СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ИНФАРКТА МИОКАРДА У ЛИЦ БЕЗ КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

Введение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может быть использовано в медицине при прогнозировании риска развития инфаркта миокарда (ИМ). Предлагается способ определения наследственной предрасположенности к развитию инфаркта миокарда у лиц без клинических проявлений ишемической болезни сердца (ИБС), предусматривающий тестирование ДНК субъекта на наличие определенной комбинации аллелей (определенного генотипа) по полиморфному сайту 1019 гена коннексина-37 (Cx37) и полиморфному сайту 894 гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS).

Инфаркт миокарда является важной медицинской и социальной проблемой, поскольку он стал одной из ведущих причин смерти и инвалидизации во всём мире. В настоящее время считается доказанным, что причиной большинства ИМ является внутрисосудистый тромбоз, возникающий, как правило, на месте имеющейся атеросклеротической бляшки с повреждённой поверхностью (Zaman A.G. et al., 2000). При этом бляшки, вызывающие ИМ, чаще всего являются неокклюзирующими и сужают просвет артерии в среднем на 48% (Ambrose J.A. et al., 1988). Такие поражения, как правило, являются гемодинамически не значимыми и не приводят к возникновению типичных симптомов стенокардии. Соответственно, лица, имеющие подобные бляшки, в большинстве случаев считаются практически здоровыми, поэтому возникновение у них ИМ представляется внезапным событием. Ситуация усугубляется тем, что до настоящего времени не разработано надежных методов доклинической диагностики ИМ.

Известно, что в развитии ИМ существенную роль играют генетически обусловленные вариации активности белков, вовлеченных в патогенез атеросклероза и его осложнений (Lane D.A., Grant P.J., 2000, Damani S.B., Topol E.J., 2007, Packard R.R., Libby P., 2008). Поскольку для многих генетических факторов не существует биохимических или иных коррелятов, поддающихся измерению у пациентов, наиболее перспективным направлением в доклинической диагностике и прогнозировании развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС представляется метод прямого генотипирования.

Уровень техники

В последние годы изучению генетических факторов риска развития ИБС и ИМ уделяется большое внимание. Проведено значительное количество исследований, в которых изучались полиморфные маркёры в генах белков, связанных с эндотелиальной дисфункцией, развитием воспалительных реакций, регуляцией миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, коагуляцией, фибринолизом и многими другими процессами (Zhu M.M. et al., 2000, Xu J. et al., 2010, Siegerink B. et al., 2009, Tanis B.C. et al., 2004, Santoso S. et al., 1999, Eriksson P. et al., 1995, Iacoviello L. et al., 1998).

В последнее время одним из наиболее широко обсуждаемых факторов риска развития ИБС и ИМ является полиморфизм гена коннексина-37 (Сх37). Сх37 в организме человека экспрессируется, в частности, в эндотелии, моноцитах и гладкомышечных клетках, находящихся под атеросклеротической бляшкой (АСБ). Он участвует в адгезии моноцитов, опосредует взаимодействия между эндотелием и гладкомышечными клетками сосудов и многими исследователями рассматривается как важный молекулярный фактор, вовлеченный в развитие атеросклероза (Derouette J.P. et al., 2009). В 1997 г. Richard et al. описали однонуклеотидную замену С на Т в 1019 положении гена Сх37, приводящую к замене пролина на серин в положении 319 аминокислотной последовательности белка (Richard G. et al., 1997). Позднее в ряде работ была продемонстрирована связь мутантного гомозиготного генотипа ТТ с развитием ИМ (Hirashiki A. et al., 2003, Listi F. et al., 2005, Listi F. et al., 2007).

Однако существуют, по меньшей мере, две причины, в силу которых результаты исследования одного полиморфизма (в данном случае 1019Т в гене Сх37), связанного с тем или иным заболеванием (в данном случае ИМ), не могут считаться достаточным основанием для предсказания риска развития этого заболевания. Во-первых, индивидуальный вклад каждой отдельной генетической вариации в риск развития заболевания невелик, поэтому генотипирование пациентов только по одному полиморфизму имеет низкую предсказательную силу. Кроме того, полиморфизм может иметь разную патогенетическую значимость у представителей разных популяций. Очевидно, что повышение достоверности результатов и предсказательной способности обеспечивается при исследовании комбинации аллельных вариантов нескольких генов.

Применительно к ИМ такой подход использовали японские исследователи Yamada et al. (WO 2004/001037). Авторы отобрали 10 полиморфизмов, связанных с развитием ИМ у мужчин, и 5 полиморфизмов, связанных с развитием ИМ у женщин, и предложили методы определения генетического риска развития ИМ, основанные на определении комбинации двух или более полиморфизмов из списка отобранных.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ определения риска развития ИМ, предложенный этими авторами и защищенный патентом US 7,521,181 , в котором прогнозирование развития ИМ включает следующие стадии: а) анализ 2-х полиморфизмов: в позиции 1019 гена коннексина-37 и в позиции 242 гена p22phox NADH/NADPH оксидазы; б) основанное на полученной информации определение генотипа по двум названным полиморфизмам; и в) основанное на результатах определения генотипа заключение о генетическом риске инфаркта миокарда согласно представленным в работе таблицам.

Следует отметить, однако, что при всех достоинствах описанной в данной работе модели она обладает рядом недостатков. Так, есть основания полагать, что полиморфизм NADPH оксидазы является предиктором развития ИМ далеко не во всех популяциях. В частности, для российской популяции известна его связь с развитием ИБС, но не ИМ (Самоходская Л.М. и соавт., 2010). Кроме того, для увеличения предсказательной силы модели предпочтителен выбор полиморфизмов, объединённых патогенетически и при этом усиливающих действие друг друга, однако данных, которые указывали бы на наличие связи NADPH оксидазы и Сх37 в патогенезе ИМ, в литературе не имеется. Наиболее же существенным недостатком метода Yamada et al. является объединение пациентов с ИМ, имевших и не имевших клинические проявления ИБС в анамнезе, в общую группу, при том, что генетические тесты, связанные с риском ИМ, наиболее важны именно для лиц без клинических проявлений ИБС.

С учетом этого основной задачей настоящего изобретения было создание основанной на исследовании комбинации взаимосвязанных полиморфизмов надежной предсказательной модели развития ИМ у субъектов без предшествующих клинических проявлений ИБС.

Раскрытие изобретения

В основу предлагаемого способа прогнозирования развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС было положено определение полиморфизмов C1019T гена Сх37 и G894T (Glu298Asp) гена NO-синтазы 3-го типа (эндотелиальной NO-синтазы, eNOS) с последующим установлением генотипа по двум указанным полиморфным сайтам.

Полиморфизм гена eNOS выбран в качестве второго показателя по следующим причинам.

Во-первых, к настоящему времени известно, что данный фермент, и в частности его варианты, кодируемые аллелями 894G и 894T, обнаруживают определенную связь с развитием коронарного атеросклероза и ИМ. Замена гуанина тимином в 894-й позиции гена NO-синтазы приводит к замене глутамина аспарагином в 298-й позиции фермента (Glu298Asp), которая сопровождается снижением его каталитической активности в сосудах. При этом экспериментально установлено, что генотип ТТ (гомозиготность по 298Asp) существенно повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (Hingorani A.D. et al., 1999, Самоходская Л.М. и соавт., 2010). По некоторым данным гомозиготное состояние TT коррелирует и с повышением частоты ИМ (Hingorani A., 1999), однако в других работах уточняется, что такая взаимосвязь характерна только для ИМ на фоне ИБС (Самоходская Л.М. и соавт., 2010). Что касается генотипа GG, то есть основания предполагать, что повышенная относительно носителей других генотипов концентрация NO у лиц с генотипом GG может приводить к уменьшению пролиферации гладкомышечных клеток, участвующих в синтезе коллагена капсулы АСБ. У таких пациентов может быть повышена вероятность дестабилизации бляшки, в том числе и гемодинамически не значимой.

Во-вторых, недавно появились сведения об экспериментах in vitro (Pfenniger A. et al., 2010), свидетельствующих о возможности прямого взаимодействия Сх37 с эндотелиальной NO-синтазой (eNOS) и, соответственно, указывающих на высокую вероятность участия этих белков в одних и тех же процессах, в частности в процессе регуляции пролиферации гладкомышечных клеток в атеросклеротической бляшке.

При разработке предлагаемого способа определения генетической предрасположенности лиц без клинических проявлений ИБС к развитию ИМ нами был проведен анализ ДНК у 155 больных, перенесших ИМ. Для оценки распространённости вышеуказанных полиморфизмов в российской популяции была сформирована контрольная группа из 226 практически здоровых доноров (популяционный контроль). Результаты проведенных исследований показали следующее.

а) Генотип ТТ гена Сх37 коррелирует с риском развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС. Он встречается у 42,5% пациентов, перенесших ИМ без клинических признаков ИБС в анамнезе, и только у 10,7% пациентов, перенесших ИМ на фоне клинических проявлений ИБС (р=0,003) (см. пример 2, табл. 2).

б) Генотип GG гена eNOS также коррелирует с риском развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС. Он встречается у 54,3% пациентов, перенесших ИМ без клинических признаков ИБС в анамнезе, и только у 28,6% пациентов, перенесших ИМ на фоне клинических проявлений ИБС (р=0,02) (см. пример 3, табл. 3).

в) Сочетание двух указанных выше генотипов (ТТ гена Сх37 и GG гена eNOS) соответствует максимальному риску развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС. Указанная комбинация в три раза чаще встречается в группе пациентов, перенесших ИМ, в сравнении с популяционным контролем (см. пример 4, табл. 4). При этом наиболее существенным представляется тот факт, что среди всех пациентов с ИМ такая комбинация генотипов была выявлена исключительно у лиц, перенесших ИМ без предшествующих проявлений ИБС (см. табл. 5-7).

Таким образом, поставленная задача разработки предсказательной модели развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС была решена за счет использования в такой модели новой комбинации полиморфизмов, определяемых при проведении ДНК-тестирования. Предложенный метод включает а) получение образца геномной ДНК обследуемого лица, б) анализ данного образца на полиморфизмы С1019Т в гене Сх37 и G894T в гене eNOS; в) определение генотипа по двум названным полиморфным сайтам и г) составление заключения о высокой вероятности развития ИМ без предшествующей ИБС в случае одновременного наличия генотипа ТТ для гена коннексина-37 и генотипа GG для гена eNOS.

Предлагаемый способ достаточно прост в исполнении, характеризуется высокой чувствительностью и обладает высокой предсказательной силой.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР продукта рестриктазой MboI. Генотип GG - один фрагмент 152 п.н., генотип GT - три фрагмента: 152, 92 и 60 п.н., генотип TT - два фрагмента: 92 и 60 п.н.

Фиг. 2. Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР продукта рестриктазой DrdI Генотип TT - два фрагмента: п.н. (не показан), генотип СТ - три фрагмента: 275, 240 и 35 п.н., генотип СС - один фрагмент 275 п.н.

Осуществление изобретения

Материалы и методы

1. Критерии отбора больных для проведения анализа

В исследование включались пациенты мужского пола с клинически и инструментально подтвержденным диагнозом ИМ; возраст развития ИМ меньше 55 лет. Диагноз ИМ подтверждался отклонением от нормы биохимических маркёров (повышение МВ-КФК более чем в два раза выше нормы, повышение сердечных тропонинов Т и I выше 99-го перцентиля для контрольной группы), типичными изменениями на ЭКГ (смещение сегмента ST на 0,1 mV или инверсия зубца Т в двух или более смежных отведениях, подъем сегмента ST, патологический зубец Q или комплекс QS). Критерии исключения: нарушение толерантности к глюкозе, сахарный диабет.

2. Выделение ДНК

Выделение геномной ДНК из образца крови проводили с помощью модифицированного метода с протеиназой К и экстракцией фенол-хлороформом. Для этого в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносили 700 мкл анализируемого образца крови и 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) для гемолиза эритроцитов. Процедуру повторяли 2 раза, а затем к клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К, содержащего 200 мкг/мл протеиназы K, после чего инкубировали 4 часа при 60°С на термошейкере с постоянным перемешиванием (850 об/мин). Далее проводили фенол-хлороформную экстракцию ДНК с последующим осаждением 96% этанолом и центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. После серии промывок ДНК элюировали TE буфером (200 мкл). Концентрация выделенной ДНК составляла от 30 до 50 нг/мкл.

3. ПЦР-амплификация и анализ ПЦР-продуктов

Для определения полиморфизмов в исследуемых генах применялся метод ПДРФ (полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили в термоциклере Master Cycler (Eppendorf). При этом использовали пробу следующего состава: 100 мМ Tris-HCl, pH 8,3 (25°С), 50 мМ КСl, MgCl₂ (концентрация подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров), четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (по 200 мкМ каждого), Taq-полимераза (0,5 ед/реакцию) и 1-2 мкг геномной ДНК и праймеры (4-8 пмоль/реакцию). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл. При постановке ПЦР использовался прием «горячего старта» (Hebert B, Bergeron J, Potworowski EF, Tijssen P., 1993).

Условия проведения реакции несколько различались в зависимости от определяемого аллеля (см. примеры 2-3).

Рестрикционный анализ продуктов ПЦР проводился с помощью соответствующей рестриктазы в течение 6 часов.

Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, концентрация которого подбиралась в зависимости от длины рестрикционных фрагментов.

4. Статистическая обработка результатов

Данные представляли как среднее арифметическое со стандартным отклонением. Статистическая значимость различий для количественных признаков в случае нормального распределения последних оценивалась с помощью t - критерия. Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи критерия χ² с поправкой Йетса и точного критерия Фишера. Уровень значимости был принят p<0,05. Для статистической обработки был использован пакет программ Statistica 6.0.

Примеры

Пример 1. Характеристика группы пациентов, отобранных для ДНК-тестирования.

В соответствии с указанными выше критериями было отобрано 155 пациентов, из которых 127 перенесли ИМ без предшествующих клинических проявлений ИБС, а 28 имели ИБС до ИМ. По частоте встречаемости основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний группы значимо не отличались.

Таблица 1. Сравнительная характеристика обследованных больных.

Пример 2. Определение полиморфизма C1019T гена Сх37.

Геномную ДНК, выделенную из каждого образца крови, подвергали ПЦР-амплификации, как описано в разделе «Материалы и методы».

После горячего старта и первой денатурации (94°С, 5 мин) проводили амплификацию из 30 циклов, каждый из которых включал денатурацию при 94°С в течение 10 сек, отжиг праймеров при 60°С в течение 60 сек и элонгацию при 72°С в течение 60 сек. При этом использовали праймеры 5'-CTG GAC CCA CCC CCT CAG AAT GGC CAA AGA-3' и 5'-AGG AAG CCG TAG TGC CTG GTG G-3'. По окончании реакции 8,5 мкл ПЦР-продукта (275 п.н.) инкубировали при 37ºС с 0,5 мкл (5 Ед.) рестриктазы DrdI и 1 мкл 10-кратного буфера для рестрикции. Продукты рестрикции визуализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. В случае присутствия аллеля С образовывались фрагменты размером 240 и 35 п.н. При наличии аллеля Т сайт рестрикции отсутствует, поэтому сохраняется фрагмент размером 275 п.н. (фиг. 1). После анализа всех образцов рассчитывали частоту встречаемости генотипов в анализируемых группах. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Частота встречаемости генотипов полиморфизма C1019T гена Сх37 у пациентов с ИМ и в популяции

*различия по частоте встречаемости данного генотипа в сравнении с суммарной частотой двух других генотипов. p _1-2 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе и группой больных ИМ с клиникой ИБС в анамнезе, p _1-3 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе и группой популяционного контроля, p _2-3 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ с клиникой ИБС в анамнезе и группой популяционного контроля.

Из приведённых данных видно, что риск развития ИМ у лиц без клинически проявлений ИБС в анамнезе коррелирует с наличием генотипа ТТ. У пациентов, перенесших ИМ на фоне клинических проявлений ИБС, напротив, этот генотип встречается в 3-5 раз реже, чем генотипы СС и СТ в той же группе пациентов и примерно в 4 раза реже, чем генотип ТТ в группе больных ИМ без коронарного анамнеза. Частоты встречаемости различных генотипов в группе популяционного контроля практически не отличались от частот в группе больных ИМ с клиникой ИБС в анамнезе.

Пример 3. Определение полиморфизма G894T гена NO-синтазы.

Геномную ДНК, выделенную из каждого образца крови, подвергали ПЦР-амплификации, как описано в разделе «Материалы и методы».

После горячего старта и первой денатурации (94°С, 5 мин) проводили амплификацию из 35 циклов, каждый из которых включал денатурацию (95°С, 10 сек), отжиг праймеров (61°С, 30 сек), элонгацию (72°С, 45 сек). В реакции использовали праймеры 5'-GGC TGG ACC CCA GGA AAC-3' и 5'-CCA CCC AGT CAA TCC CTT TG-3'. После завершения амплификации 8,5 мкл ПЦР-продукта (198 п.н.) инкубировали при 37ºС с 0,5 мкл (10 Ед.) рестриктазы MboI и 1 мкл 10-кратного буфера для рестрикции. Продукты рестрикции визуализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Присутствие аллеля G выявляли по наличию одного фрагмента размером 152 п.н., а аллеля T - по наличию двух фрагментов 92 и 60 п.н. (фиг. 2). После анализа всех образцов рассчитывали частоту встречаемости генотипов в анализируемых группах. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Частота встречаемости генотипов полиморфизма G894T гена NO-синтазы у пациентов с ИМ и в популяции

*различия по частоте встречаемости данного генотипа в сравнении с суммарной частотой двух других генотипов. p _1-2 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе и группой больных ИМ с клиникой ИБС в анамнезе, p _1-3 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе и группой популяционного контроля, p _2-3 - статистический уровень значимости для различий между группой больных ИМ с клиникой ИБС в анамнезе и группой популяционного контроля.

Из полученных данных следует связь между развитием ИМ у субъектов без клинических проявлений ИБС в анамнезе и наличием аллеля 894G гена eNOS в гомозиготном состоянии. У пациентов, перенесших ИМ на фоне предшествующей ИБС, этот генотип (GG) встречается примерно в два раза реже, чем у больных без коронарного анамнеза. Следует отметить, что различия между группами больных ИМ и группой популяционного контроля не были статистически значимыми, т.е. само по себе определение полиморфизма G894T гена eNOS не является достаточно надёжным тестом для определения предрасположенности к развитию ИМ.

Пример 4. Анализ частоты встречаемости комбинаций генотипов и прогнозирование возможности развития ИМ у лиц, не имеющих клинических проявлений ИБС.

С целью определения комбинаций, обеспечивающих наиболее точное предсказание вероятности развития ИМ у лиц, не имеющих проявлений ИБС, были проанализированы все возможные комбинации генотипов по двум исследованным полиморфизмам. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4. Частота встречаемости различных комбинаций генотипов по полиморфизмам Сх37 и eNOS у пациентов с ИМ в зависимости от наличия клинических проявлений ИБС в анамнезе.

Из полученных данных с очевидностью следует, что в группе пациентов с ИМ без клиники ИБС в анамнезе наиболее часто встречающейся является комбинация генотипов TT/GG. Доля данного генотипа у больных этой группы составляет 23,62 %, тогда как представленность данной комбинации в контрольной группе втрое ниже (7,02%). При этом выявлена неожиданная особенность в распределении комбинации ТТ/GG между двумя группами больных: данная комбинация встречается исключительно у пациентов с ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе (см. строку 7 в табл. 4), т.е. достаточно специфично определяет генетическую предрасположенность к развитию ИМ без предшествующих симптомов ИБС (данные по комбинации генотипов ТТ/ТТ во внимание не приняты по причине их недостоверности).

В таблице 5 представлены данные по сравнению групп пациентов по частоте встречаемости комбинации ТТ/GG и прочих комбинаций генотипов при помощи точного критерия Фишера

Таблица 5. Частота встречаемости комбинации генотипов ТТ гена Сх37 и GG гена eNOS в сравнении с другими комбинациями у пациентов с ИМ в зависимости от наличия клинических проявлений ИБС в анамнезе.

В таблицах 6 и 7 представлены данные сравнения каждой из двух групп пациентов с ИМ (с клиническими проявлениями ИБС в анамнезе и без них) с популяционным контролем.

Таблица 6. Частота встречаемости комбинации генотипов ТТ гена Сх37 и GG гена eNOS в сравнении с другими комбинациями у пациентов с ИМ без клинических проявлений ИБС в анамнезе и в группе популяционного контроля.

Таблица 7. Частота встречаемости комбинации генотипов ТТ гена Сх37 и GG гена eNOS в сравнении с другими комбинациями у пациентов с ИМ в зависимости от наличия клинических проявлений ИБС в анамнезе.

Сочетание двух генотипов (ТТ по полиморфному сайту 1019 гена Сх37 и GG по полиморфному сайту 894 гена eNOS), неблагоприятная роль каждого из которых в развитии ИМ была показана ранее, соответствует максимальному риску развития ИМ у лиц без клинических проявлений ИБС. Указанная комбинация статистически значимо чаще встречается в группе пациентов, перенесших ИМ и не имевших в анамнезе клиники ИБС, по сравнению как с популяционным контролем, так и с группой пациентов без проявлений ИБС. Распределение различных комбинаций в группе пациентов с ИМ, имевших в анамнезе клинику ИБС, не имеет статистически значимых отличий от их распределения в контрольной группе.

Таким образом, предлагаемый способ определения риска развития ИМ, основанный на анализе комбинации полиморфизмов генов Сх37 и eNOS, позволяет выделить среди практически здоровых лиц группу высокого риска развития ИМ по признаку носительства генотипа ТТ (по положению 1019 гена Сх37)/GG (по положению 894 гена eNOS). Поскольку у лиц с указанным генотипом согласно нашим данным ИМ развивается без каких-либо клинических предвестников, таким лицам исходно должны быть рекомендованы регулярные кардиологические обследования и меры первичной профилактики.