Вид РИД
Изобретение
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к медицине и, в частности, к традиционному китайскому лекарственному препарату для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний.
Предпосылки создания изобретения
Кардиоваскулярные и цереброваскулярные заболевания являются распространенными болезнями, которые причиняют большой вред здоровью людей. В последнее время такие болезни возникают все чаще вследствие изменения условий работы, жизни, питания, окружающей среды и т.п. с развитием общества. Традиционная китайская медицина (ТСМ), несмотря на низкую активность по отношению к одной мишени по сравнению с западной медициной, характеризуется множественными способами применения и мишенями, динамическим и холистическим лечением и незначительными побочными эффектами и значительно превосходит по действию западную медицину. Лекарственный препарат ТСМ с определенным терапевтическим действием обладает общим терапевтическим эффектом, превосходящим действие препаратов западной медицины. В настоящее время существует множество препаратов ТСМ для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний, таких как таблетки Danshen и препараты ТСМ на его основе, капли и пилюли на основе Guanxin Danshen, таблетки Xinkeshu и др. Эти препараты ТСМ, все содержащие Radix Salviae Miltiorrhizae (известный также как danshen) и Radix Notoginseng, обладают различными терапевтическими эффектами благодаря разным составам, соотношению ингредиентов, способам экстракции и очистки или дозированным формам. Кроме того, качество этих препаратов трудно контролировать, так как в настоящее время не существует эффективных качественных методов для полной характеристики физических и химических свойств этих препаратов, и сложные биологически активные ингредиенты в этих препаратах характеризуются только одним или двумя соединениями, такими как Danshensu или Tanshinone IIA (таншинон IIA). Следовательно, существует необходимость в усовершенствовании способа экстракции и очистки таких препаратов ТСМ, а также способа контроля их качества.
Сущность изобретения
Цель данного изобретения состоит в создании более эффективного препарата ТСМ для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний. Кроме того, предусмотрен способ, позволяющий довольно полно и точно определить физические и химические характеристики препарата.
Другая цель данного изобретения заключается в создании способа получения вышеуказанного препарата ТСМ.
Цели данного изобретения достигаются следующим образом.
Препарат ТСМ согласно данному изобретению может быть получен способом, включающим следующие стадии:
смешивание Radix Salviae Miltiorrhizae (шалфея многокорневищного) и Radix Notoginseng (женьшеня нотогинзенг) с гидроокисью натрия, бикарбонатом натрия, гидроокисью калия, бикарбонатом калия, карбонатом калия или их смесью в количестве 0,5 - 4% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ с получением смеси;
кипячение смеси в 3-6-кратном количестве воды 2-4 раза;
фильтрацию смеси и концентрирование объединенных фильтратов;
добавление этанола с высокой концентрацией (более 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70%;
отстаивание смеси и отделение надосадочной жидкости;
выделение этанола из надосадочной жидкости и концентрирование остатка до тех пор, пока его относительная плотность не станет равной 1,20-1,50 (55-60°С) с получением экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng;
смешивание полученного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie
Odori ferae (дальбергии пахучей); и
добавление одного или более фармакологических эксципиентов, таких как крахмал, декстрин, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропил-метилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, стеарат магния, микрогель силикона, ксилит, лактит, глюкоза, глицин, маннит, натриевая соль метилированного крахмала, сшитая натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сшитый поливинилпирролидон и т.д., и получение из этой смеси различных дозированных форм, таких как таблетки, полученные литьем под давлением, таблетки с пролонгированным действием, капельные пилюли, гранулы, порошок для инъекций, капсулы, микрогранулы, оральные дезинтегранты. Предпочтительно вышеуказанный препарат ТСМ получать способом, включающим следующие стадии:
взвешивание Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng;
добавление бикарбоната натрия в количестве 1,4-1,9% в расчете на общий вес лекарственных веществ с получением смеси;
кипячение смеси в 4-5-кратном количестве воды в течение 2-3 часов и затем в 3-4-кратном количестве воды в течение 1-2 часов;
фильтрацию смеси и концентрирование соединенных фильтратов до тех пор, пока не достигается величина удельного веса, равная 1,16-1,20 (80±5°С);
добавление этанола с высокой концентрацией (выше 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70% (20°С);
выдерживание смеси в течение 8-12 часов и отделение надосадочной жидкости;
выделение этанола из надосадочной жидкости и концентрирование остатка до получения величины относительной плотности, равной 1,32-1,40 (55-60°С) с образованием экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng;
смешивание указанного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie Odoriferae; и
добавление одного или более фармакологических эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из крахмала, декстрина, лактозы, микрокристаллической целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, стеарата магния, микрогеля силикона, ксилита, лактита, глюкозы, глицина, маннита, натриевой соли метилированного крахмала, сшитой натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, сшитого поливинилпирролидона и т.д., и получения из этой смеси таблеток, пилюль, порошка для инъекций, капсул, гранул, микрогранул или оральных дезинтегрантов.
Используемый борнеол может быть природным или синтетическим. Масло Lignum Dalbergie Odoriferae, используемое в данном изобретении, получают перегонкой Lignum Dalbergie Odoriferae.
Вышеуказанный препарат ТСМ, предпочтительно, получают в виде дозированной формы пилюль.
Препарат ТСМ по настоящему изобретению характеризуется следующими физическими и химическими параметрами:
на хроматограмме (ЖХВР) имеются 8 пиков, для которых характерно отношение площади единичного пика к общей площади пиков, превышающее 2%; среднее время удерживания для этих 8 пиков равно 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02 соответственно, и RSD% (стандартное отклонение времени удерживания) составляет 0,31, 0,25, 0,61, 0,70, 0,96, 0,76, 0,50 и 1,18 соответственно; средняя величина площади пиков равна 1627,92, 2575,54, 366,89, 381,40, 186,08, 555,35, 281,91 и 1852,33 соответственно; и RSD% от величины площади пиков равно 5,91, 13,59, 10,92, 13,81, 12,04, 10,48, 18,08 и 14,84 соответственно; и отношение площади каждого единичного пика к общей площади пиков составляет 19,6-22,0%, 28,5-37,4%, 4,2-5,2%, 4,2-5,5%, 2,1-2,7%, 6,4-7,8%, 3,0-4,3% и 20,2-27,2% соответственно.
Указанные физические и химические параметры получали при следующих условиях.
(1) Жидкостная хроматография высокого разрешения
Как наполнитель для хроматографической колонки применяли октадецилсилил-силикагель, скорость истечения составляла 1,000 мл/мин при длине волны 280 нм. Элюирование осуществляли при следующих условиях: мобильной фазой А являлся 0,02% водный раствор фосфорной кислоты, мобильной фазой В - 80% ацетонитрила - 0,02% водный раствор фосфорной кислоты; мобильная фаза А менялась равномерно от 90 до 78% и мобильная фаза В менялась равномерно от 10 до 22% в течение 0-8 мин; мобильная фаза А менялась от 78 до 74%, а мобильная фаза В - от 22 до 26% в течение 8-15 мин; мобильная фаза А менялась от 74 до 48% и мобильная фаза В - от 26 до 52% в течение 15-55 мин.
(2) Приготовление и анализ образца раствора
Точно взвешивали 10 пилюль препарата ТСМ по изобретению, затем помещали их в сосуд объемом 10 мл. Добавляли дистиллированную воду в количестве, достаточном для растворения пилюль при встряхивании и действии ультразвука в течение 15 мин. Затем для достижения объема, равного 10 мл, добавляли снова дистиллированную воду. Полученный раствор центрифугировали или фильтровали для получения образца раствора. 10 мкл образца раствора впрыскивали в колонку для ЖХВР и затем осуществляли ЖХВР для получения спектров ЖХВР. При помощи сравнения со стандартным образцом и масс-спектрами были идентифицированы вышеописанные 8 пиков со средним временем удерживания 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02, которые соответствуют Danshensu, протокатехиальдегиду, изолитоспермовой кислоте А, изолитоспермовой кислоте В, сальвианоловой кислоте D, розмариновой кислоте, сальвианоловой кислоте В и сальвианоловой кислоте А соответственно (см. Фиг.1).
При помощи метода ЖХВР-МС был определен состав препарата ТСМ согласно изобретению, он содержит Danshensu, протокатехиальдегид, изолитоспермовую кислоту А, изолитоспермовую кислоту В, сальвианоловую кислоту D, сальвианоловую кислоту Е, розмариновую кислоту, сальвианоловую кислоту В, сальвианоловую кислоту G, сальвианоловую кислоту А, таншинон I, таншинон II, нотогинсенозид R1, гинсенозид Re, гинсенозид Rg 1, гинсенозид Rb 1, нотогинсенозид R2, нотогинсенозид R2-изо, гинсенозид Rg 2, гинсенозид Rh 1, гинсенозид Rh1-изо, гинсенозид Rd, гинсенозид Rd-изо, гинсенозид Rf-H-20, нотогинсенозид R2-H20, гинсенозид Rg6 или F4, гинсенозид Rk3, гинсенозид (Rh4), гинсенозид 20(R)-Rg3, гинсенозид 20(S)-Rg3, гинсенозид (Rk1), гинсенозид (Rg5) и т.п.
|
|
|
В процессе экстракции и при проведении анализа согласно изобретению для полной характеристики физических и химических свойств Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng в препарате ТСМ применяли атлас фингерпринтинга. По сравнению с уровнем техники, когда сложные биологически активные ингредиенты в препаратах ТСМ характеризуются только одним или двумя соединениями, данный метод подходит гораздо больше для контроля качества препаратов ТСМ.
Биологически активные ингредиенты в препаратах ТСМ по изобретению обнаруживали методом ЖХВР-МС. В результате всего были идентифицированы 12 компонентов в Radix Salviae Miltiorrhizae и 21 компонент в Radix Notoginseng. Соединения были идентифицированы, в основном, анализом данных МСn при сравнении этих данных с литературными. Наконец, структура большого количества компонентов была полностью подтверждена путем сравнения с контрольными образцами. При этом можно сделать вывод, что метод анализа химического состава препарата ТСМ по изобретению с применением ЖХВР-МС дает возможность получить обширную информацию о структуре биологически активных ингредиентов. Характеристика физических и химических свойств Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng в препарате ТСМ по изобретению с использованием этой информации является гораздо более полной, чем с помощью известных методов.
Следующие опыты показывают, что препарат ТСМ по изобретению является эффективным для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний.
1. Действие препарата ТСМ на ишемию миокарда и инфаркт миокарда у анестезированной собаки.
Для характеристики ишемии миокарда и степени ее развития применяли эпикардиальную электрограмму. Для определения области инфаркта миокарда использовали количественную гистологию (метод N-BT окраски). Определялись также изменения в протекании крови в коронарной артерии, поглощение кислорода миокардом и активности СК и LDH в сыворотке и ЕТ, ТХВ2 и 6-кето-PGF1a в плазме крови. Действие препарата ТСМ по изобретению изучали при его алиментарном введении в отношении его действия на ишемию миокарда, инфаркт миокарда и связанные с этим показатели у испытуемых собак.
Результаты испытаний показывают, что препарат ТСМ по изобретению оказывает значительное действие на ослабление острой ишемии миокарда и инфаркта миокарда у собак. Это может привести к уменьшению ишемии (Σ-ST), показанному на эпикардиальной электрограмме (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор), к значительному уменьшению области инфаркта, о чем свидетельствует метод N-ST окраски (Р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор) и значительному повышению потока крови в коронарной артерии в ишемическом сердце (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор). Препарат ингибирует высвобождение сывороточной лактат-дегидрогеназы (LDH), возникающее вследствие ишемической болезни и инфаркта миокарда (величина относительного изменения отношения значительно ниже соответствующей величины у контрольной группы, получавшей физиологический раствор Р<0,001), а также увеличение активности креатин-фосфокиназы (СК) (величина относительного изменения отношения значительно ниже соответствующей величины у контрольной группы, получавшей физиологический раствор Р<0,05). Препарат действует также на величину ЕТ в плазме крови, снижая ее (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор), и уровень TXB2 (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор, Р<0,05 у группы, получавшей препарат ТСМ) в плазме крови и улучшает отношение 6-кето-PGF1a/ТХВ2 (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор, Р<0,05 у группы, получавшей препарат ТСМ).
2. Действие препарата ТСМ на инфаркт миокарда, вызванный ишемической реперфузией.
При наблюдении за моделью крысы с повреждением миокарда, вызванным реперфузией, было установлено, что препарат ТСМ по изобретению может значительно уменьшить поражение миокарда, величину области инфаркта миокарда (р<0,05-0,01 относительно модельной группы) и привести к меньшему весу области, пораженной инфарктом (р<0,05 относительно модельной группы). Препарат также значительно повышал активность супероксида дисмутазы (SOD) (р<0,01 относительно модельной группы).
3. Действие препарата ТСМ на динамику течения потока крови и поглощения кислорода миокардом у собак.
Препарат ТСМ по изобретению оценивали в отношении его действия на динамику течения крови в сердце и поглощение кислорода миокардом у анестезированных собак.
Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению может привести к значительно ускоренному протеканию крови в коронарной артерии (р<0,01-0,001 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор), расширенному коронарному сосуду, повышенному содержанию кислорода в коронарном венечном синусе (р<0,05-0,001 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор), уменьшенной величине индикатора поглощения кислорода миокардом, увеличению снабжения сердечной мышцы кровью и кислородом и к увеличенным объему на сердечное сокращение и минутному сердечному выбросу (р<0,05-0,01 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор) без ускорения работы левого желудочка.
Препарат ТСМ по изобретению регулирует работу сердца и, таким образом, способствует адаптации и улучшению функционирования сердечно-сосудистой системы.
4. Действие препарата ТСМ на агглютинацию тромбоцитов у кроликов.
Препарат ТСМ по изобретению оценивали при помощи нефелометрии Борна в отношении его действия на агглютинацию тромбоцитов у кроликов.
Результаты показывают, что препарат ТСМ при его внутрижелудочном введении в течение 7 последовательных дней приводит к значительному уменьшению агглютинации тромбоцитов у кроликов, вызванной арахидоновой кислотой (АА) (р<0,05-0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду) и коллагеном (р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду). Это показывает, что препарат ТСМ по изобретению обладает ингибирующим действием на агглютинацию тромбоцитов.
5. Влияние препарата ТСМ на тромбогенез in vitro и вязкость крови у крыс.
Препарат ТСМ по изобретению оценивали в отношении его действия на тромбогенез in vitro и вязкость крови у крыс.
Результаты показывают, что препарат ТСМ при внутрижелудочном введении в течение 7 последовательных дней приводит к значительно меньшему тромбу (р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду), снижению мокрого и сухого веса тромба (р<0,05 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду), к пониженной вязкости плазмы крови (р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду) и пониженной вязкости всей крови при различных скоростях сдвига (р<0,05 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду). Это показывает, что препарат ТСМ по изобретению способен ингибировать тромбогенез и снижает вязкость плазмы крови и всей крови.
6. Действие препарата ТСМ на гиперлипидемию и атеросклероз у кроликов.
Модель для изучения гиперлипидемии и атеросклероза (AS) была получена при питании кролика кормом с высоким содержанием холестерина. Препарат ТСМ по изобретению оценивали по его действию на эту модель.
Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению приводит к значительно пониженным концентрациям ТС, TG, LDL-C, VLDL-C в сыворотке и к пониженному отношению TC/HDL-C (р<0,05-0,001 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии) у кроликов, к значительно увеличившейся концентрации HDL-C (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии), к уменьшенному содержанию ТС в аорте (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии), к уменьшенному содержанию TG в печени (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии) и к уменьшенному содержанию MDA в печени (р<0,001 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии). Препарат ТСМ по изобретению значительно превышает активность SOD в печени (р<0,01 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии).
Кроме того, он значительно уменьшает толщину тромбоцитов аорты и количество вспененных клеток, образовавшихся в аорте (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии). Он также приводит к уменьшению площади тромбоцитов в аорте. Это свидетельствует о том, что препарат ТСМ по изобретению регулирует содержание жира в крови и в то же самое время оказывает определенное действие на антиперокисление липида и предотвращение артериосклероза.
7. Действие препарата ТСМ на локализованную церебральную ишемию у крыс.
Оценивали препарат ТСМ по изобретению в отношении его действия на величину площади церебрального инфаркта у крыс МСАТ с применением модели крысы с умеренным тромбозом церебральной артерии (МСАТ).
Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению действует на антицеребральную ишемию.
Краткое описание фигур
На Фиг.1 представлен атлас отпечатков компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в пилюлях, являющихся одной из дозированных форм препарата ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует Danshensu; пик 2 представляет протокахиальдегид, пик 3 представляет изолитоспермовую кислоту А, пик 4 соответствует изолитоспермовой кислоте В, пик 5 соответствует сальвианоловой кислоте D, пик 6 соответствует розмариновой кислоте, пик 7 представляет сальвианоловую кислоту В и пик 8 соответствует сальвианоловой кислоте А.
На Фиг.2 показан ЖХВР спектр водорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует Danshensu; пик 2 представляет протокахиальдегид, пик 3 представляет изолитоспермовую кислоту А, пик 4 соответствует изолитоспермовой кислоте В, пик 5 соответствует сальвианоловой кислоте D, пик 6 соответствует сальвианоловой кислоте Е, пик 7 представляет розмариновую кислоту, пик 8 соответствует сальвианоловой кислоте В, пик 9 соответствует сальвианоловой кислоте G и пик 10 соответствует сальвианоловой кислоте А.
На Фиг.3 представлен MS-TIC-спектр водорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению.
На Фиг.4 представлен ЖХВР спектр липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует ташинону I, а пик 2 соответствует ташинону IIA.
На Фиг.5 представлен MS-TIC-спектр липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению.
На Фиг.6 представлен MS-TIC-спектр компонентов и Radix Notoginseng по изобретению.
Подробное описание вариантов изобретения
Данное изобретение далее будет подробно описано со ссылкой на нижеследующие примеры. Эти примеры служат для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.
Примеры
Пример 1 (препаративный пример)
41,06 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 8,03 г Radix Notoginseng взвешивали, к этой смеси добавляли бикарбонат натрия в количестве 1,8% от общего веса указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 95%-ный этанол в количестве, достаточном до получения содержания этанола, равного 65% (20°С). Затем смесь выдерживали 12 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол выделяли из надосадочной жидкости, а остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,37 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Этот экстракт равномерно смешивали с 0,46 г борнеола и 18 г полиэтиленгликоля-6000. Смесь расплавляли при температуре 85°С в течение 80 мин. Затем расплавленную жидкость вводили в приемник машины для изготовления капельных пилюль, причем температура в приемнике поддерживалась равной 86°С, в машине жидкость капала в жидкий парафин при 8°С. Полученные «капельные пилюли» вынимали, удаляли с них масло и затем просеивали через сито с получением желаемого препарата.
Пример 2 (препаративный пример)
59,36 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 6,38 г Radix Notoginseng взвешивали, к этой смеси добавляли бикарбонат калия в количестве 1,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2,5 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 85%-ный этанол в количестве, обеспечивающем содержание этанола, равное 70% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол выделяли из надосадочной жидкости, а остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Этот экстракт равномерно смешивали с 0,34 г борнеола и 23 г полиэтиленгликоля-6000. Полученную смесь расплавляли при температуре 89°С в течение 100 мин. Затем расплав вводили в приемник машины для изготовления капельных пилюль, причем в приемнике поддерживали температуру, равную 85°С, жидкость капала в метилсиликоновое масло с температурой 8°С. Полученные «капельные пилюли» вынимали, удаляли с них масло и затем просеивали через сито с получением желаемого препарата.
Пример 3 (препаративный пример)
Взвешивали 12,6 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 56,15 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат калия в количестве 1,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2,5 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 95%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 70% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Этот экстракт равномерно смешивали с 0,34 г борнеола и 23 г полиэтиленгликоля-6000. Полученную смесь расплавляли при температуре 89°С в течение 100 мин. Затем расплав вводили в приемник машины для изготовления капельных пилюль, причем в приемнике поддерживали температуру, равную 85°С, жидкость капала в метилсиликоновое масло с температурой 8°С. Полученные «капельные пилюли» вынимали, удаляли с них масло и затем просеивали через сито с получением желаемого препарата.
Пример 4 (препаративный пример)
Взвешивали 31,12 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 9,21 г Radix Notoginseng, добавляли гидроокись натрия в количестве 0,5% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 1,5 ч и затем в 3- кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Этот экстракт равномерно смешивали с 0,50 г борнеола, 90 г маннита, 15 г кальцийэдетата натрия и 15 мл дистиллированной воды. Полученную смесь подвергали лиофилизации и получали из нее порошок для инъекции.
Пример 5 (препаративный пример)
Взвешивали 116,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 58,21 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и надосадочную жидкость отделяли. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Полученный экстракт равномерно смешивали с 1,80 г масла Lignum Dalbergie Odoriferae и 40 г микрокристаллической целлюлозы. Для умягчения массы добавляли 3%-ный раствор повидона в этаноле. Полученную массу продавливали через сито 18 меш с получением гранул. Гранулы сушили при температуре 60°С в течение 35 минут, удаляли заусенцы и затем равномерно смешивали с 4 г порошкообразного талька. Полученную смесь инкапсулировали с получением желаемого препарата.
Пример 6 (препаративный пример)
Взвешивали 116,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 58,21 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до достижения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости, остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Полученный экстракт равномерно смешивали с 0,90 г борнеола, 120 г микрокристаллической целлюлозы, 40 г гидроксипропилметилцеллюлозы, 5 г ксилита и 2 г стеарата магния. Полученную смесь прессовали с получением таблеток желаемого препарата.
Пример 7 (препаративный пример)
Взвешивали 140,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 36,42 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,5% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до достижения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 90%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65% (20°С). Затем смесь выдерживали в течение 8 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости, остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.
Этот экстракт равномерно смешивали с 1,00 г борнеола и 46 г микрокристаллической целлюлозы. Для умягчения массы добавляли 3%-ный раствор повидона в этаноле. Полученную массу продавливали через сито 18 меш с получением гранул. Гранулы сушили при температуре 60°С в течение 30 минут, удаляли заусенцы и затем равномерно смешивали с 4 г порошкообразного талька. Полученную смесь прессовали с получением таблеток желаемого препарата.
Пример 8 (пример обнаружения активного компонента)
1. Приготовление образца
(1) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению
Взвешивали по 148,4 мг капельных пилюль ТСМ из Примеров 1, 2, 3, порошков ТСМ для инъекции из Примера 4, капсул ТСМ из Примера 5, оральных распадающихся таблеток ТСМ из Примера 7. Эти навески растворяли в 6 мл воды в течение 15 мин при воздействии ультразвука и затем фильтровали через найлоновую пленку толщиной 0,45 мкм с получением образцов раствора желтого цвета.
(2) Компоненты Radix Notoginseng и липорастворимые компоненты в Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению
Взвешивали по 1003,8 мг капельных пилюль ТСМ из Примеров 1, 2, 3, порошков ТСМ для инъекции из Примера 4, капсул ТСМ из Примера 5, оральных распадающихся таблеток ТСМ из Примера 7. Эти препараты растворяли в 10 мл 4%-ного водного раствора аммиака в течение 15 мин при воздействии ультразвука и затем фильтровали через найлоновую пленку толщиной 0,45 мкм. Фильтраты подвергали предварительной обработка на колонке Extract-Clean C18 (Alltech Associates, Inc., US). Образцы после загрузки в колонку промывали 10 мл воды и затем элюировали 2 мл метанола с получением испытуемого образца в виде элюента желтого цвета.
2. Анализ образца
(1) Приборы и агенты
Хроматограф для жидкостной хроматографии Agilent Series-1100 (Agilent); Детектор G 1315А Diode Array; Автоматический инжектор образцов G 1313А; Термостат G 1316A; Диаэратор и сдвоенный насос G 1322A; Рабочая хроматографическая установка HP Instrument.
Масс-спектрограф Type G2445A Series 1100 LC-MSD/Trap (Bruker); ионизацию осуществляли методом электронапыления; колонка Extract-Clean C18 (100 мг/мл, Alltech Associates, Inc., US); ацетонитрил был хроматографически чистым (TEDIA), вода была подвергнута перегонке дважды, уксусная кислота была аналитически чистой.
(2) Условия обнаружения
Для проведения ЖХВР использовали хроматографическую колонку Agilent Zorbax SB-C18 (5 мкм, 4,6 мм × 25 см, Agilent, SN: USCL 009296). Градиентное элюирование и масс-спектральное определение каждого образца проводили при следующих условиях:
(а) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ из каждого примера.
Условия элюирования в ходе ЖХВР:
|
Условия проведения МС (MS):
|
(б) Компоненты Radix Notoginseng в препарате ТСМ в каждом примере.
Условия элюирования при ЖХВР:
|
Условия проведения МС:
|
3. Анализ результатов и идентификация пиков
Компоненты были идентифицированы по двум аспектам: (1) используя контрольные образцы; (2) используя абсорбцию УФ и информацию об ионном фрагменте на основе данных МСn (MSn) в комбинации с литературными данными.
4. Результаты идентификации
(1) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате Radix Salviae Miltiorrhizae no каждому примеру согласно данному изобретению (см. Таблицы 1 и 2 и Фигуры 2 и 3).
|
|
Из результатов MSn видно, что второй и третий пики имеют очень сходные структуры литоспермовой кислоты. Однако в случае УФ-абсорбции эти пики значительно отличаются от литоспермовой кислоты. Литоспермовая кислота характеризуется сравнительно большой абсорбцией при длине волны примерно 253 нм благодаря фенилкумарановой цепочке, а второй и третий пики не обладают этим свойством. Оба эти пика имеют УФ-абсорбцию, очень похожую на абсорбцию сальвианоловой кислоты Е, что свидетельствует о том, что два соединения, соответствующие этим двум пикам, вероятно, имеют ту же основную цепь, что и Сальвианоловая кислота Е, а именно карбоксилдифенилэтиленовую основную цепь. Поэтому можно сделать вывод, что они имеют структуры, такие как структура изолитоспермовых кислот А и В, показанные на вышеуказанных структурных формулах для компонентов. Эти две структуры не были никогда описаны и поэтому здесь называются изолитоспермовыми кислотами А и В.
(2) Липорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению (см. Таблицу 3 и Фигуры 4 и 5).
|
(3) Компоненты Radix Notoginseng в Radix Salviae Miltiorrhizae капельных пилюлях по настоящему изобретению (см. Таблицы 4 и 5 и Фигуру 6).
|
|
На основе вышеописанного исследования были разработаны способ экстракции и способ анализа препарата ТСМ по изобретению, которые включают:
(1) твердофазный способ экстракции липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae и компонентов Notoginsenoside (нотогинсенозида) из капельных пилюлей на основе Radix Salviae Miltiorrhizae;
(2) способ ЖХВР-МС анализа для каждого образца.
В целом были идентифицированы 12 компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae и 21 сапониновый компонент Radix Notoginseng. Среди них при сравнении с контрольными образцами были идентифицированы 4 водорастворимых компонента Radix Salviae Miltiorrhizae, 2 липорастворимых компонента Radix Salviae Miltiorrhizae и 9 компонентов сапонина, а другие соединения, в основном, были идентифицированы на основе данных MS- и сравнения с литературными данными.
Пример 9 (Пример детекции атласа отпечатков для компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ)
1. Приборы и агенты
Приборы: Хроматограф для жидкостной хроматографии Agilent 1100, содержащий четырехканальный насос, деаэрирующий систему on-line, автоматический инжектор образцов, детектор DAD, регулятор температуры колонки, рабочую станцию Chemstation; электронный баланс (1/10-4 г) BS 210S (Beijing Sartorius Company), электронный баланс (1/10-4 г или 1/10-5 г) АЕ240 (Mettler-Toledo Corporation, Shanghai), центрифуга LD4-2 (4000 об/мин) (Beijing Medical Centrifuge Factory), водяная баня с цифровым термостатом (Tianging Changfeng Corporation), роторный испаритель RE-52AA (Shanghai Yarong Biochemical Instrumentation Factory), вакуумный насос с циркулирующей водой SHE-(III) (Gongyi Yingyuyuhua Instrumentation Factory), ультразвуковой очиститель KQ-250B (Kunshan Ultrasonic Instrumentation Corporation), фильтр HENGAO Tand D (HENGAO Tand D), мембранный фильтр на основе синтетического волокна (отверстия 0,45 мкм) (Shanghai Xingya Purifying Materials Factory).
Агенты: ацетонитрил (хроматографически чистый, Merck Company, US), фосфорная кислота (высшего качества), чистая вода Wahaha.
2. Получение испытуемого образца
10 пилюль препарата ТСМ из каждой партии в Примере 1 взвешивали и затем помещали в измерительную колбу объемом 10 мл. Добавляли дистиллированную воду в количестве, достаточном для растворения пилюлей при встряхивании при воздействии ультразвука в течение 15 минут. Затем снова добавляли дистиллированную воду до достижения объема, равного 10 мл. Полученный раствор центрифугировали или фильтровали с получением образца раствора.
3. Условия проведения ЖХВР
Хроматографическая колонка Agilent ZoRBAx SB-C18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм; мобильная фаза: мобильная фаза А: 0,02% водный раствор фосфорной кислоты; мобильная фаза В: 80% ацетонитрила - 0,02% водного раствора фосфорной кислоты; скорость истечения: 1,000 мл/мин; длина волны детекции 280 нм; температура в колонке: 30°С; объем введенного образца: 10 мкл.
|
4. Результаты детекции (см. Таблицу 7)
|
В Таблице 7 показаны относительные положения и величины площадей (время удерживания и площадь пика) 8-ми пиков, причем для 3-х пиков отношение площади отдельного пика к общей площади пиков составляет более 10% и для всех 8-ми пиков отношение площади отдельного пика к общей площади пиков больше 2%.