СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННОГО ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к способу получения активированного полиэтиленоксида, который применяется в качестве носителя и модификатора в различных методиках пегилирования природных и синтетических биологически-активных веществ и фармакологических субстанций.

Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является химическая модификация их молекулы, состоящая не в собственно изменении их структуры, а в физико-химической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы с полиэтиленгликолем (ПЭГ, синоним - полиэтиленоксид). Данный процесс соединения нативной молекулы лекарственного препарата с ПЭГ получил название "пегилирование". Подобная химическая модификация фармакологических препаратов пептидной структуры адресно направлена на улучшение их переносимости, повышение биодоступности, снижение иммуногенности, повышение периода их полужизни и стабильности.

ПЭГ в качестве потенциального объекта-модификатора веществ пептидной структуры привлек внимание исследователей еще в начале 1970-х годов. В настоящее время ПЭГ одобрен Обществом по питанию и лекарственным препаратам США (FDA) в качестве субстанции, разрешенной к использованию в медицине (производство лекарственных препаратов), продуктах питания и косметологии. Молекулы ПЭГ - это водорастворимые полимеры окиси этилена с двумя терминальными гидроксильными группами, они (молекулы) могут иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру. Молекулярный вес молекул ПЭГ может колебаться в пределах 300-40000 Дальтон, а выстроенные в цепи макромолекулы ПЭГ могут формировать как разветвленную, так и линейную стереохимию. В настоящее время имеется достаточно большое число лекарственных препаратов, представляющих собой пегилированные биологически-активные пептиды. В частности, с помощью пегилирования модифицированы многие лекарственные препараты, например: L - аспарагиназа, адено-зиндеаминаза, супероксиддисмутаза, интерферон - альфа2b, sTNF - RI, липосомальный доксорубицин, уриказа, интерлейкин - 2, каталаза, билирубиноксидаза, стрептокиназа, t - PA (активатор плазминогена), гранулоцитарный/ мегакариоцитарный фактор роста (1-9). Для модификации биологически-активного вещества полиэтиленоксид должен быть активирован путем введения в его состав высоко реакционноспособных групп. В связи с тем, что в структуре полиэтиленоксидов присутствуют две функциональные группы - гидроксильные и эфирные, то активация полиэтиленоксида может быть проведена только путем функционализации гидроксильных групп, так как простые эфирные связи в полиэтиленоксидах химически высоко стабильны. Для активации полиэтиленоксидов используют стандартные методы, используемые для активации гидроксилсодержащих сорбентов (например, сефарозы). В частности, для этих целей может быть использован бромциан, карбодиимиды, N-оксисукцинимиды, бис-оксираны, дивинил-сульфон, трихлортриазин, карбонилдиимидазол, бензохинон (10). Все эти реагенты обладают высокой токсичностью, и очистка активированного полиэтиленоксида представляет собой трудоемкий и дорогостоящий процесс, так как примесей активирующих реагентов в конечном продукте не должно быть в связи с тем, что объектами пегилирования являются лекарственные препараты.

Известен радиационно-химический способ активации полиэтиленоксида, который был использован для иммобилизации протеолитических ферментов Bacillus subtilis (11). Сущность способа заключается в облучении водных растворов полиэтиленоксида, содержащего растворенные протеазы, ионизирующим излучением (потоком ускоренных электронов или гамма излучением) в дозе 1,0-2,5 Мрад. В результате свободнорадикальных реакций полиэтиленоксид связывается с протеазами за счет карбонильных групп, которые образуются при облучении полимера.

В работе (12) описан механизм радиационно-химической иммобилизации протеаз на полиэтиленоксиде и показан выход реакционноспособных карбонильных групп в зависимости от дозы ионизирующего излучения.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу-прототипом является способ получения инсулина для перорального применения, заключающийся в следующем. Готовят 1-50% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой от 0,4 до 40 кДа. Затем раствор облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гамма-излучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободно-радикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленоксида вводят инсулин до конечной концентрации (по белку) от 1-10 мг/мл (или по активности инсулина 10-100 МЕ/мл соответственно), в соотношении полиэтиленоксид: инсулин, равном (1-500):1, смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора (13). Известный способ позволяет повысить терапевтическую эффективность инсулина.

Недостатками способа-прототипа являются:

1. При облучении водных растворов органических соединений, в частности водных растворов полиэтиленоксида, декстрана и других водорастворимых полимеров в результате радиационно-химических реакций происходит образование перекиси водорода и, соответственно, пероксидных групп в облучаемом полимере, которые, с одной стороны, обладают цитотоксическими эффектами, с другой стороны, эти соединения являются основой для протекания пострадиационных реакций, описанных в литературе, которые в свою очередь существенно снижают стабильность активированного полимера, в том числе стабильность конъюгата полимера с биологически-активным веществом. Выход перекиси водорода пропорционален дозе ионизирующего излучения (14). В связи с этим способ-прототип не позволяет достичь стабильности активированного полимера или его конъюгатов с биологически-активными веществами без удаления перекиси водорода или органических пероксидов. Данная задача может быть решена различными химическими методами, например ультрафильтрацией, хроматографией, но применительно к радиационно-активированному полиэтиленоксиду в современной научно-технической литературе нет сведений о разработанных способах такой очистки, к тому же все перечисленные теоретически приемлемые способы трудоемкие и дорогостоящие.

2. В способе-прототипе используются радиационные установки, такие как гамма-источники или ускорители электронов. Это весьма сложные и крайне дорогостоящие установки, требующие специальных условий работы и техники безопасности, что значительно усложняет и удорожает способ активации полиэтиленоксида, в сравнении с химическими методами, даже если используются токсичные реагенты и возникает необходимость в сложных методах очистки конечного продукта.

Таким образом, недостатки способа-прототипа сводятся к сложности, экономической неэффективности ввиду дорогостоящего оборудования и недостаточно высокому качеству радиационно-активированного полиэтиленоксида, вследствие накопления перекисных продуктов радиолиза.

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа и повышение качества целевого продукта.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем

Водный 5-50% раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4-40 кДа нагревают до температуры 80-100ºС и окисляют перманганатом калия в кислой среде. Для этого к нагретому раствору полиэтиленоксида добавляют органическую или неорганическую кислоту, затем 2%-й (по массе) раствор перманганата калия в количестве от 1,6 до 20% от объема раствора полиэтиленоксида, смесь нагревают до выпадения в осадок двуокиси марганца. Надосадочную жидкость фильтруют от двуокиси марганца и получают раствор активированного полиэтиленоксида, содержащего карбонильные группы. Выход целевого продукта по массе составляет 92% - 98% от теоретически ожидаемого.

В растворе активированного полиэтиленоксида определяют содержание карбонильных групп по модифицированному методу Сиггиа и Ханна (15) следующим образом: к 1 мл исследуемой пробы раствора активированного полиэтиленоксида прибавляют 1 мл насыщенного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 95% растворе этанола и 0,02 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирки с реакционной смесью встряхивают и выдерживают в кипящей водяной бане 5 минут. По окончании времени выдерживания содержимое пробирок охлаждают до комнатной температуры. Затем к реакционной смеси прибавляют по 4 мл 0,1 М водного раствора гидроокиси калия и перемешивают. Через 10 минут определяют оптические плотности растворов при длине волны 480 нм. В качестве раствора сравнения используют контрольную пробу, приготовленную одновременно с опытной, в которой вместо раствора активированного полиэтиленоксида используют раствор неактивированного полиэтиленоксида в эквивалентной концентрации. Концентрацию карбонильных групп в мкМ/мл определяют по градуировочному графику, для построения которого используют ацетон.

В таблице 1 представлена зависимость концентрации карбонильных групп в активированном заявляемым способом полиэтиленоксиде 1500 от количества раствора перманганата калия. Как видно из представленных результатов, при использовании 2% раствора перманганата калия в количестве менее 1,6% от объема раствора полиэтиленоксида, концентрация карбонильных групп в полимере существенно снижается, а при использовании в количестве более 20% она не увеличивается. Таким образом, оптимальный диапазон 2% раствора перманганата калия для окисления полиэтиленоксида составляет от 1,6 до 20% от объема раствора полиэтиленоксида.

В качестве органической кислоты могут быть использованы, например, уксусная, муравьиная кислота, в качестве неорганической кислоты - фосфорная кислота.

При использовании исходного 5-50%-го раствора полиэтиленоксида для достижения заявленного технического эффекта к нему в указанной последовательности добавляют органическую или неорганическую кислоту в концентрации 5-35% и в количестве 0,5-2,0% от объема раствора полиэтиленоксида; затем 2%-ный раствор перманганата калия в количестве от 1,6% до 20% от объема исходного раствора полиэтиленоксида.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа от способа-прототипа является то, что реакцию окисления полиэтиленоксида проводят 2%-ным раствором перманганата калия в количестве от 1,6 до 20% от объема раствора полиэтиленоксида при температуре 80-100ºС в присутствии органической или неорганической кислоты, что позволяет существенно упростить и удешевить способ, за счет исключения сложного и дорогостоящего оборудования, а также одновременно повысить качество целевого продукта, так как в растворе активированного заявляемым способом полиэтиленоксида отсутствуют перекисные соединения. Отсутствие перекисных соединений определяли по методу Вагнера (15).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

50% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 100ºС, прибавляют к нему 35%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 0,5% от объема раствора, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 1,6% от исходного объема. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, надосадочную жидкость сливают, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют, например, с помощью фильтровальной бумаги. Выход целевого продукта составляет 92%. Активированный полиэтиленоксид не содержит примесей каких-либо химических ингредиентов, в частности перекиси водорода и органических пероксидов, которые обладали бы цитотоксическим действием или снижали стабильность активированного полимера и его коньюгатов с биологически-активными веществами.

Пример 2.

5%-й водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 40 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 80ºС, прибавляют к нему 5%-ный раствор фосфорной кислоты в количестве 2,0% от объема исходного раствора полиэтиленоксида, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 4% от объема исходного раствора полиэтиленоксида. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, например, через бумажный фильтр. Выход целевого продукта составляет 98%. Активированный полиэтиленоксид не содержит примесей каких-либо химических ингредиентов, в частности перекиси водорода и органических пероксидов, которые обладали бы цитотоксическим действием или снижали стабильность активированного полимера и его конъюгатов с биологически-активными веществами.

Пример 3.

10%-й водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 90ºС, прибавляют к нему 15%-ный раствор муравьиной кислоты в количестве 1,0% от объема исходного раствора полиэтиленоксида, полученную смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 10% от объема исходного раствора полиэтиленоксида. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, например, через бумажный фильтр. Выход целевого продукта составляет 95%. Активированный полиэтиленоксид не содержит примесей каких-либо химических ингредиентов, в частности перекиси водорода и органических пероксидов, которые обладали бы цитотоксическим действием или снижали стабильность активированного полимера и его конъюгатов с биологически-активными веществами.

Пример 4.

10% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 4,0 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 100°С, прибавляют к нему 5%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 2% от исходного объема раствора полиэтиленоксида, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 20% от исходного объема полиэтиленоксида. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. Выход целевого продукта составляет 94%. Активированный полиэтиленоксид не содержит примесей каких-либо химических ингредиентов, в частности перекиси водорода и органических пероксидов, которые обладали бы цитотоксическим действием или снижали стабильность активированного полимера и его конъюгатов с биологически-активными веществами.

Использование заявляемого способа получения активированного полиэтиленоксида позволит:

- упростить способ за счет использования доступного, дешевого и нетоксичного химического сырья (перманганаты);

- исключить применение сложного и дорогостоящего оборудования;

- повысить качество целевого продукта за счет исключения возможности образования примесей каких-либо химических ингредиентов, в частности перекиси водорода и органических пероксидов.