РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использована при получении рекомбинантного инсулина человека.

Инсулин-белковый (пептидный) гормон животных и человека, вырабатываемый клетками островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина, состоящего из 109 аминокислотных остатков. В процессе биосинтеза в результате отщепления сигнального пептида из 23 аминокислот высвобождается проинсулин, который в дальнейшем подвергается процессингу, приводящему к образованию собственно инсулина в результате специфического «выщепления» 35 аминокислот С-пептида. Зрелый биологически активный инсулин состоит из двух цепей, соединенных двумя дисульфидными связями. Цепь А содержит 21, а цепь В - 30 аминокислотных остатков.

Инсулин понижает содержание сахара в крови, задерживая распад гликогена в печени и увеличивая использование глюкозы мышечными и другими клетками. Недостаток инсулина приводит к развитию такого заболевания, как сахарный диабет.

Лечение этого заболевания осуществляют путем компенсации недостатка данного гормона за счет препаратов, содержащих высокоочищенный инсулин. Ранее в медицинской практике для лечения инсулинозависимого сахарного диабета (тип 1) широко использовали инсулин животного происхождения, полученный экстракцией из поджелудочной железы свиньи или крупного рогатого скота. Однако применение таких препаратов нередко приводит к осложнениям, обусловленным потенциальной иммуногенностью чужеродного белка.

Потребность мирового рынка в инсулине оценивается в 18 000,00 кг/год.

В настоящее время перспективным способом получения инсулина человека является способ, основанный на технологии рекомбинантных белков. Наиболее распространенным способом получения целевого продукта путем микробиологического синтеза является внесение гена, ответственного за синтез продуцируемого вещества в клетку штамма-реципиента. Как правило, для введения гена в клетку штамма-реципиента используют вектор, содержащий, в частности, экспрессионную кассету (промотор, терминатор транскрипции, селективный маркер). Синтез целевого продукта достигается путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента.

Из уровня техники известны способы получения рекомбинантного инсулина человека, включающие культивирование штамма-продуцента, экспрессирующего белок-предшественник, рефолдинг белка-предшественника, его протеолитическую конверсию и последующие стадии очистки полученного инсулина. Среди множества источников информации, посвященных получению рекомбинантного инсулина, существуют работы, описывающие генетические конструкции, кодирующие белки-предшественники, отличающиеся по молекулярному весу в диапазоне от 16,7 до 47 кДа за счет различного дизайна аминокислотных последовательностей лидерного препептида и С-пептида-участка, связывающего аминокислотные последовательности А- и В-цепи.

Известно, что в отсутствие лидерного препептида синтез предшественника инсулина в клетках E.coli ингибируется за счет высокой цитотоксичности последовательности проинсулина. В качестве лидерных последовательностей, защищающих рекомбинантный белок от протеолитической деградации, используют, например, последовательность глутатион S-трансферазы (см. Berg Н., Walter М., Mauch L., Seissler J., Northemann W. Recombinant human preproinsulin expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus. 1993, Journal of Immunological Methods, v. 164, p.221-231), IgG-связывающий домен (см. Jonasson P., Nilsson J., Samuelsson E., Moks Т., Stahl S., Uhlen M. Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its С peptide. 1996, European Journal of Biochemistry, v. 236, p.656-661), последовательность, содержащую 6 гистидиновых остатков (см. Berg Н., Walter М., Mauch L., Seissler J., Northemann W. Recombinant human preproinsulin expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus. 1993, Journal of Immunological Methods, v. 164, p.221-231), мальтозосвязывающий домен, бета-галактозидаза (Cho Ch.W., Park S.H., Nam D.H. Production and purification of single chain human insulin precursors with various fusion peptides. 2001, Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 6, p.144-149) и т.п.

Дизайн лидерного фрагмента осуществляют с учетом того, что синтезируемый в составе гибридного белка проинсулин человека накапливается в бактериальной клетке в виде нерастворимых конгломератов, так называемых «телец включения». Кроме того, лидерный фрагмент необходим для инициации трансляции за счет содержания стартового метионина.

Очевидно, что чем больше размер молекулы предшественника инсулина, тем ниже выход конечного продукта. Это происходит из-за снижения процентного содержания аминокислотной последовательности инсулина к общему аминокислотному содержанию предшественника.

Из уровня техники известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, заключающийся в культивировании штамма-продуцента E.coli, продуцирующего гибридный белок, в котором, кроме проинсулина, содержится два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Схема выделения инсулина заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих гибридный белок, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка с помощью аффинной хроматографии на IgG-Sepharosa, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (см. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahi S., Uhlen M. «Integrated production of human insulin and its C-peptide», Jurnal of biotechnology, 1996, v. 48, p.241-250).

Недостатки известного способа обусловлены использованием богатой питательной среды для выращивания штамма-продуцента, высокой себестоимостью целевого продукта из-за использования для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном применении.

Кроме того, недостатком данного способа является и низкий выход целевого продукта.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM 109pPINS07, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, восстановление дисульфидных связей, рефолдинг и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, при этом предварительно проводят отмывку телец включения, а растворение белка и восстановление дисульфидных связей проводят одновременно в буферном растворе, дополнительно содержащем 5-10 мМ дитиотреитола, в течение 3-7 часов, очистку ренатурированного гибридного белка проводят в одну стадию с использованием ионнообменных сорбентов с ДЕАЕ- или SP-группами, расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:1-2:1, очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с использованием сорбента Butyl-Toyopearl 650 с последующей гель-фильтрацией, а выделение - кристаллизацией в присутствии солей цинка (см. патент РФ на изобретение №2208637 «Способ получения генно-инженерного инсулина человека», дата подачи 16.04.2002 г., опубликовано 20.07.2003 г.).

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащая EcoRI/HindIII-фрагмент плазмиды рКК223-3, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (blа), участок инициации репликации (ori) и терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, EcoRI/BamHI-фрагмент (220 п.о.) с искусственным геном, кодирующим IgG-связующий домен белка А из Staphylococcus aureus и гексагистидиновый домен, и BamHI/HindIII-фрагмент (271 п.о.), кодирующий последовательность аргинилпроинсулина человека, генетический маркер - ген β-лактамазы (blа), детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pPINS07 клеток E.coli к ампицилину, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI-l,NcoI - 217, BamHI -221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalI - 4513, ClaI - 4792 (см. патент РФ на изобретение №2144957 «Рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека», дата подачи 26.02.1999 г., опубликовано 27.01.2000 г.).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, при этом в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений в 40% изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,003-0,1М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0-6,0, содержащем 6М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия 0-0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией (см. патент РФ на изобретение №2141531 «Способ получения рекомбинантного инсулина человека», дата подачи 26.05.1999 г., опубликовано 20.11.1999 г.).

Способ позволяет получить инсулин более высокого качества и степени очистки с чистотой не ниже 96% и активностью не ниже 26 Е/мг.

Техническим результатом, на достижение которого направлена заявляемая группа изобретений, является повышение качества и количества выхода целевого продукта - рекомбинантного инсулина человека, а также упрощение способа промышленного получения рекомбинантного инсулина человека.

Заявляемый результат достигается за счет конструирования рекомбинантной плазмиды pMSIN4, кодирующей гибридный полипептид - предшественник инсулина человека, создания штамма BL21(DE3)/pMSIN4 - продуцента рекомбинантного инсулина человека, а также оптимизации способа промышленного получения рекомбинантного инсулина человека.

Заявляемая рекомбинантная плазмида pMSIN4 для экспрессии рекомбинантного инсулина человека, имеющая размер 5495 п.о., состоит из следующих элементов:

гена устойчивости к канамицину (Кан^r, 813 п.о.);

клонированного гена (225 п.о.), кодирующего белок-предшественник инсулина и содержащего препептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка (2,46 кДа);

промотора Т7 (17 п.о.);

кодона аргинина (CGC), связывающего последовательности, кодирующие В- и А-цепи инсулина;

участка репликации (ColE 1 origin, 588 п.о.).

Особенностью вышеупомянутой плазмиды является то, что она содержит синтетический ген, кодирующий белок - предшественник инсулина и содержащий препептид небольшого размера, состоящий из 21 аминокислотного остатка (2,46 кДа). Структура гена, кодирующего участок проинсулина, отличается от соответствующего участка нативного гена проинсулина человека, а именно из ДНК последовательности удален участок, кодирующий С-пептид, и вместо него введен кодон аргинина, который связывает последовательности, кодирующие В- и А-цепи инсулина.

Данное отличие обеспечивает более высокий выход целевого продукта за счет повышения процентного содержания инсулиновой части от проинсулиновой, что подтверждено приведенными ниже структурами нативного (А) и синтетического проинсулина (В).

Так, нативный проинсулин содержит 86 аминокислотных остатков, а инсулин состоит из 51 аминокислотного остатка. Таким образом, инсулиновая часть в нативном проинсулине составляет 59,3%. В предложенном конструкте проинсулиновая часть содержит 52 аминокислотных остатка, и соответственно инсулиновая часть составляет 98% от проинсулиновой или 68,9% от гибридного белка. Для улучшенной экспрессии гибридного белка и повышения выхода синтезированного продукта клонированная последовательность оптимизирована под триплеты, характерные для тРНК E.coli.

Созданная плазмидная ДНК была введена в клетки Escherichia coli (E.coli) штамма BL21(DE3).

Штамм BL21(DE3)/pMSIN4, депонированный в Чешской коллекции микроорганизмов (Czech Collection of Microorganisms, Masaryk University, Brno, Czech Republic, идентификационный №CCM 7884), получен трансформацией клеток E.coli штамма BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pMSIN4.

При культивировании штамма-продуцента BL21(DE3)/pMSIN4 бактериальную культуру выращивают до 100-120 оптических единиц, что позволяет увеличить выход телец включений по сравнению с прототипом.

Заявляемый способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli в питательной среде, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере с использованием хаотропных агентов, рефолдинг гибридного белка, его поэтапное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, согласно изобретению в качестве штамма-продуцента используют штамм BL21(DE3)/pMSIN4, несущий рекомбинантную плазмиду pMSIN4, разрушение клеток проводят с использованием гомогенизатора, после рефолдинга осуществляют концентрирование гибридного белка путем осаждения его в изоэлектрической точке в присутствии ионов цинка, расщепление трипсином проводят при массовом соотношении 5000-20000:1 и рН 11,0-11,5, после которого выполняют поэтапную очистку, включающую в себя очистку на обращенно-фазовых сорбентах, в том числе с использованием полимерного сорбента или модифицированного силикагеля с элюцией продукта линейным градиентом по концентрации 2-пропанола, и ионообменную хроматографическую очистку на полимерных сорбентах, после которых проводят расщепление карбоксипептидазой Б при массовом соотношении 10000-50000:1 и заключительную очистку с использованием модифицированных обращенно-фазовых силикагелей с элюцией фракций бинарным линейным градиентом по концентрации 2-пропанола.

В качестве гомогенизатора используют гомогенизатор «Microfluidizer».

В качестве модифицированного сферического сорбента используют силикагель Daisogel SP-120-10-C8-Bio, а в качестве полимерного сорбента используют сорбент Amberchrom ХТ-20.

В большинстве известных источников информации не приводится детального описания процесса получения телец включения или описание относится к лабораторному, а следовательно, малопродуктивному способу, при котором разрушение клеток осуществляют воздействием ультразвука или обработкой лизоцимом. Применение ультразвука в промышленном масштабе неэффективно из-за низкого процента разрушения бактериальных клеток (50-60%), а использование лизоцима приводит к удорожанию целевого продукта из-за высокой стоимости этого фермента.

Рефолдинг включает в себя следующие стадии: растворение телец включения в присутствии хаотропных агентов, восстановление дисульфидных связей, ренатурацию белка с образованием нативной конформации и концентрирование рефолдированого белка.

Для ренатурации предшественника инсулина в литературе описаны два альтернативных пути, один из которых основан на использовании окислительного сульфитолиза SH-групп цистеиновых остатков (см. Zhigis L. S., Rapoport Е. М., Zueva V. S., Reshetov P. D. A study of human recombinant insulin S-sulfonation conditions. 1993, Pharmaceutical Chemistry Journal, v. 27, p.789-796); второй - на образовании дисульфидных связей за счет окисления восстановленных SH-групп в среде с соответствующим редокс-потенциалом. Второй путь ренатурации предшественника инсулина является более совершенным благодаря сокращению количества технологических операций и используемых реагентов.

Стадия концентрирования ренатурированного белка-предшественника инсулина в предлагаемом изобретении является низкозатратной и занимает значительно меньше времени, чем в подходах, описанных в известных источниках. Как правило, концентрирование рефолдированного предшественника инсулина выполняют с использованием хроматографических методов или с помощью ультрафильтрации. В промышленном масштабе оба эти подхода требуют использования дорогостоящего базового оборудования и расходных материалов, например таких, как сорбенты для хроматографии и кассеты с мембраной для тангенциальной ультрафильтрации.

Для протеолитической конверсии предшественника инсулина используют несколько стадий и разнообразный набор ферментов. Так, для отщепления лидерного фрагмента используют бромциан, тромбин, фактор Ха и т.п., а также трипсин в зависимости от дизайна препептида и наличия соответствующего сайта для протеолитического фермента. Использование бромциана ограничено из-за его высокой токсичности, а применение специфических протеаз, таких как тромбин, фактор Ха и т.п., неэкономично при больших объемах производства из-за высокой стоимости последних.

Наличие С-концевого Arg в последовательности лидерного фрагмента позволяет использовать для его отщепления трипсин, что является более технологичным. Кроме того, для расщепления проинсулиновой части предшественника инсулина используют трипсин с карбоксипептидазой Б, при этом расщепление проводят как в два этапа, выполняя последовательную обработку, так и используют обработку обоими ферментами одновременно. Совместная обработка данными ферментами сокращает количество стадий процесса, но затрудняет контроль за трипсинолизом, так как во время обработки наряду с инсулином неизбежно образуются другие протеолитические продукты, а именно Des-(В30)Thr-инсулин и Des-octapeptide(B23-B30)-инсулин. Помимо этого, при совместной обработке трипсином и карбоксипептидазой Б существенно (от 10 до 15 раз) увеличивается расход карбоксипептидазы Б.

В заявляемом техническом решении предлагается оптимизированная схема протеолитической конверсии белка - предшественника инсулина с удельным выходом инсулина не менее 60% от массы рефолдированного гибридного белка и технология очистки полупродукта Arg-(В31)-инсулина и инсулина, устраняющая перечисленные выше недостатки. Данная схема не предусматривает проведение очистки гибридного белка, что позволяет отказаться от использования больших объемов ионообменных сорбентов и мочевины, что, в свою очередь, не только значительно снижает стоимость технологии, но и упрощает ее.

В ряде работ для очистки и получения высокоочищенного инсулина предложено множество схем, включающих в том числе аффинную хроматографию, гельпроникающую хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, ионообменную хроматографию и ВЭЖХ на обращено-фазовых сорбентах. Но известные схемы имеют свои недостатки, обусловленные, в частности, высокой стоимостью хроматографического процесса из-за использования аффинных сорбентов, большого расхода мочевины и сорбентов, применяемых для очистки гибридного белка, а также многостадийностью, низким выходом целевого продукта, плохой селективностью и т.п.

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения.

Заявляемый способ поясняется чертежом, где показана физическая карта плазмиды pMSIN4, где

Кан^r- ген устойчивости к канамицину (813 п.о.);

Ген ГБ - клонированный ген (225 п.о.), кодирующий белок-предшественник инсулина и содержащий препептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка (2,46 кДа);

Т7 promoter - промотор фага Т7 (17 п.о.);

ori - участок репликации (ColEl origin, 588 п.о.).

Осуществление заявляемого способа получения рекомбинантного инсулина человека подтверждается примерами конкретного выполнения.

1. Создание плазмиды pMSIN4

Синтетический ген, кодирующий предшественник инсулина, получают путем сборки в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных затравок №1-№3, приведенных ниже

№1. AAAGAAGCCACGCTCGCCGCACACTAAATACAGCGCTTCCACCAGGTGGCT GCCACACAGATGCTGGTTCACAAAGCGCATATGAG;

№2. TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCCGTGGCATTGTGGAACAG TGTTGCАССAGTATTTGTAGCCTGTATC;

№3. CATTGAATTCTTAGTTGCAGTAATTTTCCAGCTGATACAGGCTACAAATACT GGTGCAAC.

Для амплификации ПЦР-продукта используют праймеры №4 и №5

№4. CTCATATGCGCTTTGTGAACCAGCAT;

№5. CATTGAATTCTTAGTTGCAGTAATT.

Сборку и амплификацию гена проводят в условиях одной ПЦР реакции, для чего в реакционную смесь вносят по 5 пМ праймеров №1-№3 и по 50 пМ праймеров №4 и №5. Реакцию ПЦР проводят согласно протоколу фирмы производителя ПЦР-набора (Fermentas ##ЕР0501) по следующей схеме:

Затем очищенный ПЦР-продукт и векторную ДНК (рЕТ28а) в течение 1 часа подвергают обработке нуклеазами NdeI и EcoRI согласно протоколам (Fermentas #ER0581, #ER0271). Продукты рестрикции очищают из агарозного геля с использованием набора GeneClean (Qbiogene #1001-200) и лигируют в стандартных условиях (Fermentas #EL0011), после чего 2 мкл полученной лигазной смеси используют для проведения трансформации клеток E.coli штамма DH5α. Селекцию позитивных клонов проводят с использованием 30 мкг/мл канамицина сульфата. С ряда индивидуальных колоний выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют с помощью рестрикционного анализа и секвенирования. Созданную плазмидную ДНК, имеющую последовательность, совпадающую с расчетной, используют для трансформации клеток E.coli штамма BL21(DE3).

2. Культивирование штамма-продуцента BL21(DE3)/pMSIN4

Содержимое ампулы рабочего банка штамма-продуцента BL21(DE3)/pMSIN4 инокулируют в колбу объемом 2 л, содержащую 1 л среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина. На протяжении 12 часов колбу инкубируют в термошейкере при скорости 250 об/мин и температуре 37°С, после чего содержимое колбы вносят в аппарат посевной, представляющий собой ферментер с рабочим объемом 75 л, содержащим среду культивирования, состав которой приведен в Таблице.

Культивирование проводят в условиях автоматического контроля температуры (37°С±0,5°С), уровня рН (7,0±0,2), диапазона растворенного кислорода (50%<DO₂<70%). Коррекцию уровня растворенного кислорода осуществляют путем изменения оборотов мешалки, а коррекцию уровня рН - добавлением концентрированного гидроксида аммония. Процесс ферментации выполняют до достижения культурой оптической плотности, равной OD₆₀₀±12 ОЕ, после чего содержимое посевного аппарата переносят по стерильным трубопроводам в основной ферментер с рабочим объемом 2000 л, содержащим среду культивирования, состав которой приведен в Таблице.

Культивирование штамма в ферментере осуществляют при тех же режимах, что и в аппарате посевном, с той лишь разницей, что, начиная с точки активного роста рН (как правило, на уровне OD₆₀₀5±l ОЕ), в ферментер непрерывным потоком начинают подавать питательную смесь, содержащую раствор 30% глюкозы и 0,5% раствор сульфата магния. Скорость подачи глюкозы корректируется автоматически в зависимости от уровня растворенного кислорода (50%<DO₂<70%). Ферментацию ведут до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀=50±5 ОЕ, после чего вносят индуктор IPTG до конечной концентрации, равной 1 мМ. Культивирование в вышеуказанных условиях продолжают в течение 6 часов, при этом бактериальная культура достигает оптической плотности 100-150 ОЕ.

3. Получение телец включения

По завершении культивирования штамма-продуцента содержимое ферментера охлаждают до 10°С±2°С и подают на саморазгружающийся сепаратор со скоростью потока 1000±100 л/час. Установлено, что при таком режиме потери за счет не выпавших в осадок клеток составляют не более 5%, при этом уменьшение скорости потока существенно не влияет на повышение количества осажденных клеток. Концентрированную бактериальную массу разводят до плотности OD₆₀₀=250±50 ОЕ охлажденным (10°С±2°С) раствором следующего состава: 20 мМ трис-HCl, рН 8.0; 1 мМ ЭДТА.

Полученную суспензию дважды пропускают через наногомогенизатор, в качестве которого используют аппарат, например «Microfluidizer», на котором при давлении, равном 15000 psi, осуществляют разрушение клеток. Экспериментально установлено, что однократный проход суспензии через наногомогенизатор с соблюдением вышеуказанных условий приводит к разрушению 80-85% клеток, тогда как повторное пропускание повышает процент разрушенных клеток до 98-99%.

Разрушенную биомассу со скоростью 2000±500 л/час подают на саморазгружающийся сепаратор. Полученную суспензию разводят до 1000 л для отмывки охлажденным буфером следующего состава: 20 мМ трис-HCl, рН 8.0; 1 мМ ЭДТА; 1% Тритон Х-100 и инкубируют при перемешивании со скоростью 100±20 об/мин в течение 30 минут, а затем снова подают на сепаратор. Цикл отмывания телец включения повторяют трижды.

4. Рефолдинг и концентрирование ренатурированного белка

Полученную на стадии отмывки суспензию телец включения разводят водой таким образом, чтобы содержание белка в суспензии составляло 180-200 г/л. В суспензию добавляют глицин до концентрации 50 мМ, ЭДТА до концентрации 1 мМ, а также мочевину или гуанидин гидрохлорид до конечной концентрации 8М и 6М соответственно. После растворения хаотропного агента добавлением раствора гидроксида натрия (NaOH) корректируют рН раствора до значения 8,0-8,2, затем вносят β-меркаптоэтанол до конечной концентрации 100 мМ.

Восстановление белка проводят при постоянном перемешивании на протяжении 2-6 часов, после чего в охлажденный до 10-15°С буфер для рефолдинга, имеющий следующий состав: 20 мМ глицин, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ цистин, 10% глицерин, рН 11,2, вносят раствор белка при соотношении 1:100 в количестве, при котором концентрация белка в рефолдинг-буфере составит 0,9-1,0 г/л. Процесс рефолдинга белка ведут при постоянном перемешивании на протяжении 8-12 часов. Время окончания процесса рефолдинга определяют экспериментально по прекращении нарастания концентрации рефолдированого белка согласно ВЭЖХ-анализу.

По завершении процесса рефолдинга в раствор рефолдированого белка вносят хлорид цинка (ZnCl₂) до конечной концентрации 2 мМ и корректируют рН раствора до 7,8, что соответствует изоточке гибридного белка. В этих условиях в течение 20-30 мин идет образование хорошо седиментируемого осадка, самопроизвольное осаждение которого приводит к четкому разделению водных фаз: содержащей и несодержащей белковый преципитат, что позволяет декантировать большую часть (до 80%) надосадочной жидкости. Осадок гибридного белка подают на сепаратор (g-фактор ≥4000), снабженный автоматической выгрузкой осадка. Концентрированная суспензия осадка рефолдированого белка собирается и передается на стадию ферментативной конверсии.

5. Трипсинолиз гибридного белка (расщепление трипсином)

Полученную на предыдущей стадии концентрированную суспензию рефолдированого белка собирают в реактор, оснащенный водяной рубашкой и мешалкой. В суспензию добавляют воду, очищенную до концентрации рефолдированого белка 10-12 мг/мл, 2М раствора кислоты хлористоводородной до доведения значения рН 2,5-3,0 и перемешивают в течение 20-30 минут до полного растворения белка. В полученном растворе определяют концентрацию рефолдированого белка (2540 г по ВЭЖХ). Затем в состав добавляют глицин до концентрации 100 мМ. Внесением 2М раствора гидроксида натрия устанавливают значение рН в пределах 11,0-11,5. Полученный раствор рефолдированого белка охлаждают до температуры 10-12°С, после чего в раствор гибридного белка загружают 254 мг трипсина свиного (массовое соотношение 10000:1). Процесс трипсинолиза выполняют при температуре 10-12°С в течение 16-18 часов до достижения максимальной концентрации Аrg-(В31)-инсулина (контроль по ВЭЖХ проводят каждые 2 часа) и заканчивают добавлением 2М раствора кислоты хлористоводородной до значения рН, равного 2,5-3,0. В раствор Аrg-(В31)-инсулина, полученного на предыдущей стадии, добавляют при перемешивании 2-пропанол до концентрации 20%, выдерживают при выключенной мешалке в течение 10-12 часов при температуре 10-12°С и подают для осветления на центрифугу с g-фактором ≥14000. Осветленный раствор Аrg-(В31)-инсулина собирают в реактор с рубашкой.

По окончании стадии трипсинолиза получают осветленный раствор, содержащий 1650 г Аrg-(В31)-инсулина (контроль по ВЭЖХ), который поступает на стадию хроматографической очистки.

6. Очистка Аrg-(В31)-инсулина на силикагеле С 8

Очистку Аrg-(В31)-инсулина проводят с использованием стальной колонны динамической аксиальной компрессии (DAC) с внутренним диаметром 450 мм и высотой 1000 мм. Рабочее давление колонны около 40 бар. Колонна упакована сферическим силикагелем, например Daisogel SP-120-20-C8-Bio или полимерным сорбентом, например Amberchrom ХТ-20. Объем сорбента составляет около 100 л.

Для проведения очистки используют буферные растворы следующих составов:

состав «А»: 15% 2-пропанола; 0,1% ТФУ;

состав «В»: 50% 2-пропанола, 0,05% ТФУ.

На проведение одной очистки используют часть осветленного раствора Аrg-(В31)-инсулина, содержащего от 800 до 850 г Аrg-(В31)-инсулина. Всего проводят две хроматографические очистки Аrg-(В31)-инсулина.

Полученный на предыдущей стадии трипсинолиза осветленный раствор Аrg-(В31)-инсулина с помощью установленного в жидкостном хроматографе насоса со скоростью потока 3,2 л/мин подают в хроматографическую колонну, которую затем промывают 300 л буферного раствора «А». Элюцию Arg-(B31)-инсулина осуществляют, используя бинарный линейный градиент по концентрации 2-пропанола от 15 до 25%, в течение 4 часов. Регенерацию сорбента осуществляют в обратном потоке буферным раствором «В». Уравновешивание сорбента осуществляют буферным раствором «А». Периодически, примерно один раз в 5-10 циклов очистки, сорбент в колонне дополнительно регенерируют 50 мМ раствором гидроксида натрия в 50%-ном 2-пропаноле в обратном потоке.

Элюат, содержащий Arg-(В31)-инсулин, в зависимости от получаемого объема делят на 10-15 фракций. Фракции с содержанием Аrg-(В31)-инсулина более 80% (контроль по ВЭЖХ анализу) объединяют в реакторе с мешалкой. После проведения двух очисток в объединенном элюате Аrg-(В31)-инсулина определяют содержание Аrg-(В31)-инсулина (1458 г по ВЭЖХ). Затем при перемешивании в элюат добавляют равный объем воды очищенной, кислоты лимонной до концентрации 50 мМ, фенола до концентрации 10 мМ, 10%-ного раствора хлорида цинка до концентрации 1,5 мМ. Введением 2М раствора гидроксида натрия устанавливают значение рН, равное 7,5-8,0, при котором состав выдерживают от 3 до 5 минут. Затем введением 2М раствора кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН 6,0-6,2 и продолжают перемешивание еще в течение 12 часов.

Полученные кристаллы Аrg-(В31)-инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на друк-фильтре при давлении не более 0,7 бар. Кристаллы на друк-фильтре промывают 0,9% раствором хлористого натрия и выгружают в технологическую емкость, выполненную из нержавеющей стали. Получают 1429 г Arg-(B31)-инсулина с чистотой 86%.

7. Ионообменная хроматографическая очистка (ИОХ) Arg-(B31)-инсулина

Для ионообменной хроматографической очистки Аrg-(В31)-инсулина используют стальную колонну динамической аксиальной компрессии (DAC) с внутренним диаметром 450 мм и высотой 1000 мм. Рабочее давление колонны около 20 бар. Колонна снабжена сферическим монодисперсным ионообменным сорбентом, например Source S15, объемом около 70 л. Рабочее давление колонны ≤20 бар.

Для проведения ионообменной хроматографической очистки используют буферные растворы следующих составов:

Состав буферных растворов:

«А»: 30% 2-пропанола, 10 мМ кислоты лимонной, рН 3,5;

«В»: 30% 2-пропанола, 10 мМ кислоты лимонной, 1,0 М NaCl, рН 3,5.

На выполнение одной очистки используют от 1400 до 1450 г Arg-(B31)-инсулина. Полученные на предыдущей стадии кристаллы Аrg-(В31)-инсулина суспендируют в 50 л 30% 2-пропанола, затем, не прекращая перемешивания, 2М раствора кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН 2,7-3,0. Перемешивание продолжают в течение 20 -30 минут до полного растворения Аrg-(В31)-инсулина. Полученный раствор Аrg-(В31)-инсулина последовательно фильтруют через глубинный фильтр с удерживающей способностью 0,5 мкм и мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм.

Осветленный раствор Аrg-(В31)-инсулина при помощи насоса жидкостного хроматографа со скоростью потока 3,2 л/мин подают на хроматографическую колонну, которую затем промывают 140 л буферного раствора «А». Элюцию Аrg-(В31)-инсулина осуществляют, используя бинарный линейный градиент по концентрации натрия хлорида от 10 до 300 мМ в течение 2,5 часов. Регенерацию сорбента осуществляют в обратном потоке буферным раствором «В». Уравновешивание сорбента осуществляют буферным раствором «А». Периодически, один раз в 5-10 циклов очистки, сорбент в колонне дополнительно регенерируют 0,5 М раствором гидроксида натрия.

Элюат делят на 10-15 фракций в зависимости от получаемого объема. Фракции с содержанием Аrg-В31)-инсулина более 90% (контроль по ВЭЖХ анализу) объединяют в реакторе с мешалкой и определяют содержание Arg-(В31)-инсулина (1330 г по ВЭЖХ). Затем при перемешивании в элюат добавляют 2 объема воды очищенной и проводят кристаллизацию Arg-(B31)-инсулина способом, описанным выше.

Получают 1302 г Arg-(B31)-инсулина с чистотой 97%.

8. Обработка Аrg-(В31)-инсулина карбоксипептидазой Б

Полученные на предыдущей стадии кристаллы Arg-(В31)-инсулина суспендируют в 200 л очищенной воды в реакторе, оснащенном водяной рубашкой и мешалкой. Затем при перемешивании добавлением 2 М раствора кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН в пределах от 2,7 до 3,0. Перемешивание продолжают в течение 30 минут до полного растворения Arg-(В31)-инсулина. Определяют концентрацию Аrg-(В31)-инсулина (1302 г по ВЭЖХ). Добавляют бензамидина гидрохлорид до концентрации 2 мМ, трис до концентрации 25 мМ и 2М раствором натрия гидроксида устанавливают значение рН 8,0-8,5. Полученный раствор Аrg-(В31)-инсулина охлаждают до температуры 10-12°С. Затем в реактор загружают карбоксипептидазу Б в количестве 43,4 мг (массовое соотношение 30000:1). Процесс ферментативной конверсии осуществляют при температуре 10-12°С в течение 18-20 часов до достижения максимальной концентрации инсулина (контроль по ВЭЖХ).

В полученном в результате ферментативной конверсии растворе инсулина 2 М раствором кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН от 3,0 до 3,5, продолжая поддерживать температуру в интервале от 10 до 15°С. В раствор инсулина при перемешивании добавляют кислоту лимонную до концентрации 50 мМ, 2-пропанол до концентрации 5% и 1,3 л 10%-ного раствора хлорида цинка.

Затем 2М раствором натрия гидроксида устанавливают значение рН 7,5-8,0 и выдерживают состав при этом значении рН от 3 до 5 минут, после чего 2М раствором кислоты хлористоводородной снижают значение рН до 6,2-6,3, продолжая перемешивание еще в течение 2 часов. Затем 2М раствором кислоты хлористоводородной доводят значение рН до 5,8-5,9 и продолжают перемешивание еще в течение 6 часов. Полученные кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на друк-фильтре, при этом давление составляет не более 0,7 бар. Кристаллы на друк-фильтре промывают 0,9%-ным раствором хлористого натрия и выгружают в технологическую емкость, выполненную из нержавеющей стали.

Получают 1237 г инсулина с чистотой 97%.

9. ВЭЖХ очистка инсулина

Для ВЭЖХ очистки инсулина используют стальную колонну динамической аксиальной компрессии (DAC) с внутренним диаметром 450 мм и высотой 1000 мм. Рабочее давление колонны составляет около 60 бар. Колонна упакована модифицированным сферическим силикагелем, например Daisogel SP-120-10-C8-Bio (около 70 л).

Состав используемых для очистки буферных растворов:

состав «А»: 10% 2-пропанола, 200 мМ ацетата аммония, 500 мМ кислоты уксусной;

состав «В»: 50% 2-пропанола, 100 мМ ацетата аммония, 250 мМ кислоты уксусной.

На одну очистку берут от 1200 до 1250 г инсулина. Полученные на предыдущей стадии кристаллы инсулина суспендируют в 50 л 10%-ного 2-пропанола, затем при перемешивании добавляют 0,75 л кислоты уксусной ледяной и 2М раствором кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН 3,0-3,5. Перемешивание продолжают в течение 20 - 30 минут до полного растворения инсулина. Полученный раствор инсулина последовательно фильтруют через глубинный фильтр с удерживающей способностью 0,5 мкм и мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. В полученном растворе инсулина определяют содержание инсулина (1237 г по ВЭЖХ).

Осветленный раствор инсулина при помощи насоса жидкостного хроматографа со скоростью потока 4,0 л/мин подают на хроматографическую колонну, которую затем промывают 140 л буферного раствора «А». Элюцию инсулина осуществляют, используя бинарный линейный градиент по концентрации 2-пропанола от 17 до 25% в течение 2,5 часов. Регенерацию сорбента осуществляют в обратном потоке буферным раствором «В». Уравновешивание сорбента осуществляют буферным раствором «А». Периодически (один раз в 15-20 циклов очистки) сорбент в колонне дополнительно регенерируют в обратном потоке 50 мМ раствором натрия гидроксида в 50%-ном 2-пропаноле.

Элюат, содержащий инсулин, делят на 10-15 фракций. Фракции с содержанием инсулина более 98% (контроль по ВЭЖХ анализу) объединяют в реакторе, снабженном мешалкой и водяной рубашкой. В полученном элюате инсулина определяют содержание инсулина (1175 г по ВЭЖХ). В элюат при перемешивании добавляют равное количество воды очищенной и 235 мл 10%-ного раствора хлорида цинка. 2М раствором натрия гидроксида доводят значение рН до 5,4-5,5. Температуру раствора снижают до 10-15°С и продолжают перемешивание еще в течение 10-12 часов. Полученные кристаллы высокоочищенного инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на друк-фильтре при давлении не более 0,7 бар. Кристаллы на друк-фильтре промывают 0,9%-ным раствором хлористого натрия, выгружают в технологическую емкость из нержавеющей стали.

Полученные кристаллы высокоочищенного инсулина через передаточное окно передают в помещение класса чистоты «D». Кристаллы высокоочищенного инсулина суспендируют в реакторе, оборудованном мешалкой, в 190 л охлажденной до температуры 10°С воды очищенной, затем 2М раствором кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН раствора от 3,0 до 3,5. Перемешивание продолжают в течение 20-30 минут до полного растворения инсулина. В полученный раствор инсулина добавляют кислоту лимонную до концентрации 25 мМ, 2-пропанол до концентрации 5% и 600 мл 10%-ного раствора цинка хлорида. Полученный раствор инсулина последовательно фильтруют через глубинный фильтр с удерживающей способностью 0,5 мкм и стерилизующий мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм.

Прием осветленного раствора инсулина осуществляют в подготовленный реактор, который находится в помещении класса чистоты «С». Температура в помещении поддерживается в пределах 10-15°С. 2М раствором натрия гидроксида устанавливают значение рН раствора, равное 7,5-8,0, и выдерживают состав при этом значении рН от 3 до 5 минут. Затем 2М раствором кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН 6,2-6,3 и продолжают перемешивание в течение 2 часов. Затем 2М раствором кислоты хлористоводородной устанавливают значение рН 5,8-5,9 и продолжают перемешивание еще в течение 6 часов.

Полученные кристаллы высокоочищенного инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на друк-фильтре (давление не более 0,7 бар). Кристаллы инсулина на друк-фильтре промывают расчетным количеством охлажденной до 10°С воды для инъекций и выгружают на противни лиофильной сушки. Зона загрузки-выгрузки лиофильной сушки находится под ламинаром в зоне класса чистоты «В». Процесс лиофильной сушки кристаллов высокоочищенного инсулина осуществляют в течение 14-16 часов в автоматическом режиме, при этом кристаллы замораживают до температуры -30°С (вакуум не менее 1 мбар), а затем температуру постепенно повышают до 15°С. Высушенные кристаллы высокоочищенного инсулина выгружают из лиофильной сушки в технологическую емкость из нержавеющей стали и взвешивают.

Получают 1211 г по технической массе субстанции инсулина (содержание инсулина 1151 г). Чистота полученного инсулина составляет 99,2%, биологическая активность 28,1 Е/мг.

Заявляемая группа изобретений позволяет упростить процесс промышленного получения рекомбинантного инсулина человека повышенной чистоты, а также повысить выход целевого продукта.