ТЕТРАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как геропротекторное средство, для профилактики преждевременного старения организма.

Известно, что одними из ведущих механизмов старения организма являются: нарастание молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, и нарушение функции системы антиоксидантной защиты организма, а также нарушение физиологических функций эпифиза (1, 2, 3).

Поскольку предлагаемый тетрапептид, отвечающий изобретению, проявляет биологическую активность, а именно - геропротекторную активность, то к аналогам по применению следует отнести группу соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Добавление в пищу известного ингибитора радикальных процессов ионола (2,6-ди- трет-бутил-4-метилфенола) способствовало увеличению времени жизни мышей с ускоренным старением линии LAF₁ (4). Однако, лекарственный препарат на основе 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола (дибунол) выпускается в виде линимента и применяется у людей, в основном, при онкологических заболеваниях в урологической практике (5). Введение в пищу антиоксиданта этоксихина (сантохин) увеличивало продолжительность жизни мышей линии C3H (6). Увеличение продолжительности жизни лабораторных животных вызывает также малотоксичный водорастворимый антиоксидант - хлоргидрат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина, структурного аналога витамина B₆ (7, 8). Незначительное увеличение продолжительности жизни в эксперименте давали 2-меркаптоэтаноламин, бутилгидрокситолуол, цистеин, 3-гидроксипиридин, центрофеноксин, молочная и глюконовая кислоты, глутатион (9, 10). Однако эти химические соединения не являются лекарственными препаратами и не нашли применения в медицине в качестве геропротекторных средств. Увеличивали продолжительность жизни в эксперименте витамины A, C, E (11, 12, 13). Однако перенасыщение организма этими витаминами может неблагоприятно влиять на функциональное состояние органов и систем, обуславливает быстрое развитие гипервитаминоза. Известен препарат β-катехин, в состав которого входят витамины и растительные вещества, обладающий антиоксидантным действием (14). Применение этого препарата мышам с ускоренным старением линии SAM-P8 увеличивало выживаемость животных. Однако механизмы геропротекторной активности этого комбинированного препарата недостаточно изучены, что ограничивает его внедрение в клиническую практику. После 7-месячного содержания мышей линии SAM, склонных к ускоренному старению, на диете с увеличенным содержанием карнозина (β-Ala-His) уменьшалась смертность животных (15). Однако карнозин не является лекарственным препаратом, его геропротекторные свойства изучены недостаточно. Незначительное увеличение средней продолжительности жизни мышей вызывало применение гормона эпифиза - мелатонина (16). Эффекты мелатонина связывают с его антиоксидантными свойствами (17). Однако применение мелатонина у Drosophila melanogaster линии ВЭС, селектированный на высокий уровень эмбриональной смертности, не оказывало геропротекторного эффекта, хотя и сопровождалось антиоксидантным эффектом. Мелатонин не является лекарственным препаратом, а выпускается в качестве биологически активной добавки к пище.

В качестве геропротекторного средства используется лекарственный препарат, содержащий новокаин, - геровитал (18). Недостатком этого препарата являются возможное отрицательное действие на функции сердечно-сосудистой системы, аллергизирующее действие, иногда - ухудшение сна, появление чувства беспокойства, боли в мышцах и суставах.

Заявляемое изобретение направлено на получения нового биологически активного соединения пептидной природы, обладающего геропротекторной активностью.

Заявляемое пептидное соединение - тетрапептид - структурных аналогов не имеет.

Согласно изобретению заявляется тетрапептид L-аланил-L- глутамил-L-аспарагил-глицин общей формулы: L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Тетрапептид L-аланил-L-глутамил-L-аспарагил-глицин со следующей аминокислотной последовательностью: L-Ala-L-Glu-L-Asp- Gly, отвечающий изобретению, проявляет биологическую активность, а именно - геропротекторную активность, за счет стимуляции показателей системы антиоксидантной защиты и процесса синтеза мелатонина в структурах диффузной нейроэндокринной системы.

Тетрапептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (19).

Геропротекторная активность тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly выявлена при его экспериментальном изучении. Изучение геропротекторной активности проводили на Drosophila melanogaster, исследуя показатели антиоксидантной защиты, продолжительности жизни и продолжительности репродуктивного периода, и на крысах, исследуя синтез экстрапинеального мелатонина.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее геропротекторной активностью, содержит в качестве активного начала эффективное количество тетрапептида формулы L-аланил-L-глутамил-L- аспарагил-глицин (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) или его солей.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее геропротекторной активностью, может содержать соли по аминогруппе (ацетат, гидрохлорид, оксалат), или по карбоксильным группам (соли металлов - натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также других органических и неорганических катионов - аммония, триэтиламмония).

Согласно изобретению, фармакологическое средство предназначено для парентерального; интраназального, перорального или местного применения.

Заявляемое фармакологическое средство, обладающее геропротекторной активностью, способно стимулировать показатели системы антиоксидантной защиты и процессы синтеза мелатонина в структурах диффузной нейроэндокринной системы, что в свою очередь замедляет процессы старения и способствует продлению жизни.

Понятие "геропротекторное средство", используемое в данной заявке, подразумевает средство, замедляющее старение и продлевающее жизнь путем профилактики преждевременного старения, при котором необходима стимуляция системы антиоксидантной защиты и регулирующее воздействие на процессы метаболизма в структурах диффузной нейроэндокринной системы.

Понятие "фармакологическое средство", используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей тетрапептид или его соли, которые могут найти профилактическое и/или лечебное применение в медицине в качестве геропротекторного средства при преждевременном старении.

Понятие "эффективное количество", используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Понятие "фармацевтическая композиция", используемое в данной заявке, подразумевает различные лекарственные формы препарата.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый тетрапептид или его фармацевтически приемлемые производные смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например, парентерального, интраназального или перорального.

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального применения могут использоваться любые известные фармацевтические компоненты.

Для парентерального (интраназального) введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Согласно изобретению способ включает профилактическое или лечебное введение пациенту заявляемого фармакологического средства в дозах 0,01 - 100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта - 10-40 дней в зависимости от характера течения патологического процесса.

Согласно изобретению тетрапептид активен при введении его в дозах 0,01-100 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от характера течения патологического процесса.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза тетрапептида формулы L-аланил-L-глутамил-L-аспарагил-глицин (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) (пример 1), примерами испытания токсичности и биологической активности тетрапептида (примеры 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), а также примерами результатов клинического применения тетрапептида, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (примеры 9, 10).

Пример 1. Синтез тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
1. Название соединения: L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-глицин.

2. Структурная формула:
H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₄H₂₂N₄O₉.

4. Молекулярный вес без противоиона: 390,35.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме, представленной в конце описания.

В качестве растворителя использовали N,N'-диметилформамид, при введении аспарагиновой кислоты использовали защиту α-COOH группы солеобразованием с триэтиламином. Деблокирование ВОС-защитной группы проводили раствором трифторуксусной кислоты (TFA), Z-защитной группы каталитическим гидрогенолизом. Выделение и очистка препарата осуществлялись методом препаративной ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой.

Характеристики готового препарата:
аминокислотный анализ Glu 1,02 Asp 1,00 Ala 1,01 Gly 1,00;
содержание основного вещества 98,4% (по ВЭЖХ, 220 нм);
ТСХ - индивидуален, R_f= 0,73 (ацетонитрил-уксусная к-та-вода 5:1:3);
содержание влаги: 5%;
pH 0,001% раствора: 4,37;
удельное оптическое вращение: [α]

Пример синтеза:
1) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат.

N-оксисукцинимидный эфир N-тpeт.бутилoкcикapбoнил- (γ- бeнзил)глутaминoвoй кислоты BOC-Glu(OBzl)-OSu 4,34 г (0,0100 моль) растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 1,72 мл (0,0125 моль) и β-бензиласпартат 2,80 г (0,0125 моль). Перемешивают при комнатной температуре 24 час. Продукт высаживают 0,5н раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток сушат в вакууме над P₂O₅. Получают масло 5,68 г (≈100%). R_f= 0,42 (бензол-ацетон 2: 1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление УФ и хлор/бензидин).

2)TFAH-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH(II),трифторацетат(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартата.

N-трет. бутилоксикарбонил -(γ-бензил) глутамил-(β-бензил)аспартат (I) 5,68 г (≈0,01 моль) растворяют в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3: 1). Через 2 часа растворитель упаривают в вакууме при 40^oC, упаривание повторяют с новой порцией дихлорметана (2х10 мл), остаток сушат в вакууме над NaOH. Получают масло 5,80 г (≈100%). R_f= 0,63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

3) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-карбобензоксиаланил -(γ-бензил) глутамил-(β-бензил)аспартат.

Трифторацетат (γ-бензил) глутамил-(β-бензил)аспартата (II) 5,65 г (0,01 моль) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 2,80 мл (0,02 моль) и N-оксисукцинимидный эфир N- карбобензоксиаланина 4,14 г (0,013 моль). Смесь перемешивают 24 часа при комнатной температуре. Продукт высаживают 0,5н раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5н раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над P₂O₅. Выход 4, 10 г (66%). Т_пл.= 154^oC. R_f= 0,48 (бензол-ацетон, 1:1), R_f= 0,72 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

4) Z-Ala-Ghi(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III), бензиловый эфир N-карбобензоксиаланил-(γ-бензил) глутамил-(β- бензил))аспартилглицина.

TosOH H-Gly-OBzl, тозилат бензилового эфира глицина 1,01 г (3 ммоль) суспендируют в 15 мл тетрагидрофурана и при перемешивании добавляют триэтиламин ммоль), далее через 5 мин. N-карбобензоксиаланил-(γ-бензил) глутамил-(β- бензил)аспартат (III) 1,28 г (2 ммоль), N-оксибензотриазол 0,27 г (2 ммоль) и охлаждают смесь до 0^oC. Затем добавляют охлажденный до 0^oC раствор N,N'- дициклогексилкарбодиимида 0,42 г (2 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана, перемешивают смесь при этой температуре 2 часа и оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в 30 мл этилацетата и промывают раствор 1н раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, 1н раствором соляной кислоты, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и продукт закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Выход 1,30 г (82%). Т_пл. = 146-148^oC. R_f= 0,75 (бензол-ацетон, 2:1).

5) H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH (IV), аланил-глутамил-аспартил-глицин.

Бензиловый эфир N-карбобензоксиаланил -(γ-бензил) глутамил-(β-бензил)аспартилглицина (III) 1,25 г гидрировали в системе метанол-вода-уксусная кислота (3: 1: 1) над катализатором Pd/C. Контроль за полнотой деблокирования в ТСХ системах бензол-ацетон (2:1) и ацетонитрил-уксусная кислота-вода (5:1:3). По окончании реакции катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме и остаток закристаллизовывают в системе вода/метанол. Продукт сушат в вакууме над KOH. Выход 520 мг (95%). R_f= 0,73 (ацетонитрил-уксусная кислота-вода, 5:1:3). Для очистки 390 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250 мм Diasorb-130-C16T, 7 mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования A: 0,1% TFA; В: 50% MeCN/0,1% TFA, градиент В 0 ---> 5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 54,0-66,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40^oC, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 290 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха. Полученный пептид в виде ацетата переводят в свободную форму обработкой анионитом IRA или аналогичным в (OH^-)-форме. Далее получают соли по аминогруппе, прибавляя эквивалент соответствующей кислоты (соляной или щавелевой). Полученный водный раствор лиофилизуют и анализируют как готовый продукт.

Для получения соответствующих солей по карбоксильным группам к свободному тетрапептиду добавляют рассчитанное количество водного раствора гидроокиси соответствующего металла (NaOH, КОН, ZnOH₂, LiOH, CaOH₂, MgOH₂, NH₄OH). Для получения триэтиламмониевой соли обработку проводят аналогичным образом, используя в качестве основания триэтиламин.

6) Анализ готового препарата.

Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Supeico LC-18-DB 4,6х250 mm, gard. LC-18-DB. A: 0,1% TFA; В: 50% MeCN/0,1%TFA; grad. В 0 ---> 20% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества 98,45%.

Аминокислотный анализ проводили на анализаторе ААА"Т-339" Prague. Гидролиз в 6н HCl при 125^oC 24 час.

Ghr 1,02; Asp 1,00; Ala 1,01; Gly 1,00.

TCX: индивидуален, R_f= 0,73 (ацетонитрил-уксусная кислота-вода, 5:1:3 пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Cодержание влаги: 5% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100^oC).

pH 0,001% раствора: 4,37 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: [α]

Пример 2. Изучение токсичности тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
Изучение общетоксического действия тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly проводилось в соответствии с "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)".

Цель изучения состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения препарата.

Определение острой токсичности тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly проводили по методу Кербера. Исследование проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах массой 20-23 г, содержавшихся на стандартном режиме и получавших стандартное питание в условиях вивария. Животные были разделены случайным распределением на 6 равных групп по 11 мышей в каждой. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в объеме 0,25 мл в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу, рекомендуемую для клинического изучения). Животным контрольной группы в том же объеме вводился физиологический раствор.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.

Таким образом, тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.

Исследование подострой токсичности тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly проведено на 60 белых беспородных крысах массой 150-250 мг. Ежедневно однократно животным опытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,3 мг/кг, 3 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Животным контрольной группы вводили в том же объеме физиологический раствор.

На протяжении всего периода исследования животные находились под ежедневным наблюдением. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Проводили еженедельное взвешивание животных. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Хроническую токсичность тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам массой 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно препарат в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора в течение 6 месяцев. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось ежедневно в первые 3 месяца эксперимента, затем 1 раз в месяц. Через 3 месяца после начала введения и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата часть животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Изучение подострой и хронической токсичности тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз.

Пример 3. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на скорость старения и свободнорадикальные процессы у Drosophila melanogaster линии ВЭС, отселектированной на высокую эмбриональную смертность
Воздействию тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly подвергали личинок второго возраста Drosophila melanogaster быстростареющей линии ВЭС (20). Линия ВЭС характеризуется уникальной динамикой эмбриональной смертности, заключающейся в возрастании частоты ранних эмбриональных деталей от 65% в 1-е сутки яйцекладки до 95% на 4-е, сниженной средней продолжительностью жизни (29 сут.) и повышенной интенсивностью перекисного окисления липидов.

Тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly добавляли в количестве 0,00001% от веса питательной среды, что является экстремально низкой дозой. В литературе по изучению влияния различных веществ на дрозофилу обычно применяются дозы от 0,001 до 0,01%. Меньшие дозы обычно не вызывают эффекта.

Биохимические параметры изучали у мух в возрасте 14 дней. Анализировали активность каталазы и интенсивность хемилюминесценции тканей (21, 22, 23). Каталаза является основным ферментом антиоксидантной защиты. По уровню ее активности можно судить о способности организма противостоять окислительному стрессу. Индуцированная перекисью водорода люминолзависимая хемилюминесценция отражает уровень активных форм кислорода в тканях. Таким образом, снижение интенсивности хемилюминесценции отражает повышение способности организма противостоять окислительному стрессу.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Поскольку были обнаружены значительные межполовые различия по изучаемым показателям, данные для самок и самцов приведены отдельно.

Из представленных данных следует, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly достоверно повышают активность каталазы у самок и самцов мух по сравнению с контролем.

Общая антиокислительная активность тканей, характеризуемая уровнем хемилюминесценции, повышается под действием тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly только у самок.

В таблице 2 представлены результаты анализа продолжительности жизни в различных экспериментальных группах.

Как видно из таблицы 2, тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly обладает выраженным геропротекторным эффектом. У самок он значительно увеличивает среднюю продолжительность жизни (P<0,001) и снижает скорость старения (R) (P<0,001). У самцов - несколько снижает скорость старения (P<0,05).

Таким образом, тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly увеличивает среднюю продолжительность жизни на 26% и снижает истинную скорость старения популяции, оцениваемую по величине параметра Гомперца на 40%.

Пример 4. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp--Gly на репродуктивные функции Drosophila melanogaster линии ВЭС, отселектированной на высокую эмбриональную смертность
Воздействие тетрапептидом L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly проводили на стадии личинок 2-3-го возраста, добавляя препарат в питательную среду в дозе 0,00001% от веса среды, что составляет приблизительно 0,015 мг/100 мл. Вылетевших в течение 1 суток мух рассаживали по 5 пар в пробирку и через каждые 3-6 суток перекидывали их на свежую среду.

Учитывали:
Долю пробирок (от начального их числа), в которых присутствовали живые самки (в таблице 3 - доля живых культур).

Долю пробирок (от числа живых культур), в которых появилось потомство (в таблице 3 - доля фертильных культур). В каждом экспериментальном варианте было проанализировано 75 родительских пар. Различия между показателями фертильности определяли с помощью точного критерия Фишера для таблиц сопряженности 2х2 (24).

Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Приведены доли живых и фертильных культур для каждого экспериментального варианта. Как видно из таблицы, начиная с 19-го дня доля фертильных культур после обработки тетрапептидом превышает таковую в контроле. Показано, что доля фертильных культур в варианте тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly достоверно (P<0,05) выше по сравнению с контролем в возрасте 32 дня.

Коэффициенты линейной регрессии представлены в таблице 4. Как видно из таблицы, коэффициенты контрольной линии регрессии достоверно отличаются от опытной. Коэффициент "а" (наклон прямой) в контрольном варианте в 1,8 раза выше коэффициента регрессии экспериментального варианта.

Таким образом показано, что доля фертильных культур в контрольном варианте снижается в 2 раза быстрее по сравнению с вариантом тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly. Длительность репродуктивного периода составила 30 дней для культур, не подвергавшихся обработке, и 47 дней для культур, обработанных тетрапептидом. Установлено, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly увеличивает продолжительность репродуктивного периода в 1,5 раза.

Аналогично проанализировали полученные данные по продолжительности жизни. Данные регрессионного анализа представлены в таблице 5.

Как следует из таблицы, доля живых культур (т.е. культур, в которых присутствуют живые самки) снижается в контроле в среднем в 1,5 раза быстрее, по сравнению с опытным вариантом. Расчетная медианная продолжительность жизни (т. е. время, к которому погибают 50% особей) и реально достигнутая - максимальная продолжительность жизни для разных вариантов опыта представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы, помимо увеличения медианной продолжительности жизни, в варианте, обработанном тетрапептидом L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, достигнута рекордная максимальная продолжительность жизни (для быстростареющих линий дрозофилы) - 100 дней.

Пример 5. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на скорость старения и свободнорадикальные процессы у Drosophila melanogaster линии HA, отселектированной на низкую половую активность самцов
Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на активность каталазы, содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), продолжительность жизни и скорость старения исследовали на Drosophila melanogaster линии HA.

Мух в возрасте 1-х суток рассаживали в пробирки по 10 особей одного пола. Через каждые 2 дня их перекидывали на свежую среду, учитывая число погибших особей. Определяли среднюю и максимальную продолжительность жизни. Скорость старения определяли, рассчитывая параметры уравнения Гомперца.

Тетрапептидом L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly воздействовали на личинок 3-го возраста в дозе 0,00001% отвеса питательной среды, что составляет приблизительно 0,015 мг/100 мл. В гомогенатах взрослых мух в возрасте 14-ти суток по общепринятым методикам определяли активность каталазы. Опыт был проведен в двух повторностях.

Основным методом статистической обработки был регрессионный и дисперсионный анализ. Достоверность различий определяли методом наименьшей значимой разности.

Установлено, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly у самок не изменяет СПЖ, но увеличивает МПЖ. Вместе с тем существенно увеличивает СПЖ самцов. Анализ кривых выживания и гомперцовских графиков показывает, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly у самок действует, как геропротектор первого типа (СПЖ и МПЖ увеличены, но скорость старения не меняется по сравнению с контролем). У самцов же он действует как геропротектор третьего типа (СПЖ увеличена, МПЖ не меняется и при этом наблюдается тенденция к увеличению скорости старения). В то же время анализ выживаемости мух без учета межполовых различий показывает, что МПЖ достоверно увеличивается под воздействием тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

При воздействии тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly у самцов повышается активность каталазы, а у самок достоверно снижается содержание продуктов ПОЛ. Нивелирование межполовых различий показывает высокую антиоксидантную активность тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Результаты исследования представлены в таблицах 7-9.

Пример 6. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на скорость старения и свободнорадикальные процессы у Drosophila melanogaster линии BA, отселектированной на низкую приспособленность к внешним условиям
На Drosophila melanogaster линии BSA изучали влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на активность каталазы, хемилюминесценцию тканей и продолжительность жизни.

Мух в возрасте 1-х суток рассаживали в пробирки по 10 особей одного пола. Через каждые 5-7 дней их перекидывали на свежую среду, учитывая число погибших особей. Определяли среднюю и максимальную продолжительность жизни. Скорость старения определяли рассчитывая параметры уравнения Гомперца.

Тетрапептидом L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly воздействовали на личинок 3-го возраста в дозе 0,00001% от веса питательной среды что составляет приблизительно 0,015 мг/100 мл. В гомогенатах взрослых мух в возрасте 7-ми суток по общепринятым методикам определяли активность каталазы и интенсивность хемилюминесценции. Опыт был проведен в двух повторностях.

Основным методом статистической обработки был регрессионный и дисперсионный анализ. Достоверность различий определяли методом наименьшей значимой разности.

Результаты исследования представлены в таблицах 10-13.

Установлено, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly оказывает влияние на люминолзависимую хемилюминесценцию (табл. 14). Снижение этого показателя свидетельствует в пользу активации системы антиоксидантной защиты в тканях мух. Вероятно, что повышение интенсивности антиоксидантной защиты тканей в данном случае связано с активацией низкомолекулярных эндогенных антиоксидантов, таких как глутатион, токоферол и др.

Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни наблюдали лишь в условиях пониженной жизнеспособности и ускоренного старения контрольного варианта. Как видно из представленных данных, именно в этом случае исследуемый тетрапептид обнаруживает четкий геропротекторный эффект.

Пример 7. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на продолжительность жизни Drosophila melanogaster "дикой" линии Canton-S
В работе использовали Drosophila melanogaster "дикой" линии Canton-S. Тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly в виде раствора вносили в остуженную до 50-60^oC питательную среду для развития насекомых, после чего тщательно размешивали и разливали в пробирки.

Для того, чтобы условия развития контрольной популяции были адекватны условиям развития экспериментальных популяций в питательную среду для контрольных групп вносили то же количество физ. раствора, что и при растворении тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly. Концентрация всех веществ расчитывалась по отношению к массе питательной среды для размножения.

Случайным образом выбранные 4-дневные самки скрещивались с самцами по одной паре в пробирке в течение 72 часов, после чего родительская пара удалялась из пробирки. Для формирования каждого поколения использовали потомство 50-80 родительских пар.

Продолжительность жизни (ПЖ) изучали в лабораторных популяциях, состоящих из 90 особей каждого пола. Непосредственно сразу же после вылупления мух случайным образом высаживали по 10 особей в пробирку. Замену питательной среды проводили три раза в неделю.

В качестве параметров распределения продолжительности жизни использовали рассчитываемые традиционным способом средние величины (СПЖ) и стандартные ошибки. Средние величины сравнивали между собой с использованием t-критерия Стьюдента.

В таблице 15 представлены результаты измерения характеристик распределения ПЖ (средние величины и стандартные ошибки средних) во всех экспериментальных и контрольных группах.

Для экспериментального изучения выбрали 6 следующих концентраций тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly: 0,01x, 0,1x, 1x, 5x, 7,5x и 12,5•10^-6% от веса питательной среды.

Для самцов воздействие тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly в четырех наименьших концентрациях (от 0,01x до 5•10^-6%) оказало достоверное геропротекторное действие: СПЖ статистически значимо увеличилась в подопытных группах. Относительное увеличение СПЖ самцов составило от 3,3 до 10,8%.

В опытах на самках тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly проявил геропротекторную активность только в концентрациях 0,01x и 0,1•10^-6%, достоверно увеличив СПЖ на 13,4% (p<0,004) и 11,8% (p<0,03) соответственно.

Уникальность полученных данных заключается в эффективности действия сверхмалых концентраций используемого тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly. Следует отметить, что использование тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly не изменяло длительности стадий развития дрозофил, что в интегральной форме отражает отсутствие генотоксического действия исследуемого вещества.

Пример 8. Влияние тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly на экстрапинеальный синтез мелатонина после эпифизэктомии у крыс
Работа вьшолнена на самцах - крысах Вистар массой тела 130 - 140 г. Общее количество животных (23) было разделено на пять групп. 1 группа (контроль) была представлена интактными животными. У животных 2 - 5 групп был удален эпифиз (ЭЭ - эпифизэктомия). Через три недели после операции (на 21 сутки) животным 2 и 3 групп подкожно вводился физиологический раствор по 0,5 мл в течение последующих 10 дней. Животным 4 и 5 групп по такой же схеме вводился тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly в дозе 0,5 мкг.

Забой животных и выделение органов проводили утром с 10 до 12 часов при естественном освещении под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Животные 1, 2, 4, групп забивались через 3 суток после окончательного введения препаратов (на 33 сутки после операции и начала опыта), а 3, 5 группы - через 12 суток (на 42 сутки после эпифизэктомии). Изучению подвергались основные органы диффузной нейроэндокринной системы (ДНЭС) (желудок, щитовидная железа и поджелудочная железа).

Операция - эпифизэктомия проводилась под эфирным наркозом по разработанной методике. По средней линии головы производился разрез кожи длиной 1-1,5 см. После обнажения крыши черепа над местом слияния синусов высверливалось отверстие с помощью специально изготовленного из металлической трубки полого бура диаметром 0,5 см. Через отверстие в черепе эпифиз извлекался с помощью глазного пинцета, а трепанационное отверстие закрывалось костным фрагментом. Кожный разрез ушивали шелковыми нитями.

Кусочки органов фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для свето-микроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Обезвоживание материала и заливка в парафин для световой микроскопии и смесь эпонов для ультраструктурного исследования проводили по общепринятым методикам. Парафиновые срезы (7 мкм) помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Ультратонкие срезы (100 нм), приготовленные на ультрамикротоме LKB-7A (LKB) контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.

Гистологическое и иммуногистохимическое изучение проводили на микроскопе Jenamed-2 (Zeizz). Электронно-микроскопическое исследование осуществляли в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL).

Применяли окраску гематоксилином-эозином. Общую популяцию апудоцитов в пилорическом и фундальном отделах желудка выявляли гистохимическим методом серебрения по Гримелиусу (25).

Иммуногистохимическое выявление EC-клеток осуществляли с помощью мышиных моноклональных антител к серотонину (Dako, титр 1:15). Моноклональные антитела идентифицировали авидин-биотин-пероксидазным (АБП) методом (Vectastain kit) для выявления мышиных иммуноглобулинов.

Количественные исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений (Imstar) с применением прикладных компьютерных лицензионных программ Morphostar и Colquant (Imstar), согласно основным принципам стереологии и морфометрии (26).

Количественную плотность энтероэндокринных (ЭНД) (N_END/1 мм²) и серотонин-положительных клеток (N_ser/1 мм²) определяли в 10 полях зрения. Тестовая площадь (S) составляла 5 мм².

Для статистической обработки полученных результатов использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Результаты исследований функциональной морфологии ДНЭС эпифизэктомированных крыс в условиях действия тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly демонстрируют стимулирующее влияние препарата на тканевой и клеточный метаболизм.

Установлено, что введение тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly оказывает компенсаторный эффект на структурно-функциональную организацию клеток ДНЭС эпифизэктомированных животных. Его действие проявляется через 3 суток после окончания введения препарата полным нивелированием эффекта эпифизэктомии и сохраняется через 12 суток, т.е. до окончания эксперимента по отношению ко всем исследуемым органам.

Полученные данные позволяют считать, что основной точкой приложения действия тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly являются EC-клетки желудка, в которых под влиянием тетрапептида усиливается экстрапинеальный синтез серотонина и мелатонина (табл. 16), что по-существу полностью компенсирует отсутствие эпифиза.

Таким образом, в результате экспериментального изучения установлено, что тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly не обладает токсичностью, нормализует показатели.

Выявленные в результате экспериментального доклинического исследования свойства тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly позволяют считать показанным его профилактическое и/или лечебное применение в качестве геропротекторного средства.

Приведенные ниже примеры результатов клинического изучения заявляемого тетрапептида демонстрируют его фармакологические свойства и подтверждают возможность осуществления изобретения.

Пример 9. Эффективность применения фармакологического средства, содержащего тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, у пациентов с нарушениями системы антиоксидантной защиты для профилактики преждевременного старения
Исследуемое фармакологическое средство применяли у 14 больных (34-69 лет) с возрастной патологией (гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца, хронический гастрит, инсулиннезависимый сахарный диабет) и снижением показателей системы антиоксидантной защиты в крови.

Средство, содержащее тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly в виде раствора для инъекций, вводили внутримышечно по 10 мкг на инъекцию ежедневно однократно в течение 10 дней.

На фоне применения средства происходило достоверное повышение активности супероксиддисмутазы и уменьшение содержания продуктов перекисного окисления липидов (табл. 17).

Пример 10. Эффективность применения фармакологического средства, содержащего тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, у пациентов с нарушением синтеза мелатонина для профилактики преждевременного старения
Фармакологическое средство применяли у 11 больных аспириновой бронхиальной астмой в возрасте от 39 до 63 лет. Основным признаком этого заболевания является связь приступов удушья с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и других нестероидных противовоспалительных средств. Известно, что сходное по химической структуре с ацетилсалициловой кислотой вещество - N-ацетил-5-метоксикинуренамин (N-АМК) образуется в организме в процессе метаболизма эпифизарного гормона мелатонина. Синтез мелатонина и, следовательно, уровень эндогенной N-AMK у больных аспириновой бронхиальной астмой значительно снижены, о чем свидетельствует низкая экскреция с мочой основного метаболита мелатонина - 6-сульфатоксимелатонина
Это явилось обоснованием нового патогенетического подхода к лечению аспириновой бронхиальной астмы путем коррекции содержания мелатонина в организме больного фармакологическим средством, содержащим тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Средство в виде раствора для инъекций вводили в утренние часы в виде ежедневных внутримышечных инъекций по 10 мкг в течение 10 дней.

Лечение больных проводилось в фазу затихающего обострения или ремиссии заболевания на фоне постоянной противоастматической терапии, включавшей ингаляционные и пероральные глюкокортикоиды.

До начала, во время лечения и далее ежемесячно больные субъективно оценивали свое самочувствие по наличию таких симптомов, как кашель, выделение мокроты, затруднение дыхания, заложенность груди, свистящие хрипы, приступы удушья, непереносимость физической нагрузки, холода, запахов. Клинический эффект препарата оценивали сразу после лечения и в течение 7 месяцев на основании анализа отчетов больных, содержавших сведения о динамике самочувствия, работоспособности, психологического состояния, нарушениях сна и суточных дозах используемых противоастматических средств.

У всех больных до начала лечения и сразу после приема последней дозы препарата оценивали функцию внешнего дыхания на основании следующих параметров: жизненной емкости легких (ЖЕЛ), остаточного объема (ОО), общей емкости легких (ОЕЛ), форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ), пиковой объемной скорости выдоха (ПОС_выд), максимальной объемной скорости выдоха при 50% и 75% форсированной ЖЕЛ (МОС₅₀ и МОС₇₅), объема форсированного выдоха за одну секунду (ОФБ₁), которые измерялись в процентах от должных величин. Кроме того, измеряли удельную проводимость бронхиального дерева (SGAW) в см вод. ст. Весь комплекс исследований повторяли через 15 минут после ингаляции беротека. Динамику ПОС, МОС₅₀, МОС₇₅ после ингаляции беротека оценивали в процентах от исходных величин. Все пациенты до начала лечения имели показатель OФВ₁ меньше 80% от должного.

Содержание основного метаболита мелатонина - 6-сульфатоксимелатонина определяли до лечения, сразу после окончания и через 10 дней в дневной (с 9.00 до 21.00) и ночной (с 21.00 до 9.00) порциях мочи иммуноферментным методом с помощью наборов "DRG Instrument GmbH" (Марбург, Германия).

Результаты исследований показали, что улучшение клинического состояния к концу лечения наблюдалось у подавляющего большинства больных, получавших исследуемое фармакологическое средство. Отмечалось уменьшение частоты дневных симптомов астмы, непереносимости физической нагрузки, резких запахов и холодного воздуха, улучшался сон. При объективном обследовании больных отмечено уменьшение или исчезновение свистящих хрипов в легких - симптомов бронхиальной обструкции. Исследование функции внешнего дыхания сразу после окончания лечения не выявило существенных изменений ЖЕЛ, ПОС выд., ОФВ₁, ОО/ОЕЛ. Однако у больных, получавших фармакологическое средство, содержащее тетрапептид L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, наблюдалось улучшение реакции на беротек на уровне дистальных бронхов. У больных увеличивалась экскреция 6-сульфатоксимелатонина с мочой, что свидетельствовало об увеличении продукции мелатонина, причем не только в ночное, но и в дневное время.

Источники информации
1. Harman D. Aging and disease: extending functional life span // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1996.-Vol. 786. - P. 321-336.

2. Pierpaoli W. Neuroimmunomodulation of aging: a program in the pineal gland // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1998. - Vol. 840. - P. 491- 497.

3. Yu B. P., Yang R. Critical evaluation of the free radical theory of aging: a proposal for the oxidative stress hypothesis // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1996. - Vol. 786. - P. 1-11.

4. Harman D. Free radical theory of aging: effect of free radical reaction inhibitors on the mortality rate of male LAFi mice // J. Gerontol. - 1968. - Vol. 23. - P. 476.

5. Машковский М. Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). - М.: Медицина, 1993. - Ч. II, гл. 10. - С. 213-215.

6. Comfort A., Youhotsky-Gore J., Pathmanathan K. Effect of ethoxyquin on the longevity of C3H mice // Nature. - 1971. - Vol. 229. - P. 254-255.

7. Обухова Л.К. Химические геропротекторы, увеличение продолжительности жизни // Усп. химии. - 1975. - Т. 44. - С. 1914-1925.

8. Эмануэль Н. М. , Обухова Л.К., Смирнов Л.Д., Бунто Т.В. Замедление процесса старения у лабораторных мышей при воздействии хлоргидрата 2-этил-6-метил-3-оксипиридина // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1977. - N 1. - С. 32- 37.

9. Обухова Л. К., Эмануэль Н.М. Молекулярные механизмы замедления старения антиоксидантами // Общие проблемы биологии // ВИНИТИ. - 1984. - Т.4. - С.44-80.

10. Фролькис В.В., Мурадян Х.К. Экспериментальные пути продления жизни. //- Л: Наука, 1988.

11. Baker G.T. Effect of various antioxidants on aging in Drosophila // Toxicol. Ind. Health. - 1993.-Vol. 9. -P. 163-186.

12. Epstein J., Himmelhoch S., Gershon D. Studies on ageing in nematodes. III. Electron-microscopical studies on age-associated cellular damage // Mech. Age. Dev. - 1972. - P. 245- 255.

13. Massie H.R., Aiello V.R., Williams T.R. et al. Effect of vitamin A on longevity // Exp. Gerontol. - 1993. - Vol. 28. - P.601-610.

14. Kumari M. V., Yoneda Т., Hiramatsu М. Effect of "beta CATECHIN" on the life span of senescence accelerated mice (SAM-P8 strain) // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1997. - Vol. 41, N 5.-P. 1005-1011.

15. Болдырев А. А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. - М.: Изд-во МГУ, 1998. - 320 с.

16. Pierpaoli W. , Regelson W. Pineal control of aging: effect ofmelatonin and pineal grafting in aging mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1986. - Vol. 91.- P. 787-791.

17. Reiter R., Tang L., Garcia J.J., Mucoz H.A. Pharmacological actions ofmelatonm in oxygen radical pathophysiology // Life Sci. - 1997. - Vol. 60, N 25. - P. 2255-2271.

18. Машковский М.Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). - М.: Медицина, 1993. -Ч. 1, гл. 3.-С. 375.

19. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - 456 с.

20. Мыльников С.В., Смирнова А.Н. Динамика смертности в инбредных селектируемых линиях и их гибридах у Drosophila melanogaster // Онтогенез. - 1994. -Т. 25, N4. -С. 7-11.

21. Agostini A. , Gerii G.C., Beretta L., Bianchi M. Superoxide dismutaze, catalase and gluthatione peroxidase activities in maternal and cord blood erythrocytes // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1980. - Vol. 18. - P. 771-773.

22. Kricka L.S., Thorpe G.H. The intensity of free radical oxidation // Chemiluminiscent and bioluminiscent methods in analytical chemistry. - 1983. - Vol. 108. - P.1274-1296.

23. Orr W. C. , Sohal R.S. Extension of life span by overexpression of superoxidedismutase and catalase in Drosophila melanogaster // Science. - 1994. - Vol. 263. -P. 1128-1130.

24. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. - М., 1963.

25. Кветной И.М., Южаков В.В. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов АПУД-системы // Микроскопическая техника: Руководство // Ред.: Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перов. - М.: Медицина, 1996. - С. 375-418.

26. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.