×
01.03.2019
219.016.cea2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСЕНСОРНОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНО- И ПОЛИСАХАРИДОВ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, в частности к способу получения аналитического устройства - биосенсорного электрода, который может быть использован для определения содержания моно- и полисахаридов в углеводсодержащем растительном сырье и промежуточных продуктах на разных стадиях технологического процесса. Биосенсорный электрод изготавливают из платины на основе полипиррола с медиатором. В качестве медиатора используют производное пиррола, содержащее ферроцен. В качестве биорецептора используют фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах FeO. с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбомидом, причем биосенсорный электрод с биорецептором размещают в корпусе из полупроводникового материала с возможностью подключения к цифроаналоговому преобразователю. Изобретение позволяет получить компактные устройства с малым временем отклика и высокой чувствительностью определения. 3 табл.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Биосенсор может быть использован для определения содержания моно- и полисахаридов в углеводсодержащем растительном сырье и промежуточных продуктах на разных стадиях технологического процесса.

Пищевая промышленность нуждается в экспрессных и широко доступных методах анализа ключевых составных частей или продуктов обмена веществ, определяющих степень качества сырья и продукции. Среди ключевых показателей качества продуктов питания и параметров ряда технологических процессов в пищевой промышленности важное место занимает содержание сахаров, этилового спирта и крахмала.

Наиболее распространенными являются физико-химические методы анализа крахмала. Колориметрический метод основан на свойстве крахмала образовывать ярко-окрашенные комплексы с йодом (М.Рихтер, З.Аугустат, Ф.Ширбаум. Избранные методы исследования крахмала. Пер. с нем. М.: «Пищевая промышленность», 1975. - С.122-123). Однако процесс образования полисахарид-йодных комплексов очень специфичен и сильно зависит от внешних условий - температуры, рН, амилозо-амилопектинового соотношения в крахмале.

При применении поляриметрического метода определения крахмала (метод Эверса) необходимо отделять все оптически активные компоненты, например белки (Авдусь П.Б., Сапожникова А.С. Определение качества зерна, муки и крупы. Изд. 2-ое. М.: Колос, 1967. - С.166-169).

Существуют также биохимические способы определения крахмала. Для этих целей используются каскадные ферментативные реакции гидролиза крахмала и определения субстратов в гидролизате, например, основанные на амилоглюкозидаз-гексокиназ-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной или α-амилаз-глюкозидаз-пероксидазной трансформации (Beutler H. Methods of enzymatic activity. - 1984. - V.6. - P.2-10). Данные методы используют спектрофотометрическую детекцию конечного продукта. Однако такие анализы дороги и не могут быть широко использованы в технологических процессах.

Описаны различные биосенсорные подходы для детекции олиго- и полисахаридов. Один из способов заключается в проведении внешнего ферментативного гидролиза образца до глюкозы и определении содержания глюкозы глюкозооксидазным сенсором.

Биосенсор - это устройство, состоящее из биологического активного компонента и компонента, преобразующего аналитический эффект в какой-либо регистрируемый сигнал (световой, звуковой). Биохимический преобразователь, или биотрансдьюсер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а точнее информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры.

В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили электрохимические биосенсоры - устройства, действие которых основано на ферментативном катализе реакции, в которой освобождаются или поглощаются электроны.

Известен патент, описывающий способ непрерывного определения концентрации глюкозы в образцах (см. пат. США № US 2010304399 (A1), МПК G01N 33/53, опубл. 02.12.2010). Техническое решение заключается в создании биосенсора, состоящего из биотрансдьюсера и полисахарида на его поверхности. В этом случае детектирование глюкозы состоит из следующих стадий: получение раствора карбогидрата и белка, причем соединение карбогидрата и белка имеет, по крайней мере, один рецептор, способный связываться с полисахаридами и глюкозой; контакт смеси с биосенсором; детектирование количества соединения карбогидрата с белком, связанного с полисахаридом, с помощью биосенсора, в то время как концентрация глюкозы в образце обратно пропорциональна количеству соединения карбогидрата с белком; регенерация поверхности биосенсора высокой концентрацией раствора глюкозы. К недостаткам предлагаемого технического решения можно отнести нестабильность показаний сенсора во времени и довольно узкий диапазон детекции глюкозы.

Известен также способ стабилизации активности глюкозодегидрогеназы, модифицированной пирроло-хинолин хиноном, в электрохимических биосенсорах на глюкозу (см. пат. США № ZA 200708312 (A), МПК C12Q 1/00 B4, опубл. 26.11.2008). Авторы патента предлагают использовать глюкозодегидрогеназу, модифицированную пирроло-хинолин хиноном в качестве кофактора фермента в электрохимическом биосенсоре. Предлагаемая композиция включает гидрофильные полимеры, аморфный необработанный кремний, буферный раствор, поверхностно-активные вещества и медиаторы. Основные недостатки предлагаемого способа связаны с невозможностью хранения получаемых биосенсоров без потери их работоспособности, а также со сложностью и невысокой технологичностью процесса изготовления биосенсора.

Также известен подход к получению биоэлектрода на основе пероксидазы, иммобилизованной на коллоидном золоте (см. пат. Германия № WO 9424262 (А1), МПК C12M 1/40, опубл. 27.10.1994). В предлагаемом способе биоэлектрод получают из пероксидазы хрена, которую сначала адсорбируют на коллоидном золоте, а затем наносят на проводящую поверхность электрода. Затем добавляют фермент-оксидазу для определения выбранного аналита. Оксидаза, селективная к определенному аналиту, может добавляться к раствору образца в растворимой или иммобилизованной форме. Предлагаемое техническое решение характеризуется таким недостатком, как невозможность получения в ходе анализа достоверных количественных результатов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее устройство для определения олиго- и полисахаридов с использованием иммобилизованных на носителе клеток штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280 (см. пат. РФ №66815, МПК G01N 27/26, опубл. 27.09.2007). Предлагаемое устройство состоит из следующих элементов: электрода Кларка, на котором размещен биорецептор, представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280, а также измерительной кюветы и магнитной мешалки. Иммобилизацию клеток штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280 осуществляют физической сорбцией на фильтрах из стекловолокна. Биосенсор чувствителен к наличию олигосахаридов - целлобиозы, мальтозы, мелибиозы - и может быть использован для их определения. Основными недостатками предлагаемого технического решения следует считать трудоемкость получения результатов, связанную с использованием микроорганизмов и кювет; узкий диапазон детекции определяемых компонентов; относительно большое время отклика сенсора; узкая субстратная специфичность используемого штамма микроорганизмов.

Задачей технического решения является упрощение процедуры выполнения анализа моно- и полисахаридов, создание портативных биосенсорных устройств, увеличение диапазона детекции компонентов и снижение времени отклика.

Технический результат достигается за счет использования в качестве биорецептора сенсора фермента, иммобилизованного на магнитных наночастицах Fe3O4. Применение нанообъектов позволяет получить компактные устройства с малым временем отклика и высокой чувствительностью определения.

Сущность изобретения заключается в том, что в качестве основы биосенсора используется платиновый электрод на основе полипиррола с медиатором, в качестве которого выступает производное пиррола, содержащее ферроцен. Роль анионного медиатора в данном случае заключается в обеспечении электронного переноса между ферментом и электродом. На первом этапе полипиррол осаждают на платиновую пластинку площадью 6 см2 путем полимеризации пиррола при сканировании потенциала электрода между 0 и 0,9 B при скорости развертки потенциала 50 мВ/с. Последующим добавлением производного пиррола, содержащего ферроцен, в полученное покрытие подготавливается электрод Pt/полипиррол - производное пиррола, содержащее ферроцен.

Биорецептор в данном техническом решении представляет собой фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах Fe3O4 с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбодиимидом. Наночастицы с карбоксильными группами на поверхности получают следующим образом: готовят смесь полиакриловой кислоты, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, нагревают ее при перемешивании в атмосфере азота до 220°C, затем к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 с карбоксильными группами акриловой кислоты отделяют центрифугированием.

Биорецептор (наночастицы Fe3O4 размером 100 нм с иммобилизованным ферментом) фиксируют с помощью специальных магнитов на измерительной поверхности платинового электрода, позволяющего измерять концентрацию образующегося пероксида водорода. Данная конструкция заключена в корпус, изготовленный из полупроводникового материала, и связана с цифроаналоговым преобразователем.

Биосенсор работает следующим образом. Датчик погружается в исследуемый раствор. При помещении биосенсора в анализируемый образец происходит химическая реакция между ферментом и анализируемым компонентом. Реакция происходит с участием кислорода O2 и воды H2O. Одним из конечных продуктов химической реакции является пероксид водорода H2O2.

При подаче 600 мВ на платиновый электрод перекись водорода распадается на 2 протона водорода, 2 электрона и кислород O2. С помощью специального цифроаналогового преобразователя происходит детекция двух образовавшихся электронов (тока). По току можно судить о концентрации компонента в анализируемом растворе, поскольку существует линейная зависимость между образовавшимся током датчика и концентрацией компонента в пробе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

В случае биосенсора для определения глюкозы в качестве биохимического трансдьюсера используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная на наночастицах Fe3O4 посредством карбодиимида. Иммобилизацию фермента осуществляют путем выполнения следующей последовательности операций.

Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°C, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием.

Вторая стадия иммобилизации заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. В отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°C в течение 60 мин. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение 2 ч при температуре 50°C. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 5,8).

Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.

На следующей стадии растворяют 500 мкг глюкозооксидазы в 500 мкл фосфатного буфера (pH 5,8) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 5,8) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.

Полученный биорецептор высушивают и фиксируют с помощью специальных магнитов на измерительной поверхности платинового электрода, позволяющего измерять концентрацию образующегося пероксида водорода. Данная конструкция заключена в корпус, изготовленный из полупроводникового материала, и связана с цифроаналоговым преобразователем. Физико-химические характеристики биосенсора для определения глюкозы представлены в табл.1.

Таблица 1
Физико-химические параметры биосенсора для определения глюкозы
Способ детекции Диапазон детекции, мМ Время анализа, мин Воспроизводимость сигнала, % Стабильность при хранении, мес.
Предлагаемое техническое решение 0,01-10,0 3-5 2,0 6
Прототип 0,05-5,0 10-15 5,0 4

Пример 2

Ферментом, используемым при конструировании биосенсора на крахмал, является амилосубтилин Г3х, иммобилизованный на частицах Fe3O4. Иммобилизация осуществляется следующим образом. Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода-этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 6,5).

Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.

На следующей стадии растворяют 500 мкг амилосубтилина Г3х в 500 мкл фосфатного буфера (pH 6,5) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 6,5) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.

Дальнейшие действия по получению биосенсора для определения крахмала аналогичны примеру 1. Физико-химические характеристики биосенсора для определения крахмала представлены в табл.2.

Таблица 2
Физико-химические параметры биосенсора для определения крахмала
Способ детекции Диапазон детекции, % Время анализа, мин Воспроизводимость сигнала, % Стабильность при хранении, мес.
Предлагаемое техническое решение 0,001-0,5 2-3 2,0 6
Прототип 0,003-0,05 10-15 5,0 4

Пример 3

Роль биохимического трансдьюсера в биосенсоре на целлобиозу играет фермент целлобиаза, иммобилизованная на наночастицах Fe3O4. Иммобилизация фермента включает следующие операции. Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода-этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 5,5).

Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.

На следующей стадии растворяют 500 мкг целлобиазы в 500 мкл фосфатного буфера (pH 5,5) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 5,5) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.

Дальнейшие действия по получению биосенсора для определения целлобиозы аналогичны примеру 1. Физико-химические характеристики биосенсора для определения целлобиозы представлены в табл.3.

Таблица 3
Физико-химические параметры биосенсора для определения целлобиозы
Способ детекции Диапазон детекции, мМ Время анализа, мин Воспроизводимость сигнала, % Стабильность при хранении, мес.
Предлагаемое техническое решение 0,01-10,0 3-5 2,0 6
Прототип 0,05-5,0 10-15 5,0 4

Таким образом, предлагаемый биосенсор на основе наночастиц Fe3O4 обеспечивает быстрое определение содержания глюкозы, крахмала и целлобиозы с использованием компактного электрохимического устройства. Можно выделить следующие преимущества данного изобретения перед прототипом:

- увеличение диапазона детекции компонентов;

- уменьшение продолжительности анализа;

- повышение стабильности при хранении.

Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов, включающий использование электрода, нанесение на поверхность его биорецептора, отличающийся тем, что биосенсорный электрод выполняют из платины на основе полипиррола с медиатором, в качестве которого выступает производное пиррола, содержащее ферроцен, в качестве биорецептора используют фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах FеO с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбомидом, при этом биосенсорный электрод с распололженным на нем биорецептором размещают в корпусе, изготовленном из полупроводникового материала, с возможностью подключения к цифроаналоговому преобразователю.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-3 из 3.
01.03.2019
№219.016.ced2

Способ получения препарата, усиливающего метаболизм алкоголя и продуктов его окисления

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения препарата, усиливающего метаболизм алкоголя и продуктов его окисления. Способ получения препарата, усиливающего метаболизм алкоголя и продуктов его окисления, где алкогольдегидрогеназу и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002456017
Дата охранного документа: 20.07.2012
20.03.2019
№219.016.e76d

Способ производства ферментированного напитка

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к производству ферментированных напитков на основе вторичного молочного сырья. Способ приготовления ферментированного напитка включает пастеризацию молочного сырья - обезжиренного молока или пахты или молочной сыворотки, охлаждение до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002413419
Дата охранного документа: 10.03.2011
23.03.2019
№219.016.ecbc

Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах оксидов металлов в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Способ позволяет повысить удельную активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002460790
Дата охранного документа: 10.09.2012
Показаны записи 1-10 из 48.
20.06.2013
№216.012.4a71

Устройство для переработки крови сельскохозяйственных животных и его применение

Изобретение относится к мясной промышленности, а именно к технологии переработки крови сельскохозяйственных животных. Переработка крови осуществляется комплексно устройством, включающим емкость для раствора стабилизатора, насос, ресивер для собираемой крови, полые ножи, позволяющие непрерывно...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002484639
Дата охранного документа: 20.06.2013
27.06.2013
№216.012.51bc

Способ диагностики инфекционной губчатой энцефалопатии животных методом иммуно-пцр

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Способ включает стадии иммобилизации антигена в лунки полистиролового 96-луночного планшета, связывания антигена с биотилированным антителом, взаимодействия биотилированного антитела с стрептавидиновым комплексом (комплекс стрептавидин -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486517
Дата охранного документа: 27.06.2013
20.11.2013
№216.012.82fe

Способ сублимационной сушки крови сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к пищевой промышленности и касается получения белковой смеси из крови убойных животных. Стабилизированную кровь заливают в противень, в который затем заливают жидкий азот. Жидкий азот при атмосферном давлении начинает кипеть, при этом температура кипения составляет...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002499210
Дата охранного документа: 20.11.2013
10.09.2014
№216.012.f326

Способ получения ферментативного сывороточных белков

Изобретение относится к биотехнологии. Получают белковый раствор из сухого концентрата сывороточного белка. Белковый раствор пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с и охлаждают. Устанавливают pH до показателя 7,5-8,0 путем добавления 5%-ного водного раствора щелочи гидроксида калия....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528068
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.02.2015
№216.013.26d9

Способ получения сухой лактулозы с помощью распылительной сушки

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ получения сухой лактулозы включает сушку раствора с массовой долей лактулозы 40% на установке распылительной сушки при температуре сушки 130-140°C, скорости подачи раствора в установку 10-15 мл/мин, скорость потока воздуха 15-25 м/ч....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002541398
Дата охранного документа: 10.02.2015
20.12.2015
№216.013.9970

Способ получения биодеградируемой термопластичной композиции

Изобретение относится к производству биоразлагаемых композиций, предназначенных для создания пленок и различных тароупаковочных изделий, способных к биодеградации под воздействием природных факторов. При производстве композиции смешивают полиэтилен, крахмал и технологические добавки, в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002570905
Дата охранного документа: 20.12.2015
10.02.2016
№216.014.c557

Белковая кормовая добавка "biolsow" для рациона питания сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к белковой кормовой добавке для сельскохозяйственных животных. Белковая кормовая добавка включает измельченную свиную шкуру и фермент с протеолитической активностью - коллагеназа, выделенный из дрожжей-продуцентов Clavispora lusitaniae, при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002574682
Дата охранного документа: 10.02.2016
10.02.2016
№216.014.e918

Способ получения продукта для профилактики железодефицита из крови свиней и крупнорогатого скота

Изобретение относится к пищевой промышленности. Цельную кровь обрабатывают стабилизатором-консервантом, состоящим из смеси растворов 4%-ного натрия цитрата и 0,07%-ного раствора лимонной кислоты. Массовая доля раствора лимонной кислоты от общей массы стабилизатора-консерванта 0,035%. Выделяют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575092
Дата охранного документа: 10.02.2016
13.01.2017
№217.015.76ef

Способ производства кекса с функциональными свойствами

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано на предприятиях кондитерской, хлебопекарной промышленности и общественного питания. Предложен способ производства кекса с функциональными свойствами, включающий взбивание маргарина, нагретого до температуры 40°С, в течение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599616
Дата охранного документа: 10.10.2016
13.01.2017
№217.015.9165

Способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для создания функциональных продуктов питания. Способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью на основе представителей нормальной кишечной микрофлоры человека, включающий выделение бифидобактерий и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002605626
Дата охранного документа: 27.12.2016
+ добавить свой РИД