Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическим способам очистки окружающей среды, и может применяться для очистки окружающей среды от углеводородных загрязнений с использованием консорциума штаммов микроорганизмов.

Известны микроорганизмы, которые используются для очистки почвы и водоемов от углеводородных загрязнений:

- штамм Pseudomonas graminis ВКПМ В-8615 (патент РФ №2257411, C12N 1/20, 2005.07.27);

- штамм Arthrobacter sp. ВКПМ Ac-1556 (патент РФ №2128221, C12N 1/20, 1999.03.27);

- штамм Aspergillus niger S-1 (патент РФ №2280013, C02F 3/34, 2006.07.20).

Данные виды микроорганизмов отличаются как по активности усвоения углеводородов, так и по условиям применения, обеспечивающим их наибольшую эффективность (температуре, рН, источникам фосфора и азота). Однако особенности монокультур штаммов микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов для биологической деградации углеводородов, ограничивают область применения и условия использования биопрепаратов. Более высокой эффективностью и устойчивостью в природной экосистеме обладают биопрепараты на основе консорциумов из различных видов микроорганизмов.

Известен биопрепарат «Деворойл» (патент РФ №2023686, C02F 3/34, 1994.11.30), разработанный на основе консорциума штаммов микроорганизмов: Rhodococcus erytropolis 367-2, Rhodococcus maris 367-5, Rhodococcus erytropolis 367-6, Pseudomonas stutzeri 367-1, Candida lipolytica 367-3. Микроорганизмы, входящие в указанный препарат, способны развиваться в широком диапазоне солености (от 0,05% до 15%) и обеспечивать эффективное разложение нефтепродуктов в засоленных экосистемах.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов (патент РФ №2107722, C12N 1/20, 1998.03.27), состоящий из психрофильных бактерий: Acinetobacter calcoaeticus Baumann et al. 279 ВКПМ B-7179, Pseudomonas fluorescens Stanier et al. 325 ВКПМ В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chalmers 404 ВКПМ В-7180. Соотношение штаммов микроорганизмов в консорциуме, %: (30-35):(40-50):(20-25) соответственно. Данный консорциум обеспечивает биодеградацию углеводородов при температуре 10÷25°С.

Однако многокомпонентные препараты, состоящие из 4-х и более различных штаммов микроорганизмов, сложны как в производстве, так и в применении в связи с трудностями в поддержании и контроле соотношения видов в консорциуме. Кроме того, указанные консорциумы-деструкторы углеводородов составлены из прокариотических микроорганизмов, т.е. бактериальных штаммов, что ограничивает возможности таких препаратов.

Более широкими возможностями обладают биопрепараты, состоящие из прокариотических микроорганизмов и эукариотических микроорганизмов (грибов и дрожжей).

Известен консорциум микроорганизмов (патент РФ №2318736, C02F 3/34, 2008.03.10), включающий штамм бактерий Rhodococcus erytropolis HK-16, Artrobacter sp. HK-15, штаммы дрожжевого гриба Candida lipolytica КБП-3308 и Candida guilliermondi КБП-3175. Данный консорциум микроорганизмов применяется при температуре 28÷30°С, рН 4,5÷7,0 и обеспечивает утилизацию 95÷98% нефти за десять суток.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому способу является способ очистки воды и почвы от нефтепродуктов (патент РФ №2014286, C02F 3/34, 1994.06.15), в котором используются штаммы микроорганизмов: бактерий Mycococcus lactis ВСБ-Д-5, Mycococcus lactis ВСБ-574, Acinetobacter oleovorum subsp. Paraphinicum ВСБ-567 и дрожжей Candida tropicalis ВСБ-637, Candida guilliermondii ВСБ-638. Способ предусматривает применение различных биопрепаратов, составленных из вышеперечисленных штаммов. Например, консорциум штаммов Mycococcus lactis ВСБ-Д-5 и Candida tropicalis ВСБ-637 при температуре 30÷34°С и рН 5,5÷6,0 обеспечивает снижение нефтепродуктов в воде на 70% в течение трех суток, при соотношении штаммов в консорциуме (60:40)% соответственно. Недостатком указанного способа является ограниченность условий применения: узкий диапазон рН очищаемой среды и узкий спектр утилизируемых углеводородных загрязнений.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа очистки окружающей среды от углеводородных загрязнений с использованием консорциума микроорганизмов (коммерческое название биопрепарата - «САНДИМА»).

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности очистки окружающей среды от углеводородных загрязнений.

Для достижения указанного технического результата в предлагаемом способе в очищаемую среду вносят консорциум микроорганизмов и минеральную питательную среду. В качестве микроорганизмов используют штамм дрожжей Candida maltosa ВКПМ Y-3446 и штамм бактерий Dietzia mans ВКПМ Ac-1824 в соотношении, %: (1-99):(99-1) соответственно.

Штамм дрожжей Candida maltosa ВКПМ Y-3446, используемый в предлагаемом способе, выделен из образцов загрязненного углеводородами грунта селекционным путем. Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: H₃PO₄ (70%) - 2,6 г/л, KCl - 1,14 г/л, MgSO₄ - 0,55 г/л, FeSO₄×7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л; при рН 4,0÷4,2. В качестве источника углерода использовали парафин C₁₃÷C₁₇. Культивирование данного штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин и температуре окружающей среды 30°С.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма имеют форму от удлиненно-овальной до сильно вытянутой. Выделенный штамм образует колонии кремового цвета, матовые, шероховатые, с приподнятой серединой и неровными краями (на седьмые сутки культивирования на сусле агара).

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культуру хранят в пробирках на скошенном агаризованном сусле при температуре 4°С. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на среде сусла агара и жидкой минеральной среде, содержащей азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы и н-парафины в качестве источника углерода и энергии.

Штамм бактерий Dietzia maris ВКПМ Ac-1824 получен автоселекционным путем в условиях длительной непрерывной ферментации в стерильных условиях штамма Rhodococcus sp. ВКПМ Ac-1258. Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: KNO₃ - 4,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄×12H₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄×7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л; при рН 7,0. В качестве источника углерода использовали парафин C₁₃÷C₁₇. Культивирование данного штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин и температуре окружающей среды 30°С.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма имеют коротко-овальную форму. Штамм образует колонии клеток розоватого цвета, гладкие, выпуклые, с ровным краем, диаметром 3 мк (на третьи сутки культивирования на L-агаре).

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4°С. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на среде L-агара и жидкой минеральной среде, содержащей азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы и н-парафины.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуры штаммов ВКПМ Y-3446 и ВКПМ Ас-1824, входящих в состав консорциума микроорганизмов, выращивают раздельно на жидкой питательной среде. При необходимости полученную биомассу высушивают, например, в сушилке для получения порошковой формы каждой из культур. Далее, в зависимости от вида загрязнений и условий применения биопрепарата (температура окружающей среды, рН очищаемой среды, источник азота) составляют консорциум из штаммов микроорганизмов, взятых в соотношении (1-99):(99-1)% соответственно. Перед применением порошковую форму биопрепарата разводят водным раствором минеральной питательной среды, включающей азот, фосфор, калий, магний и микроэлементы, после чего биопрепарат вносят в очищаемую среду.

Ниже приводятся примеры, подтверждающие высокую эффективность предлагаемого способа.

Пример 1. Осуществляли утилизацию углеводородов в жидкой среде. В качалочную колбу заливали водный раствор минеральной питательной среды следующего состава: NaH₂PO₄×5H₂O - 5,0 г/л, K₂HPO₄×5H₂O - 5,0 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 3,0 г/л, KNO₃ - 2,0 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,8 г/л; при комнатной температуре и 220 оборотах колбы в минуту. Утилизируемые углеводороды вносили в количестве 1% от объема среды, а биопрепарат - 1 г/л. Содержание углеводородов в очищаемой среде определяли методом газожидкостной хроматографии.

Сравнительные данные по очистке жидкой очищаемой среды приведены в таблице 1.

Пример 2. Осуществляли утилизацию углеводородов в почве. В прямоугольный лоток объемом 3 дм³ вносили: 4 кг субпесчаной почвы; компоненты, содержащие азот, фосфор и калий, в количестве: [(NH₄)⁺+(NO₃)^-] - 200 мг/кг, P₂O₅ - 300 мг/кг, К₂О - 350 мг/кг; утилизируемые углеводороды. Влажность почвы поддерживали периодическим орошением на уровне 60% от влагоемкости почвы. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы, при этом поддерживали температуру 18-22°С. Количество вносимого биопрепарата составляло 0,5% от массы утилизируемых углеводородов. Содержание углеводородов в очищаемой среде определяли методом ИК спектрометрического определения.

Сравнительные данные по очистке почвы приведены в таблице 2.

Преимуществом предлагаемого способа является использование консорциума, состоящего из двух штаммов микроорганизмов, проявляющих неодинаковую активность по отношению к утилизируемым углеводородам и отличающихся по условиям, обеспечивающим их наибольшую эффективность (температура, рН среды, источник фосфора и азота). Указанное преимущество значительно расширяет область применения биопрепарата. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность очистки окружающей среды за счет расширения спектра утилизируемых углеводородов и диапазона рН очищаемой среды.