Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциальной диагностики грибовидного микоза

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может найти свое применение в медицинских целях для дифференциальной диагностики грибовидного микоза (Т-клеточная лимфома кожи) и хронических доброкачественных заболеваний кожи.

Известен способ диагностики грибовидного микоза с применением гистологического исследования, когда путем компьютерной морфометрии ядер лимфоцитов дермы в гистологическом срезе кожи из очага поражения проводят определение планиметрических характеристик ядер лимфоцитов. Дополнительно определяют удельную плотность ядер лимфоцитов на единицу площади имиджа среза, периметр и усредненный диаметр ядра, фактор формы (Патент на изобретение РФ №2466398, G01N 33/48, опубл. 10.11.2012).

Недостатком метода является то, что изменения характеристик лимфоцитов происходит при прогрессировании заболевания и не позволяет диагностировать болезнь на ее начальном этапе. Кроме того, рекомендуемые для анализа программы не являются рутинными, что не обеспечивает повсеместное их применение для анализа гистологических срезов. Также стоит учесть, что гистологическая картина может быть весьма вариабельной в зависимости от клинических проявлений и стадии заболевании, и диагностическое значение приведенных выше критериев не одинаково, не всегда является достоверным.

Известен способ диагностики грибовидного микоза с применением гистологического исследования путем проведения морфометрии базальных кератиноцитов, измеряя их площадь и ядерно-цитоплазматическое соотношение. При увеличении площади базальных кератиноцитов в 1,5 и более раза по сравнению с нормальной кожей, ядерно-цитоплазматического соотношения базальных кератиноцитов в 2 и более раза по сравнению с нормальной кожей диагностируют лимфомы кожи, а при неизмененных морфометрических показателях базальных кератиноцитов - псевдолимфомы кожи (Патент на изобретение РФ №2476879, G01N 33/48, G01N 33/53, G01N 33/483, опубл. 27.02.2013).

Недостатком методов является их низкая чувствительность, невозможность дифференциальной диагностики начальной стадии заболевания, когда наиболее важно установить диагноз, а также трудности диагностики при развитии различных (неклассических) форм болезни. Также не уточнено, сколько базальных кератиноцитов необходимо обследовать для установления значимости данного диагностического фактора.

В основу изобретения положена задача создания способа дифференциальной диагностики грибовидного микоза с целью установления значимых дифференциально-диагностических маркеров, на основании детекции которых удастся производить оперативную диагностику наиболее часто встречающегося вида лимфомы кожи - грибовидного микоза. Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе дифференциальной диагностики грибовидного микоза, включающем анализ взятого у больного биологического материала из очага поражения и проведения иммуногистохимического исследования биоптатов, определяют относительную площадь экспрессии CD83+- и Langerin (CD207)+-дендритных клеток, при этом при определении относительной площади экспрессии Langerin-позитивных дендритных клеток ≥0,9% и относительной площади экспрессии CD83-позитивных дендритных клеток ≥0,5% диагностируют грибовидный микоз, а при значениях ниже указанных устанавливают диагноз хронического доброкачественного заболевания.

Технический результат заключается в повышении достоверности, эффективности, экономичности и воспроизводимости.

Анализ микроокружения малигнизированных лимфоцитов проводят путем детекции CD83+- и Langerin (CD207)+-дендритных клеток в ходе иммуногистохимического исследования у больных грибовидным микозом и пациентов с хроническим доброкачественным заболеванием кожи на примере мелкобляшечного парапсориаза.

Изобретение осуществляется следующим образом.

1. Предварительно подготавливают образцы кожи, которые вырезают так, чтобы в микроскопическом срезе сохранялись топографические соотношения, характерные для исследуемого материала. Блоки для проводки вырезают после фиксации.

2. Биоптат кожи помещают в емкость с фиксатором, объем фиксирующей жидкости превышал в 10-20 раз объем фиксируемого объекта. Если объект был разрезан на фрагменты толщиной более 5-6 мм, его оставляли в фиксаторе на 2-3 часа для уплотнения, после чего ткань рассекают на пластины толщиной 2-3 мм и помещают в свежий раствор фиксатора. Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20°С) составляет от 18 до 24 часов. В повседневной работе в качестве фиксирующей жидкости использовали 10% раствор формалина или цинк-формалин, который обеспечивает сохранение антигенных детерминант для проведения иммуногистохимических исследований.

3. Обезвоживание и пропитывание парафином биоптатов кожи проводят вручную по восходящим спиртам (70%, 80%, 90% и 100%) в аппарате гистологической проводки тканей «Leica Peloris» («Leica Microsystems», Германия), заливают в парафин.

4. Срезы приготовливают толщиной 3-4 мкм. Используют микротом ротационный Accu-Cut®SRM™200.

5. После этого приступают непрямому иммуногистохимическому исследованию. Для этого срезы наклеивали на стекла, обработанные полилизином, распарафинивают, блокируют эндогенную пероксидазу раствором перекиси водорода в метаноле и выполняют демаскировку антигенов путем нагревания в трис-ЭДТА или цитратном буфере в течение 30 мин при температуре 95°С на водяной бане. Для иммуногистохимической детекции субпопуляций лимфоцитов, дендритных клеток и пролиферативной активности клеток используют первичные мышиные и кроличьи моноклональные античеловеческие антитела (Таблица 1). Время инкубации с первичными антителами составляет 18-20 часов при t°=+40°С.

Для детекции клеток используют полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена применяют диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция). Инкубацию проводят с системой визуализации - 30 мин. при температуре +20°С. для проявления результата реакции ДАБ наносият на срезы на 5 мин.

Выполняют определение количества окрашенных цветовой меткой (позитивных) клеток при 200-кратном увеличении светового микроскопа в трех полях зрения (размерами 7204530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых клеток, программное обеспечение «Морфология 5.2» (ВидеоТесТ, Россия). Определяют относительную площадь экспрессии, которую рассчитывают как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками к общей площади клеток в поле зрения, и выражают в процентах.

При выявлении относительной площади экспрессии Langerin-позитивных дендритных клеток ≥0,9%, и CD83-позитивных дендритных клеток ≥0,5% определяется высокая диагностическая информативность данных маркеров при установлении диагноза грибовидного микоза (SE 0,87, SP 0,90) и (SE 0,71, SE 0,71) соответственно, что может успешно использоваться в дифференциальной диагностике с хроническими доброкачественными заболеваниями кожи.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.

Пример 1.

Больной Иванов И.И., 69 лет, поступила в клинику для уточнения диагноза. Болен в течение 5 лет, когда появились зудящие пятна на коже верхних конечностей и на коже живота. На основании клинической картины врач заподозрил грибовидный микоз. Результаты проведенного гистологического исследования не позволяют исключить начинающуюся лимфому кожи. Проведено иммуногистохимическое исследование с определением относительной площади экспрессии Langerin+- и CD83+-дендритных клеток пораженной кожи.

Результаты: Относительная площадь экспрессии Langerin+-дендритных клеток 2.5%, CD83+-дендритных клеток 1.5%. На основании результатов ИГХ установлен диагноз: пятнистая стадия ГМ (Ib). Начата специфическая терапия. Диагноз подтвердился гистологически при повторной биопсии.

Пример 2.

Больная Петрова А.А., 45 лет, поступила в клинику для уточнения диагноза. Больна в течение 2-месяцев, когда впервые стала отмечать появление отечных зудящих пятен на коже лица, верхних конечностей, туловища. Лечилась самостоятельно топическими ГКС с нестойким эффектом. На основании клиническое картины дерматолог на приеме заподозрил проявления грибовидного микоза. Результаты гистологического исследования не позволяют однозначно отвергнуть диагноз начинающейся лимфомы кожи. Проведено иммуногистохимическое исследование с определением относительной площади экспрессии Langerin+- и CD83+-дендритных клеток пораженной кожи.

Результаты: Относительная площадь экспрессии Langerin+-дендритных клеток 0.5%, CD83+-дендритных клеток 0.2%. На основании полученных сведений установлен диагноз Микробная экзема, торпидное течение. Назначена системная десенсибилизирующая терапия, топические ГКС, антигистаминные средства, проведена санация очагов хронических инфекций. Клинические проявления полностью нивелировались.

Из анализа научно-технической и патентной литературы не обнаружено сведений о возможности проведения дифференциальной диагностики на основании определения и сопоставления относительной площади экспрессии CD83+- и Langerin (CD207)+-дендритных клеток в ходе анализа пораженной кожи у больных грибовидным микозом и хроническими доброкачественными дерматозами путем автоматического анализа в программном обеспечении, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».