВЫЕ КОМПОЗИЦИИ 4-ГИДРОКСИ-ТАМОКСИФЕНА

Настоящее изобретение относится к химически устойчивым композициям изомеров 4-гидрокси-тамоксифена (4-ОНТ), активного метаболита лекарства тамоксифен.

Тамоксифен действует на рецепторы эстрогена по всему телу и, в качестве как агониста, так и антагониста, вызывает широкий спектр системных эффектов. Его часто прописывают против рака груди, потому что он блокирует эффекты эстрогена в ткани груди, замедляя или останавливая вследствие этого рост уже присутствующих раковых клеток и предотвращая развитие нового рака. Из-за своего широкого спектра действия тамоксифен вызывает значительные побочные эффекты, которые увеличивают риск эндометриального рака, эндометриальной гиперплазии и полипов, тромбоза глубоких вен, легочной эмболии, изменения уровней ферментов печени и токсичности для глаз, включая катаракты. К тому же пациенты, которых лечат тамоксифеном, жалуются на приливы, влагалищные выделения, депрессию, аменорею и тошноту.

Из-за недостатков тамоксифена ряд исследователей в области рака предложили замещение 4-гидрокси-тамоксифеном в качестве лечения рака груди. 4-гидрокси-тамоксифен действует как избирательный модулятор рецептора эстрогена (ИМРЭ) (SERM), который проявляет ткане-специфичность по отношению к чувствительным к эстрогену тканям. В ткани груди он действует как антагонист эстрогена. Исследования показали, что 4-гидрокси-тамоксифен может регулировать транскрипционную активность относящихся к эстрогенам рецепторов, что может вносить вклад в его ткане-специфичную активность. In vitro 4-гидрокситамоксифен проявляет большую эффективность, чем тамоксифен, как измеряют по сродству связывания с рецепторами эстрогенов, или РЭ, и сродству связывания с рецепторами эстрогенов, близкому к таковому у эстрадиола (Robertson et al., 1982; Kuiper et al., 1997).

Данные исследований поддерживают применение 4-гидрокси-тамоксифена для лечения рака груди. В исследованиях in vitro 4-гидрокси-тамоксифен ингибирует рост как нормальных клеток, так и клеток рака груди (Nomura, 1985; Malet, 1988, 2002; Charlier, 1995). К тому же при трансдермальной доставке 4-гидрокси-тамоксифен проявляет противораковое действие на опухоли рака груди человека, выращенной подкожно у мыши (патент US №5904930). У людей ограниченные эксперименты показали, что назначенный чрескожно 4-гидрокси-тамоксифен может концентрироваться в местных опухолях груди при очень малом системном распределении (Mauvais-Jarvis, 1986). 4-Гидрокси-тамоксифен также подает надежды для лечения масталгии, чрезмерного рубцевания и гинекомастии и для уменьшения плотности груди.

В химической структуре 4-гидрокси-тамоксифена, или 1-[4-(2-N-диметиламиноэтокси)фенил]-1-(4-гидроксифенил)-2-фенилбут-1-ена, двойная связь между двумя атомами углерода дает начало двум стереоизомерным формам. В отличие от тамоксифена у 4-гидрокси-тамоксифена нет двух одинаковых фенильных групп, а есть скорее четыре различные группы, разнесенные по разные стороны от алкеновой группы. Поэтому терминология цис-транс точно не вполне точно приложима к изомерам 4-гидрокси-тамоксифена. Вместо этого точно применимы обозначения Е от немецкого «entgegen», означающего против (напротив) и Z от немецкого «zusammen», означающего вместе (см. фиг.1 и 2). Оба изомера 4-гидрокси-тамоксифена биологически активны, но изомер Z более активен биологически, чем изомер Е (патент US 6172263).

В твердом состоянии смесь изомеров 4-гидрокси-тамоксифена очень устойчива. В растворе, однако, происходит изомеризация между формами Z и Е. Malet et al. наблюдали, что спонтанная изомеризация Z- в Е-4-гидрокси-тамоксифен происходит за время 24-48 часов, но быстро стабилизируется при соотношении Z/E равном 70/30 как в маточном растворе, так и в культуральной среде или культивированных клетках и независимо от температуры (-20°С, 4°С или 37°С). См. Malet et al. (2002). Katzenellenbogen et al. далее показали, что изомеры гидрокси-тамоксифена, исходно чистые на 99%, претерпевают зависимую от времени и температуры изомеризацию, так что через 2 дня в среде для культуры ткани при 37°С они изомеризовались в пределах 20%. Такая изомеризация происходит более медленно при 4°С, чем при 37°С и ее скорость можно уменьшить с помощью различных антиоксидантов. См. Katzenellenbogen et al. (1985). Согласно Sigma, поставщику 4-гидрокси-тамоксифена, процессу взаимопревращения Е-Z 4-гидрокси-тамоксифена способствуют растворители с низкой диэлектрической постоянной на свету и при инкубации в культуральной среде.

Процесс изомеризации потенциально может влиять на активность фармацевтической композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен в качестве активного ингредиента. Следовательно, для того, чтобы удовлетворять международным фармацевтическим законным требованиям, есть потребность в химически устойчивых композициях 4-гидрокси-тамоксифена. «Устойчивая» фармацевтическая композиция - это такая, чей качественный и количественный состав, включая физические, химические и биологические характеристики, существенно не меняются со временем в определенных условиях температуры и влажности, например, в течение 3 лет при 25°С/60% относительной влажности, 1 года при 30°С/65% относительной влажности и/или 6 месяцев при 40°С/75% относительной влажности. «Значительное изменение» относится к качественным и/или количественным различиям, которые могут влиять на силу, эффективность или безопасность фармацевтической композиции.

Для предоставления устойчивой композиции с 4-гидрокси-тамоксифеном было бы полезным более полное понимание процесса изомеризации 4-гидрокси-тамоксифена.

Раскрытие изобретения

Авторы настоящего изобретения открыли, что изомеризация 4-гидрокси-тамоксифена в растворе достигает равновесия при соотношении изомеров Z:E приблизительно 1:1. Более того, ими открыто, что как только это равновесное соотношение достигается, оно остается постоянным.

В согласии с этим открытием настоящее изобретение включает фармацевтические композиции с 4-гидрокси-тамоксифеном в качестве активного агента, где приблизительно 50% 4-гидрокси-тамоксифена существует в изомерной форме Z и остаток в изомерной форме Е. В отдельных осуществлениях фармацевтическая композиция составлена для чрескожного назначения в виде геля, раствора или другой фармацевтической формы, содержащей спирт и водный растворитель.

В отдельном примере гельной формуляции фармацевтические композиции включают:

а) приблизительно от 0,01% до 0,2% по весу 4-гидрокси-тамоксифена,

б) приблизительно от 0,5% до 2,0% по весу изопропил миристата,

в) приблизительно от 60% до 75% по весу абсолютного спирта,

г) приблизительно от 25% до 40% по весу водного растворителя,

д) приблизительно от 0,5% до 5% по весу желеобразующего агента, где процентное содержание компонентов является весовым относительно веса композиции.

В другом аспекте изобретение включает способ лечения или предотвращения клинических состояний посредством назначения пациенту, в ней нуждающемуся, фармацевтической композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен в качестве активного агента, где приблизительно 50% 4-гидрокси-тамоксифена присутствует в виде изомерной формы Z и оставшееся количество в виде изомерной формы Е. Клинические состояния, при которых применимо такое назначение, включают рак груди, масталгию, плотность ткани груди, чрезмерное рубцевание и гинекомастию.

С целями профилактики или лечения фармацевтические композиции можно назначать любым способом, который доставляет 4-гидрокси-тамоксифен к клеткам, несущим рецепторы эстрогенов, in vivo. Предпочтительно, чтобы назначение делали чрескожно (топикально) во избежание эффекта (метаболизма) первого круга и связанного с этим метаболизма 4-гидрокси-тамоксифена в печени. При чрескожном назначении 4-гидрокси-тамоксифен можно наносить на любую поверхность кожи. Нанесение (аппликация) на грудь предпочтительна, поскольку при чрескожном назначении 4-гидрокси-тамоксифен стремится сконцентрироваться в местных подкожных тканях с рецепторами эстрогенов.

Широкий спектр топикальных формуляций подходит для осуществления изобретения, но водно-спиртовые растворы и водно-спиртовые гели предпочтительны. Концентрация 4-гидрокси-тамоксифена в этих формуляциях может варьировать, но доза должна обеспечить такую местную концентрацию 4-гидрокси-тамоксифена в ткани, которая эффективно противодействует эффектам, обусловленным эстрогенами.

В другом аспекте настоящее изобретение включает набор для хранения, который включает:

а) фармацевтическую композицию с 4-гидрокси-тамоксифеном в качестве активного агента, где приблизительно 50% 4-гидрокси-тамоксифена присутствует в форме изомера Z и оставшееся количество в форме изомера Е,

б) контейнер, внутри которого содержится фармацевтическая композиция. В отдельных осуществлениях этого набора контейнером может быть упаковка на одну дозу или контейнер на несколько доз, такой как контейнер с дозирующим насосом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен в качестве активного агента, где приблизительно 50% 4-гидрокси-тамоксифена присутствует в форме изомера Z и оставшееся количество в форме изомера Е.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует Е и Z изомеры 4-гидрокси-тамоксифена.

Фиг.2 иллюстрирует обратимую изомеризацию 4-гидрокси-тамоксифена.

Фиг.3 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для фирмы Panchim, партии 98RD10079 при 25°С.

Фиг.4 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для фирмы Panchim, партии 98RD10079 при 30°С.

Фиг.5 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для фирмы Panchim, партии 98RD10079 при 40°С.

Фиг.6 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для фирмы ICI, партии Вх 17 при 40°С.

Фиг.7 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для растворов II-IV при 25°С.

Фиг.8 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для растворов II-IV при 30°С.

Фиг.9 иллюстрирует соотношение концентраций изомеров (в процентах) для растворов II-IV при 40°С.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основано на совершенно удивительном открытии, что изомеризация 4-гидрокси-тамоксифена в растворе приходит к равновесию при соотношении изомеров Z:E приблизительно 50:50, скорее, чем 70:30, как было показано Malet et al. и что это равновесное соотношение будучи однажды достигнуто остается постоянным. Изобретатели далее открыли, что взаимопревращение изомеров Е и Z 4-гидрокси-тамоксифена (см. фиг.2) является обратимой реакцией с константой равновесия К, определяемой следующей формулой:

где [Е] и [Z] равновесные концентрации соответствующих изомеров и k_f и k_r являются константами скорости прямой и обратной реакции соответственно. Скорости прямой и обратной реакции, следовательно, равны.

Это понимание поведения изомеров 4-гидрокси-тамоксифена делает возможным развитие химически устойчивых композиций, которые содержат приблизительно равные количества Z и Е изомеров 4-гидрокси-тамоксифена. В таких композициях изомеризация, происходящая между формами Z и Е, не влияет существенно на силу, эффективность или безопасность композиции.

Более того, ввиду суровости фармацевтических установок (правил), особенно в отношении устойчивости при хранении, требуется предоставлять продукты, состав которых не изменяется со временем. Поэтому является большим преимуществом предоставить формуляции, состав которых устойчив и таким образом надежно и точно определен (задан).

Опытному человеку известно, как определить относительные количества изомеров Z и Е в данной композиции. Например, как показано на примерах ниже, можно применять техники жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) для оценки соотношения Z/E.

Как обсуждалось выше, ранее в данной области техники описаны композиции с соотношением Z/E, составляющим 70/30. К тому же в данной области техники считается, что изомер Z обладает более высокой биологической активностью, чем его противоположность Е. Поэтому все вместе взятые предшествующие знания в данной области техники, по-видимому, направлены на композиции, обогащенные изомером Z.

Напротив, настоящее изобретение представляет композиции, включающие 4-гидрокси-тамоксифен с соотношением Z/E приблизительно 50/50, и способы получения таких композиций. Такое соотношение особенно подходит для назначения человеческому субъекту, поскольку оно в основном соответствует физиологическому равновесному соотношению in vitro, обнаруженному в тканях (Mauvais-Jarvis P et al., Cancer Research 1986, 46, 1521-1525).

Изобретатели поставили несколько опытов для изучения достижения равновесия между изомерами 4-гидрокси-тамоксифена в различных условиях по свету, температуре, рН и влажности, а также в различных средах, при разных концентрациях 4-гидрокси-тамоксифена и при разных соотношениях спирт/водный растворитель. Вкратце, они приготовили спиртовые растворы, содержащие разные концентрации 4-гидрокси-тамоксифена при разных соотношениях изомеров Z и Е, затем наблюдали за изомеризацией, происходившей в этих растворах с течением при различных температурах и значениях рН (см. Примеры ниже). К 6 месяцам достигалось устойчивое соотношение (приблизительно 1:1) изомеров Z и Е во многих условиях и наблюдалось ясная тенденция во всех условиях. Скорость достижения равновесия прямо зависела от температуры, рН, содержания спирта/водного растворителя, света и концентрации 4-гидрокси-тамоксифена. Во всех случаях воздействию подвергалась только скорость уравновешивания (см. Примеры ниже), но не конечное соотношение изомеров Z и Е, которое на удивление сохранялось приблизительно 1:1.

С точки зрения химической кинетики, диэлектрическая постоянная признается как одно из фундаментальных свойств, что влияет на сольволитические скорости реакции. В этой связи есть публикации, которые выдвигают на первый план влияние воды на деградацию молекул. Например, Sanyude et al. изучали влияние соотношения вода-спирт на деградацию аспартама. Они сообщают, что скорость деградации аспартама увеличивается с уменьшением диэлектрической постоянной среды растворителя, т.е. при уменьшении концентрации воды в среде. Напротив, авторы настоящего изобретения обнаружили, что скорость изомеризации 4-гидрокси-тамоксифена возрастает с увеличением диэлектрической постоянной среды растворителя, т.е. когда концентрация воды в среде растет.

В согласии с открытиями изобретателей настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, которые включают 4-гидрокси-тамоксифен, где около 50% 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z и оставшееся количество 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Е. В отдельных осуществлениях, около 45%-55%, около 46%-54%, около 47%-53%, около 48%-52%, около 49%-51% или около 50% 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z. Предпочтительно, около 49%-51% и более предпочтительно около 50% 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z. Такое содержание задается состоянием равновесия, а не при производстве фармацевтической композиции.

Равновесные соотношения изомеров Z и Е 4-гидрокси-тамоксифена можно получить в чисто спиртовой композиции или в смеси спиртового и водного растворителя посредством смешивания известных количеств изомеров или подвергая композицию воздействию условий, ускоряющих процесс уравновешивания, таких как высокая температура, высокое содержание 4-гидрокси-тамоксифена, высокое содержание водного растворителя или УФ свет. Изобретатели продемонстрировали, что молекулярный размер спирта (этанол или изопропанол) не влияет на скорость изомеризации.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно выпускать в любой формодозе, способной доставлять 4-гидрокси-тамоксифен к рецепторам эстрогенов in vivo. Предпочтительно, композиции составляют для «чрескожного назначения», фраза, означающая любой вариант доставки лекарства от поверхности кожи пациента через роговой слой, эпидермис и слои соединительной ткани в систему микроциркуляции. Это обычно достигается посредством диффузии по градиенту концентрации. Диффузия может происходить посредством внутриклеточного (интрацеллюлярного) проникновения (через клетки), межклеточного (интерцеллюлярного) проникновения (между клетками), чреспридаточного (transappendageal) проникновения (через волосяные луковицы (фолликулы), потовые и сальные железы) или в любой их комбинации.

Чрескожное назначение 4-гидрокси-тамоксифена имеет несколько преимуществ. Во-первых, избегается метаболизм в печени, происходящий вслед за оральным назначением (Mauvais-Jarvis et al., 1986). Во-вторых, чрескожное назначение значительно уменьшает системное воздействие лекарств и связанный с этим риск неспецифической активации рецепторов эстрогена по всему телу; это потому, что 4-гидрокси-тамоксифен задерживается (поглощается) в первую очередь в местных тканях. В частности, когда 4-гидрокси-тамоксифен чрескожно наносят на груди, высокие концентрации накапливаются в ткани груди, предположительно, благодаря большому числу рецепторов эстрогена в них, без образования высокой концентрации в плазме (Mauvais-Jarvis et al., supra).

Эффективность чрескожного назначения лекарств зависит от многих факторов, включая концентрацию лекарства, область поверхности нанесения, время и продолжительность нанесения, увлажненность кожи, физико-химические свойства лекарства и распределение лекарства между лекарственной формой и кожей. Лекарственные формуляции, предназначенные для чрескожного применения, используют преимущества этих факторов для достижения оптимальной доставки. Такие формуляции часто включают усилители проницаемости, что улучшает чрескожное поглощение, понижая сопротивление рогового слоя посредством обратимого изменения его физико-химических свойств, изменяя увлажненность рогового слоя, действуя как со-растворитель или меняя организацию липидов и белков в межклеточных пространствах. Такие усилители чрескожного поглощения включают поверхностно-активные вещества, ДМСО, спирт, ацетон, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жирные кислоты или жирные спирты и их производные, гидроксикислоты, пирролидоны, мочевину, эфирные масла и смеси вышеперечисленных. Вдобавок к химическим усилителям физические способы могут увеличивать чрескожное поглощение. Например, окклюзивные (герметичные) повязки вызывают увлажнение кожи. Другие физические способы включают ионофорез или сонофорез, которые применяют электрические поля или высокочастотный ультразвук соответственно для усиления поглощения лекарств, которые плохо поглощаются из-за их размера или ионных характеристик.

Много факторов и способов, относящихся к чрескожной доставке лекарств, рассмотрены в Remington: The Science and practice of pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2000) pp.836-58 и в Percutaneous Absorption: Drugs Cosmetics mechanisms methodology, Bronaugh and Maibach (Marcel Dekker, 1999). Как свидетельствуют эти публикации, на поприще фармацевтики можно управлять различными факторами и способами для достижения эффективной чрескожной доставки.

Для чрескожного назначения 4-гидрокси-тамоксифен может доставляться в водно-стиртовом растворе, водно-спиртовом геле, мази, креме, геле, эмульсии (лосьоне), порошке, масле или похожей формуляции.

В предпочтительных осуществлениях изобретения 4-гидрокси-тамоксифен заключают в спиртовую формуляцию, предпочтительно, водно-спиртовой гель. Количество 4-гидрокси-тамоксифена в таком геле может находиться в интервале от приблизительно 0,001 до приблизительно 1,0 г 4-гидрокси-тамоксифена на 100 г геля. Предпочтительно, оно находится в интервале от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,2 г 4-гидрокси-тамоксифена на 100 г геля. В таких осуществлениях 4-гидрокси-тамоксифен может составлять около 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19% или 0,20% от веса фармацевтической композиции.

Формуляции изобретения с 4-гидрокси-тамоксифеном, в основном, включают один или более неводный растворитель, такой как спиртовые растворители. Такие растворители должны быть способными к растворению как 4-гидрокси-тамоксифена так и любого применяемого усилителя проницаемости. У них также должна быть низкая температура кипения, предпочтительно менее 100°С при атмосферном давлении, чтобы позволить быстрое испарение при контакте с кожей. Предпочтительными спиртовыми растворителями являются этанол и изопропанол. В частности, этанол вносит эффективный вклад в чрескожное поглощение 4-гидрокси-тамоксифена, поскольку быстро испаряется при контакте с кожей. Количество растворителя в виде абсолютного спирта в формуляции изобретения находится между 35% и 99,9%, предпочтительно между 50% и 85%, более предпочтительно, между 60% и 75% по весу. Таким образом, количество абсолютных (безводных) неводных растворителей в гельной формуляции может быть около 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% или 75% по весу.

Формуляции также могут включать водный растворитель, которое позволяет растворять любые гидрофильные молекулы в формуляции и способствует также увлажнению кожи. Водный растворитель также может регулировать рН, предпочтительно, в интервале от приблизительно 4 до приблизительно 12, более предпочтительно в интервале от приблизительно 6 до приблизительно 11, даже более предпочтительно в интервале от приблизительно 8 до приблизительно 10 и всего предпочтительнее при приблизительно 9. Как показано ниже, рН и, следовательно, выбор буферного раствора, влияет на скорость достижения равновесия между изомерами Z и Е 4-гидрокси-тамоксифена. Конечное соотношение равновесия, однако, остается равным приблизительно 1:1 независимо от буфера.

Водные растворители включают защелачивающие и основные буферные растворы, включая фосфатные буферные растворы (например, одноосновный или двухосновный фосфат натрия), цитратные буферные растворы (например, цитрат натрия или цитрат калия) и просто очищенную воду. Фосфатный буфер предпочтителен по изобретению. Количество водных растворителей, предпочтительно, находится между 0,1% и 65% от веса фармацевтической композиции, более предпочтительно, между 15% и 50% и еще более предпочтительно между 25% и 40%. Таким образом, количество водного растворителя может быть около 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% или 40%. В случае, когда формуляция содержит водный растворитель, количество абсолютного спиртового растворителя в формуляции, предпочтительно, от приблизительно 60% до приблизительно 75%.

Формуляции с 4-гидрокси-тамоксифеном могут также содержать один или более усилитель чрескожного поглощения. Предпочтительными усилителями чрескожного поглощения являются эфиры жирных кислот. Одним сильно предпочитаемым эфиром жирной кислоты в качестве усилителя поглощения является изопропил миристат. Когда изопропил миристат применяют в геле, количество может находиться в интервале от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0 г на 100 г геля. Предпочтительно, количество изопропил миристата находится в интервале от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0 г на 100 г геля. В таких осуществлениях, изопропил миристат может составлять около 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% или 2,0% от веса фармацевтической композиции.

Дополнительно, формуляции с 4-гидрокси-тамоксифеном могут включать один или более желеобразующий агент для увеличения вязкости формуляции и/или чтобы действовать в качестве солюбилизирующего агента. В зависимости от природы желеобразующего агента он может составлять от 0,1% до 20% от веса формуляции, предпочтительно, между 0,5% и 10%, более предпочтительно между 0,5% и 5%. Таким образом, количество желеобразующего агента может быть около 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5% или 5%. Предпочтительные желеобразующие агенты включают карбомеры, производные целлюлозы, полоксамеры и полоксамины. В частности, желеобразующими агентами являются хитозан, декстран, пектины, природные смолы и производные целлюлозы, такие как гидроксипропил целлюлоза, гидроксиэтил целлюлоза, гидроксипропилметил целлюлоза (ГПМЦ), карбоксиметил целлюлоза (КМЦ) и т.п. Одним высоко предпочтительным желеобразующим агентом является гидроксипропил целлюлоза.

Когда формуляция включает желеобразующий агент, в частности акриловый полимер без предварительной нейтрализации, она может преимущественно включать также нейтрализующий агент. Соотношение нейтрализующий агент/желеобразующий агент предпочтительно находится между 10:1 и 0,1:1, более предпочтительно между 7:1 и 0,5:1 и еще более предпочтительно между 4:1 и 1:1. Таким образом, соотношение нейтрализующий агент/желеобразующий агент может составлять около

7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1 или 0,5:1. Нейтрализующий агент в присутствии полимера должен образовывать соли, растворимые в растворителе. Нейтрализующий агент также должен вызывать оптимальное набухание полимерных цепей при нейтрализации зарядов и образовании солей полимеров. Применяемые нейтрализующие агенты включают гидроокись натрия, гидроокись аммония, гидроокись калия, аргинин, аминометилпропанол, троламин (триэтаноламин) и трометамин (ТРИС буфер). Опытные в данной области техники сумеют выбрать нейтрализующий агент в соответствии с типом желеобразующего агента, употребленного в формуляции. Когда в качестве желеобразующего агента применяют производные целлюлозы, никакие нейтрализующие агенты не требуются.

Таблица 1 представляет состав двух высокопредпочитаемых гельных формуляций с 4-гидрокси-тамоксифеном. Все компоненты являются фармацевтически приемлемыми веществами.

Фармацевтические композиции изобретения можно назначать для лечения многочисленных клинических состояний, где применимы тамоксифен и 4-гидрокси-тамоксифен. Например, их можно назначать для лечения рака груди (Mauvais-Jarvis et al., 1986, пример 4) масталгии (Fentiman 1986, 1988, 1989), чрезмерного рубцевания (Нu, 1998; Нu, 2002) или гинекомастии (Gruntmanis and Braunstein, 2001)). Их также можно назначать для предотвращения рака груди у пациентов с высоким риском развития этого заболевания или для уменьшения плотности ткани груди, когда такое состояние мешает маммографии (Atkinson, 1999; Brisson, 2000; Son, 1999). См. также предварительные патентные заявки US №№60/433959, зарегистрированная 18 декабря 2002 г.; 60/433958, зарегистрированная 18 декабря 2002 и 60/458963, зарегистрированная 1 апреля 2003 г., каждая из которых включена сюда посредством ссылки для полного описания этих приложений.

Хотя изобретение не ограничено никакой теорией в особенности, клинически значимые побочные действия антиэстрогеновых агентов имеют место, когда они замещают эстрадиол в тканях, не являющихся мишенями. Поскольку 4-гидрокси-тамоксифен и эстрадиол обладают сходным сродством связывания с рецепторами эстрогенов, они конкурируют за связывание с рецептором приблизительно поровну, когда концентрация одного соединения приближается к концентрации другого. Если концентрация 4-гидрокси-тамоксифена превосходит концентрацию эстрадиола, этот первый будет предпочтительно связан рецепторами эстрогенов и наоборот. Посредством местного назначения 4-гидрокси-тамоксифена можно достигать высоких концентраций в тканях мишенях без одновременного повышения уровней 4-гидрокси-тамоксифена в плазме до того уровня, когда происходит значительная системная конкуренция за рецепторы эстрадиола.

Для женщин предпочтительны дозы 4-гидрокси-тамоксифена, которые приводят к концентрациям в плазме менее приблизительно 80 пг/мл, или средней концентрации эстрадиола у нормальных женщин до менопаузы. Более предпочтительны дозы 4-гидрокси-тамоксифена, приводящие к концентрациям в плазме менее приблизительно 50 пг/мл. Для мужчин предпочтительны дозы 4-гидрокси-тамоксифена, которые приводят к концентрациям в плазме менее приблизительно 20 пг/мл, или средней концентрации эстрадиола у нормальных мужчин. Ежедневные дозы, которые следует назначать, можно вначале оценить на основе коэффициентов поглощения 4-гидрокси-тамоксифена, желаемой концентрации в ткани груди и концентрации в плазме, которую не следует превышать. Конечно, начальную дозу можно оптимизировать для каждого пациента в зависимости от индивидуальных ответов.

При назначении чрескожной формуляции против грудных состояний (рака груди) дозы 4-гидрокси-тамоксифена порядка 0,25-2,0 мг/грудь/день должны давать ожидаемый результат, причем дозы около 0,5-1,0 мг/грудь/день предпочтительны. В отдельных осуществлениях, дозировка 4-гидрокси-тамоксифена составляет около 0,5, 0,75 или 1.0 мг/грудь/день.

Для лечения чрезмерного рубцевания дозы порядка от 0,25 до 6 мкг 4-гидрокси-тамоксифена/см²/день должны давать желаемый результат, причем предпочтительны дозы от приблизительно 0,25 до 3 мкг и более предпочтительны дозы от 0,5 до 2,5 мкг/см²/день. Дозы приблизительно 1,0 и 2,0 мкг/см²/день высоко предпочтительны для лечения состояний чрезмерного рубцевания.

Фармацевтические композиции изобретения можно упаковывать в наборы для хранения. Такие наборы включают (а) фармацевтическую композицию, как описано здесь, и (б) контейнер, причем фармацевтическая композиция содержится внутри контейнера. Контейнер может быть упаковкой на одну дозу, такой как пленочная упаковка (пакет) или контейнер на несколько доз, такой как контейнер с дозирующим насосом. Предпочтительно, контейнер является светонепроницаемым.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен. В частности, представлен способ для производства фармацевтической композиции изобретения, описанной выше.

В одном осуществлении настоящее изобретение направлено на способ получения фармацевтической композиции, включающий этап приведения композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен, в состояние равновесия, где приблизительно 45%-55%, приблизительно 46%-54%, приблизительно 47%-53%, приблизительно 48%-52%, приблизительно 49%-51% или приблизительно 50% упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z и оставшееся количество упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Е.

В другом осуществлении настоящее изобретение представляет способ, включающий этапы:

(1) предоставление определенного количества 4-гидрокси-тамоксифена;

(2) предоставление не менее одного наполнителя;

(3) объединение упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена и не менее одного упомянутого наполнителя, с образованием таким образом композиции;

(4) приведение упомянутой композиции в равновесное состояние, где приблизительно 45%-55%, приблизительно 46%-54%, приблизительно 47%-53%, приблизительно 48%-52%, приблизительно 49%-51% или приблизительно 50% упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z и оставшееся количество упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Е.

В одном осуществлении упомянутый этап (1) включает предоставление определенного количества 4-гидрокси-тамоксифена в форме изомера Z и/или предоставление определенного количества 4-гидрокси-тамоксифена в форме изомера Е. 4-гидрокси-тамоксифен можно предоставлять, применяя разные относительные количества изомеров Е и Z. Например, можно предоставлять 4-гидрокси-тамоксифен в виде только одного изомера (например, только Е или только Z). Также возможно предоставлять оба изомера в равных или разных количествах.

Наполнители известны в данной области техники. В одном осуществлении изобретения упомянутый наполнитель выбирают из группы, включающей воду, фармацевтически приемлемые водные буферы, усилители проницаемости, желеобразующие агенты, масла, нейтрализующие агенты и смеси вышеперечисленных. Различные осуществления, описанные выше для композиции изобретения (ингредиенты, их количества), можно переносить на способы изобретения. Опытный в данной области знал бы, как действовать для предоставления желаемых ингредиентов в желаемых количествах.

По изобретению упомянутый способ включает приведения упомянутой фармацевтической композиции, включающей 4-гидрокси-тамоксифен, в состояние равновесия. Упомянутое состояние равновесия является обычно состоянием, где соотношение изомеров E/Z незначительно меняется со временем, потому что упомянутая фармацевтическая композиция достигла равновесия. В упомянутом состоянии равновесия приблизительно 45%-55%, приблизительно 46%-54%, приблизительно 47%-53%, приблизительно 48%-52%, приблизительно 49%-51% или приблизительно 50% упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z и оставшееся количество упомянутого 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Е.

Кинетики, по которым достигается равновесие, зависят от различных параметров, таких как исходное соотношение E/Z (т.е. соответствующие количества изомеров Е и Z, предоставленные изначально), конечный рН композиции, природа и соответствующие количества ингредиентов композиции, диэлектрическая постоянная композиции, температура производства, температура хранения и возможная экспозиция на свету (продолжительность, длина волны (волн), …)

Опытный человек будет знать, как следить за ходом изомеризации и как подобрать параметры для того, чтобы обеспечить действительное достижение состояния равновесия.

Примеры параметров включают:

- температуры в интервале 25-40°С, например 30-35°С, при изготовлении и/или

- температуры в интервале 25-40°С, например 30-35°С, при хранении и/или

- хранение 0,5-6 месяцев, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев, и/или

- экспозиция на свету, особенно УФ-свету, во время производства и/или

- экспозиция на свету, особенно УФ-свету, во время хранения и/или

- конечный рН композиции и/или

- диэлектрическая постоянная композиции и/или

- соотношение вода/спирт, например соотношение вода/этанол, в композиции и/или

- исходное соотношение E/Z величиной 2/98, 60/40, 63/37, 70/30, 10/90, 0/100…

Способ изобретения может также включать этап паковки упомянутой фармацевтической композиции в контейнер, например, упаковка на одну дозу или контейнер на много доз с дозирующим насосом.

Ссылка на последующие иллюстративные примеры поможет предоставить более полное понимание изобретения.

Пример 1

Этот пример показывает, что изомеризация 4-гидрокси-тамоксифена происходит в растворе и что изомеризация в конечном счете достигает равновесия, при котором около 50% 4-гидрокси-тамоксифена находится в форме изомера Z, а оставшееся количество в форме изомера Е.

А. Получение растворов, содержащих 4-гидрокси-тамоксифен

Водно-спиртовые растворы, содержащие 4-гидрокси-тамоксифен, получают, основываясь на следующей формуле:

В водно-спиртовых растворах фосфатный буфер замещает клуцел. Состав буфера следующий:

Готовят растворы, содержащие пять разных концентраций (0,02%, 0,04%, 0,06%, 0,08% и 0,10%) 4-гидрокси-тамоксифена. Состав каждого раствора приведен в таблице ниже.

Для каждой из указанных концентраций готовят отдельные растворы, содержащие Z-4-гидрокси-тамоксифен, или смесь Z- и Е-4-гидрокси-тамоксифена. Проверен 4-гидрокси-тамоксифен от трех разных поставщиков:

Поскольку в наличии было только небольшое количество Z-4-гидрокси-тамоксифена из SIGMA, приготовлен только 0,06% раствор из этой упаковки (партии). Раствор проверяли, как описано ниже, только при 25°С и 40°С.

Б. Условия исследования

Каждый раствор разделяют на три части в бутылях из коричневого стекла на 30 мл, затем помещают в духовые шкафы, отрегулированные на 25°С, 30°С и 40°С.

Относительные количества Z и Е изомеров 4-гидрокси-тамоксифена определяют в начале исследования и в пунктах времени, соответствующих 2 неделям, 1 месяцу, 2 месяцам, 3 месяцам, 4 месяцам и 5 месяцам.

В. Аналитические методы

для определения относительных количеств каждого из изомеров 4-гидрокси-тамоксифена применяют HPLC с применением стандартного раствора 4-гидрокси-тамоксифена в качестве раствора для сравнения. Рабочие установки для HPLC следующие:

Перед HPLC водно-спиртовые растворы разводили подвижной фазой для получения концентрации 4-гидрокси-тамоксифена около 2,3 мкг/мл.

Порядок элюции следующий:

4-ОНТ Е: время удержания 13,3 мин

4-ОНТ Z: время удержания 15,0 мин

Процентное содержание каждого изомера рассчитывали по следующим формулам:

Г. Обработка данных

Обратимая реакция изомеризации и достигаемое равновесие связаны следующими уравнениями:

где

A₀ = исходная концентрация реагента

A_eq = концентрация того же реагента в равновесии

А = концентрация А в момент времени t

k_f = константа скорости прямой реакции

k_r = константа скорости обратной реакции

t = время, измеряемое в месяцах.

График как функции времени укладывается на прямую линию с наклоном и пересечением оси ординат в 0.

Д. Результаты

Таблицы ниже показывают результаты исследования; к моменту времени, равному 6 месяцам, многие растворы пришли к равновесию с соотношением изомеров Z и Е приблизительно 1:1. Константа скорости взаимопревращения изомеров прямо зависит как от температуры, так и от исходной концентрации чистого изомера Z и исходной концентрации смеси изомеров E/Z.

Содержание индивидуальных изомеров Z и Е 4-гидрокси-тамоксифена в интервале общих концентраций от 0,02% до 0,1% как функция времени представлено на фиг.3, 4 и 5. Раствор 4-гидрокси-тамоксифена хранят при 25°С (фиг.3), 30°С (фиг.4) и 40°С (фиг.5). Лекарственное вещество 4-гидрокси-тамоксифен, применяемое для приготовления раствора, обладает исходным соотношением концентраций изомеров Е и Z 63% и 37% соответственно (PANCHIM партия 98RD10079).

С изменением номинальной концентрации 4-гидрокси-тамоксифена от 0,02% до 0,10% величина константы скорости для обратимой изомеризации линейно растет. Величины констант скорости возрастают также с температурой.

Одинаковое равновесное соотношение величиной около 1:1 наблюдается при применении лекарственного вещества 4-гидрокси-тамоксифен с исходным соотношением Е/Z 2/98 (PANCHIM партия 7421) и 0/100 (партия ICI Вx17) (см. фиг.6 для примера). Упаковки PANCHIM 7421 (соотношение E/Z 2/98) и ICI Вx17 (соотношение Е/Z 0/100) представляют константы скорости, очень близкие по величине для каждой номинальной концентрации 4-гидрокси-тамоксифена и при каждой исследованной температуре. Удивительным образом, чем ближе исходное соотношение E/Z к 1:1, тем выше константа скорости для достижения равновесия (см. таблицу 1).

Пример 2

Этот пример демонстрирует действие изопропил миристата, природы присутствующего спирта и соотношения спирт/фосфатный буфер на изомеризацию 4-гидрокси-тамоксифена. По-видимому, выбор неводного растворителя (буфера или воды) не оказывает значительного влияния на процесс изомеризации. Количество неводного растворителя непрямо пропорционально скорости изомеризации, но на конечное равновесное соотношение Z/E количество неводного растворителя не влияет.

Растворы, содержащие 0,06% 4-гидрокси-тамоксифен, готовят, как показано в таблице ниже:

Растворы II, III и IV, описанные выше, готовят из упаковки 4-гидрокси-тамоксифена PANCHIM партия 98RD10079. Исходное соотношение E/Z составляет 63%/37%.

Раствор для сравнения: гельная формуляция без желеобразующего агента клуцел.

Раствор II: раствор для сравнения без изопропилмиристата и содержащий этанол.

Раствор III: раствор II, где этанол замещен изопропиловым спиртом.

Раствор IV: раствор II, где соотношение этанол/буфер составляет 50/50 вместо 66,5/33,5.

Как и в примере 1, за изомеризацией в каждом растворе следят с течением времени. Чертежи ниже показывают результаты.

Замена этанола изопропиловым спиртом и удаление изопропил миристата не оказывают существенного влияния на обратимые кинетики 4-гидрокси-тамоксифена.

Увеличение концентрации водного растворителя (буфера) от 33,5% до 50% приводит к значительному возрастанию константы скорости при 25°С и 30°С. Разница менее выражена при 40°С. Увеличение концентрации буфера приводит к увеличению диэлектрической постоянной смеси и таким образом облегчает поляризацию гидроксильной группы и, следовательно, конъюгацию двойной связи алкеновой группы 4-гидрокси-тамоксифена. Такое же явление наблюдается при замене буфера водой. Важно отметить также роль рН буферного раствора для кинетик обратимой изомеризации 4-гидрокси-тамоксифена.

Пример 3

Этот пример демонстрирует эффекты экстремальной температуры на изомеризацию 4-гидрокси-тамоксифена. Очень высокие температуры ускоряют процесс уравновешивания, в то время как очень низкие температуры его замедляют. Этот пример показывает также, что количество водного растворителя, содержащегося в смеси, влияет на скорость изомеризации, как отмечено в примере 2.

Готовят два раствора, содержащие 0,06% Z-4-гидрокси-тамоксифен, раствор V и раствор VI. Раствор V содержит 4-гидрокси-тамоксифен в чистом этаноле. Раствор VI содержит 4-гидрокси-тамоксифен в смеси 66,3% воды и 33,7% этанола. За степенью изомеризации, произошедшей в каждом растворе, наблюдают через одну неделю при -20°С, 25°С и 60°С. Результаты приведены в таблице ниже. Через неделю не наблюдается никакой изомеризации при -20°С и 25°С, в то время как начало изомеризации наблюдается при 60°С. В свете результатов, опубликованных Malet et al., удивительно, что изомеризация не обнаруживается в растворах V и VI после недели хранения при -20°С и 25°С.

Пример 4

Этот пример показывает действие света на изомеризацию 4-гидрокси-тамоксифена. За степенью изомеризации, которая происходит в каждом растворе, содержащем 0,06% 4-гидрокси-тамоксифен с исходным соотношением E/Z 98/2 (в смеси из 66% воды и 34% этанола), наблюдают в течение двух часов при комнатной температуре и при двух длинах волн в УФ: 380 нм и 254 нм. Результаты приведены в таблице 3 ниже.

УФ-свет ускоряет достижение равновесия; действительно, через 5 мин можно наблюдать процесс изомеризации при комнатной температуре. При 254 нм изомеризация происходит быстрее, чем при 380 нм. К тому же при 254 нм явление изомеризации сочетается с разрушением (деградацией) двух изомеров до примесей, называемых прим. 1 и прим. 2, которые являются производными фенантрена. Таким образом, равновесное соотношение изомеров E/Z, достигаемое под УФ-светом, отличается от 1:1.

Пример 5

Этот пример показывает влияние рН на изомеризацию 4-гидрокси-тамоксифена. Количество изомеризации, которое происходит в растворах, содержащих 0,06% 4-гидрокси-тамоксифена с исходными соотношениями E/Z 100/0 и 37/63, наблюдают в течение 2 месяцев при 40°С. 4-Гидрокси-тамоксифен растворен в смеси 66,5% абсолютного этанола, 32,4% либо фосфатного (рН от 2 до 8), либо карбонатного (рН 10) буфера и 1% изопропил миристата. Результаты приведены в таблице 4 ниже.

Низкие и высокие значения рН ускоряют процесс уравновешивания. Чем ближе рН к нейтральному (7,0), тем медленнее достигается равновесие. Однако рН, по всей видимости, не оказывает значительного влияния на равновесное соотношение изомеров E/Z около 1:1.

Пример 6. Способы получения фармацевтических композиций с 4-гидрокси-тамоксифеном, достигших равновесного соотношения изомеров около 1:1

Следующие примеры иллюстрируют способы изобретения. Эти способы преимущественно приводят к устойчивым композициям 4-гидрокси-тамоксифена, обладающим соотношением изомеров E:Z около 1:1

Способ А:

(1) 0,06 г 4-гидрокси-тамоксифена, содержащего оба изомера Е и Z на уровне 60/40, соответственно, смешивают с 66,5 г абсолютного этанола и перемешивают до полного растворения при комнатной температуре;

(2) затем добавляют 1,0 г изопропил миристата и перемешивают;

(3) добавляют 32,4 г водного фосфатного буфера и смешивают с раствором (конечное значение рН около 9);

(4) под конец, раствор переносят в бутыль из светонепроницаемого стекла и затем хранят при 25°С/60% относительной влажности в течение 6 месяцев.

Способ Б:

(1) 0,08 г 4-гидрокси-тамоксифена, содержащего оба изомера Е и Z на уровне 60/40, соответственно, смешивают с 53,2 г абсолютного этанола и перемешивают до полного растворения при комнатной температуре;

(2) затем добавляют 0,8 г изопропил миристата и перемешивают;

(3) к раствору добавляют 25,9 г водного фосфатного буфера (для достижения конечного значения рН 9);

(4) под конец, раствор переносят в бутыль из светонепроницаемого стекла и затем хранят при 40°С/75% относительной влажности в течение 2 месяцев.

Способ В:

(1) 0,08 г 4-гидрокси-тамоксифена, содержащего оба изомера Е и Z на уровне 0/100, соответственно, смешивают с 53,2 г абсолютного этанола и перемешивают до полного растворения при комнатной температуре;

(2) затем добавляют 0,8 г изопропил миристата и перемешивают;

(3) к раствору добавляют 25,9 г водного фосфатного буфера (для достижения конечного значения рН 9);

(4) под конец, раствор заключают в бутыль из светонепроницаемого стекла и затем хранят при 40°С/75% относительной влажности в течение 6 месяцев.

Способ Г:

(1) 0,06 г 4-гидрокси-тамоксифена, содержащего оба изомера Е и Z на уровне 60/40, соответственно, смешивают с 66,5 г абсолютного этанола и перемешивают до полного растворения при комнатной температуре;

(2) добавляют 32,4 г водного карбонатного буфера и смешивают с раствором (конечное значение рН около 12);

(3) под конец, раствор переносят в бутыль из светонепроницаемого стекла и затем хранят при 40°С в течение 15 дней.

Ссылки (процитированные публикации)

Каждая из следующих публикаций включена сюда полностью посредством ссылки.

Atkinson, С., R.Warren, S.A.Bingham, and N.E. Day, Mammographic patterns as a predictive biomarker of breast cancer risk: effect of tamoxifen, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 8: 863-66 (1999).

Brisson, J., В.Brisson, G.Cote, E.Maunsell, S.Berube, and J.Robert, Tamoxifen and mammographic breast densities. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 9: 911-15 (2000).

Bronaugh and Maibach, Percutaneous Absorption: Drugs Cosmetics Mechanisms Methodology, Marcel Dekker 1999.

Charlier, C., A.Chariot, N.Antoine, M.P.Merville, J.Gielen, V.Castronovo, Tamoxifen and its active metabolite inhibit growth of estrogen receptor-negative MDA-MB-435 cells, 49(3): 351-8 (1995).

Fentiman, I.S., Tamoxifen and mastalgia. An emerging indication, Drugs 32: 477-80 (1986).

Fentiman, I.S., M.Caleffi, H.Hamed, and M.A.Chaudary, Dosage and duration of tamoxifen treatment for mastalgia: a controlled trial, British Journal of Surgery 75: 845-46 (1988).

Fentiman, I.S., M.Caleffi, H.Hamed, and M.A.Chaudary, Studies of tamoxifen in women with mastalgia, British Journal of Clinical Practice, Supplement 68, 43(11): 34-36 (1989)).

Gruntmanis, U. and G.D.Braunstein, Treatment of gynecomastia, Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:643-649 (2001).

Hu, D., M.A.Hughes, G.W.Cherry, Topical tamoxifen - a potential therapeutic regimen in treating excessive dermal scarring? Br. J. Plast. Surg., 50(6): 462-9 (1998).

Нu, D., X.Zhu, M.Xu, B.Chen, A.H.Margaret, W.C.George, The inhibitory effect of tamoxifen on human dermal fibroblast-populated collagen lattices, Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi, (18(3): 160-2 (2002).

Katzenellenbogen, J.A., K.E.Carlson, B.S.Katzenellenbogen, Facile geometric isomerization of phenolic non-steroidal estrogens and antiestrogens: limitations to the interpretation of experiments characterizing the activity of individual isomers, J. Steroid Biochem, 22(5): 589-96 (1985).

Kuiper, G.G.J.M., В.Carlsson, К.Grandien, E.Enmark, J.Heggblad, S.Nilsson, J.Gustafsson, Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors α and β. Endocrinology, 138: 863-870 (1997).

Malet С., A.Compel, P.Spritzer, N Bricourt, NH Yaneva, I.Mowszowicz, F.Kutten and P Mauvais Jarvis, Tamoxifen and hydroxytamoxifen isomers versus estradiol effects on normal human breast cells in culture. Cancer Research, 48: 7193-7199 (1988).

Malet, С., P.Spritzer, С.Cumins, D.Guillaumin, P.Mauvais-Jarvis, F.Kuttenn, Effect of 4-hydroxytamoxifen isomers on growth and ultrastructural aspects of normal human breast epithelial (HBE) cells in culture, J. Steroid Biochem. & Mol. Bio., 82: 289-96 (2002).

Mauvais-Jarvis, P., N.Baudot, D.Castaigne, P.Banzet, and F.Kuttenn, Trans-4-hydroxytamoxifen concentration and metabolism after local percutaneous administration to human breast. Cancer Research, 46: 1521-1525 (1986).

Nomura, Y., H.Tashiro, F.Takaeko, Effects of antiestrogens and medroxyprogesterone acetate on the clonogenic growth of tamoxifen-sensitive and resistant human breast cancer cells, Jpn. J. Cancer Chemotherapy, 12(4): 844-50 (1985).

Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, pp.836-858.

Robertson and Katzenellenbogen, J. Org. Chem., 47: 2387 (1982).

Robertson, D.W., J.A.Katzenellenbogen, D.J. Long, E.A. Rorke and B.S.Katzenellenbogen, Tamoxifen antiestrogens. A comparison of the activity, pharmacokinetics, and metabolic activation of the cis and trans isomers of tamoxifen, J. Steroid Biochemistry, 16(1): 1-13 (1982).

Son, H.J., and K.K.Oh, Significance of follow-up mammography in estimating the effect of tamoxifen in breast cancer patients who have undergone surgery, American Journal of Roentgenology, 173: 905-909 (1999).

Патент US №5904930.

Патент US №6172263.

Патентная заявка US №60/433958.

Патентная заявка US №60/433959.

Патентная заявка US 60/458963.