ПРИМЕНЕНИЕ СУММАРНЫХ КУМАРИНОВ ПЛОДА CNIDIUM В ПРИГОТОВЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПСОРИАЗА

Данное изобретение относится к экстракту плода Cnidium и его применению, в частности суммарным кумаринам, экстрагированным из плода Cnidium, а также к их применению в лечении псориаза.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Псориаз является типом хронического заболевания кожи, наиболее часто локализованного на волосистой части кожи головы, локтях, коленях и нижней части спины пациента, представляющего серебристые чешуйки, покрывающие пораженные области. Пациент тяжело страдает от псориаза. В результате псориаз существенно влияет на повседневную жизнь и работу пациента.

До недавнего времени огромное число пациентов страдало от псориаза. Однако псориаз является очень трудным для излечения и считается Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) одним из наиболее важных заболеваний для лечения и профилактики в области дерматологии.

Патогенез псориаза не очень ясен. Его обычно связывают со сложными факторами, такими как наследственность, инфекция, иммунитет, метаболизируемость, эндокринная секреция, воспаление и психологические аспекты.

В настоящее время основным способом лечения псориаза является лечение лекарственными средствами, хотя использовали большое число способов. Однако очень трудно избежать рецидивов. До сих пор для лечения использовали кортикальные гормоны или иммуносупрессоры (см.: Progress of External Cortical Hormone Medicaments, Yaoxuetongbao, 1985, 20(9). Хотя кортикальный гормон может давать хороший кратковременный эффект, он истончает эпидермис и дерму пораженной части, т.е. делает их более тонкими, вызывает побочные действия, такие как индукция телеангиэктазии и привыкание к лекарственным средствам, и индуцирует другие осложнения при использовании в течение длительного времени. Между тем, эти лекарственные средства являются дорогостоящими.

Плод Cnidium (также называемый "fructus cnidii" или «обычный плод Cnidium») в китайской медицине, используемый для лечения заболеваний, упоминался в старинных медицинских книгах. Плод Cnidium использовали в клинике для лечения хирургических, гинекологических, дерматологических и отоларингологических заболеваний, таких как лишай, чесотка и экзема мошонки, поскольку китайцы считали, что плод Cnidium имеет эффект «удаления влажности», «убивания гельминтов» и «прекращения зуда». Однако не было сообщений о лечении посориаза суммарными кумаринами экстракта плода Cnidium.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является получение суммарных кумаринов, экстрагированных из плода Cnidium, а другой целью является обеспечение применения суммарных кумаринов, определенных здесь, в приготовлении лекарственного средства для лечения псориаза, которое обладает лечебным действием с небольшим побочным эффектом.

В данном изобретении суммарные кумарины плода Cnidium экстрагируют из плода Cnidium monnieri (L.) Cusson. Основными компонентами этого экстракта являются соединения кумарина, которые составляют более чем 85 мас.% в расчете на этот экстракт. Суммарные кумарины, упомянутые здесь, включают в себя шесть соединений кумарина, в которых Osthal имеет наибольшее содержание, более 90 мас.%. Osthal (соединение VI) является основным активным соединением в экстракте плода Cnidium. Все остальные пять активных соединений представляют собой фурокумарины, которые были идентифицированы как ксантотоксол (соединение I), ксантотоксин (соединение II), изопимпинеллин (соединение III), бергаптен (соединение IV), императорин (соединение V).

Кумарины, описанные в данном изобретении, были идентифицированы и разделены при помощи ВЖХ и УФ-спектр поглощения этих шести кумаринов обнаруживает для: osthal λ_max 322 нм (lgε=3,9); ксантотоксола λ_max 250 нм (lgε=4,25); ксантотоксина λ_max 248 нм (lgε=4,4); изопимпинеллина λ_max 268 нм (lgε=4,26); бергаптена λ_max 249 нм (lgε=4,38) и императорина λ_max 249 нм (lgε=3,65).

Согласно теории, что УФ-спектр поглощения всех кумаринов может быть объединен для расчета количества кумаринов, был получен УФ-спектр поглощения суммарных кумаринов в этаноле.

11 партий экстракта плода Cnidium идентифицировали посредством УФ в этаноле по данному изобретению и результат показал, что они имели почти один и тот же спектр поглощения. Максимальное поглощение всех этих экстрактов находилось около 322 нм (от 319 до 326 нм) с плоским пиком, а другие пики были при 250, 255 и 265 нм, соответственно.

Данное изобретение относится к применению суммарных кумаринов в приготовлении лекарственного средства для лечения псориаза и, в частности, применения плода Cnidium Китайской традиционной медицины в лечении псориаза. В данном изобретении это лекарственное средство содержит 5-35 мас.% суммарных кумаринов и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

Получают суммарные кумарины, описанные в данном изобретении, следующим образом.

Плод Cnidium измельчали до порошка. Этот порошок экстрагировали 80-95% этанолом при 60-80°С в течение двух часов и фильтровали. Затем остаток экстрагировали дважды 80-95% этанолом. Фильтраты объединяли и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 16 часов и фильтровали с получением зеленого осадка. Дополнительный осадок получали концентрированием фильтрата. Затем суммарные кумарины получали после сушки этого осадка.

1. Действие суммарных кумаринов на митоз вагинальных эпителиальных клеток у мышей

Отбирали 60 самок мышей NIH с массой 27 ± 2 г. После внутрибрюшинного инъецирования диэтилстилбестрола непрерывно в течение 3 дней, 0,2 мг/день для каждого животного, всех мышей оставляли в период течки. С 4-го дня мышей случайным образом делили на четыре группы по 15 мышей в каждой. Мышам этих четырех групп вводили в течение трех дней посредством зондового питания 150 мг/кг суммарных кумаринов, 75 мг/кг суммарных кумаринов, 15 мг/кг антралина и 15 мл/кг физиологического солевого раствора соответственно один раз в день. Последнее введение проводили в 8:00 часов утра во избежание влияния на результат испытания различных ритмов введения между днем и ночью у этих мышей. В 9:00 часов утра мышам вводили инъекцией 2 мг/кг колхицина для остановки митоза вагинальных эпителиальных клеток в среднем цикле М-фазы.

Мышей умерщвляли в 2 часа после полудня. Брали пробу из влагалища животного и фиксировали в 10% растворе формальдегида. Срез ткани наблюдали под световым микроскопом. Число митозов на 300 клеток дна матки считали для получения среднего числа митозов среди 100 клеток дна матки, что рассматривали как индекс митоза вагинальных эпителиальных клеток.

Результат этого испытания приведен в таблице 1. Он показал, что суммарные кумарины данного изобретения оказывали значимое ингибирование на митоз вагинальных клеток у мышей.

2. Оценка действия мазей суммарных кумаринов на образование эпидермиса зернистого слоя в чешуйке хвоста крысы

40 крыс SD с массой 189 ± 10 г делили случайным образом на четыре группы, из которых на хвосты одной группы наносили мазь, приготовленную с использованием суммарных кумаринов данного изобретения, в дозе 0,3 г для каждой крысы один раз в день; а на хвосты другой группы наносили ту же мазь и в той же дозе, но два раза в день. На хвосты третьей группы наносили мазь, приготовленную с использованием антралина в той же самой дозе, два раза в день, а для четвертой группы использовали «пустую» мазь (слепой опыт) дважды в день. После непрерывного нанесения мази на хвост в течение 20 дней крыс умерщвляли.

Срезали кусочек дорсальной кожи крысы приблизительно в 1,5 см на основании хвоста. Эту дорсальную кожу препарировали в виде среза ткани, который оценивали под световым микроскопом. Получали число чешуек, которые имели последовательные зернистые клетки зернистого слоя из 100 чешуек в эпидермисе хвоста крысы. Этот результат приведен в таблице 2. Он показал, что мазь, приготовленная из суммарных кумаринов, могла существенно увеличивать число чешуек, которые имели эпидермальные зернистые клетки зернистого слоя в хвосте крысы.

3. Ингибирование пассивной кожной анафилаксии (РСА) крыс

Волосы на спинке 40 крыс SD с массой 180 ± 10 г сбривали. 0,2 мл разбавленной крысиной антисыворотки (1:10) подкожно инъецировали каждой крысе в два места на спине, 0,1 мл для каждого места. После инъецирования крыс делили случайным образом на четыре группы, которым вводили посредством зондового питания 75 мг/кг суммарных кумаринов, 150 мг/кг суммарных кумаринов, 15 мг/кг антралина и 15 мл/кг дистиллированной воды в течение 3 дней один раз в день. Спустя 48 часов после инъекции крысиной антисыворотки 1 мл 0,5% красителя evans blue в качестве антигена вводили внутривенно крысам через каудальную (хвостовую) вену. Крыс умерщвляли через 20 минут. Кусочек кожи с синими пятнышками вырезали со спины и погружали в 5 мл раствора ацетон/физиологический солевой раствор (ацетон:физиологический солевой раствор = 7:3 об./об.) на 24 часа. После центрифугирования супернатант отбирали для измерения оптической плотности (OD) при 590 нм. Степень ингибирования получали в соответствии со следующим уравнением. Этот результат приведен в таблице 3. Он показал, что суммарные кумарины оказывали значимое ингибирующее действие на пассивную кожную анафилаксию (РСА) крыс.

Ингибирование(%)=[OD(контроль)-OD(лекарство)]×100%/OD(контроль)

4. Ингибирование суммарными кумаринами опухания уха мыши, индуцированного кротоновым маслом

80 мышей NIH с массой 27 ± 2 г случайным образом делили на четыре группы, которым наносили на ушные раковины обоих ушей 50 мкл композиции кротонового масла, состоящей из 2 мас.% кротонового масла, 5 мас.% воды, 20 мас.% этанола и 73 мас.% эфира. Спустя 0,5 часа мышам четырех групп соответственно наносили на левую ушную раковину 0,15 и 0,3 г мази, приготовленной из суммарных кумаринов, 0,3 г "пустой" мази и 0,3 г мази, приготовленной с использованием антралина.

Спустя 4 часа после обработки мышей умерщвляли. Кусочек уха диаметром 9 мм вырезали из обеих ушных раковин каждой мыши и взвешивали. Различие в весе между двумя образцами рассматривали как степень опухания уха.

Этот результат приведен в таблице 4 и он показал, что мазь, приготовленная с использованием суммарных кумаринов, давала значимое ингибирование опухания уха мыши, индуцированного кротоновым маслом.

5. Ингибирующее действие на опухание пальцев стопы крыс, индуцированное инъекцией яичного белка

50 крыс SD с массой 150 ± 10 г делили случайным образом на пять групп. Измеряли объем пальцев стопы на одной и той же стороне у крыс среди этих 5 групп. 10% яичный белок инъецировали в пальцы стопы по 0,2 мл в каждый палец. После этого крысам двух групп наносили соответственно 0,15 и 0,3 г мази из суммарных кумаринов (содержащей 10% суммарных кумаринов) на каждый палец. Крысам двух других групп наносили соответственно 0,3 г «пустой» мази и 0,3 г мази из антралина на каждый палец. Оставшуюся одну группу ничем не обрабатывали и она служила в качестве контроля. Спустя 0,5 часа описанную выше обработку повторяли. На 1-ом, 2-ом, 4-ом и 6-ом часах измеряли объем пальцев стопы. Различие в объеме рассматривали как степень опухания пальцев стопы. Этот результат показан в таблице 5.

Таблица 5 показала, что мазь из суммарных кумаринов могла ингибировать опухание пальцев стоп (лапок) мыши, индуцированное яичным белком.

6. Действие против зуда, индуцированного фосфатом гистамина, на морской свинке

50 морских свинок с массой 250 ± 15 г делили случайным образом на пять групп. Пальцы правых лапок животного брили. Животным двух групп наносили соответственно 0,15 и 0,3 г мази из суммарных кумаринов (содержащей 10% суммарных кумаринов) на каждый палец. Животным двух других групп наносили соответственно 0,3 г мази без суммарных кумаринов и 0,3 г мази с антралином на каждый палец. Оставшуюся группу не намазывали ничем и она служила в качестве контроля.

Кожу в том месте, где были выбриты волосы, на следующий день царапали наждачной бумагой (1^#), пока не проступало некоторое количество экстравазата (экссудата). Затем описанную выше обработку повторяли. Спустя 10 минут 0,01% раствор фосфата гистамина с последовательной концентрацией, начиная с 0,01, 0,02, 0,03% наносили по каплям на оцарапанный палец с интервалом 3 минуты (0,05 мл каждый раз), пока морская свинка не начинала поджимать палец. Дозу гистамина, при которой морская свинка поджимала палец, считали порогом вызывания зуда. Этот результат приведен в таблице 6, которая показывает, что мазь из суммарных кумаринов могла существенно увеличивать порог вызывания зуда, индуцированного фосфатом гистамина, у морской свинки.

7. Клиническое испытание

Способы: Сравнение действия суммарных кумаринов на псориаз с действием антралина у пациентов. Мазь, содержащую 10% суммарных кумаринов, наносили на одно пораженное псориазом место пациента и мазь, содержащую антралин, наносили на другое пораженное псориазом место того же пациента (в качестве положительного контроля) в течение 30 дней один или два раза в день. Другие релевантные лекарственные средства не использовали во время этого испытания.

Тест-стандарт обработки: использовали четыре степени в соответствии со стандартом для дерматоза, предписанным Национальным Министерством Здравоохранения.

Этот результат, приведенный в таблице 7, показал, что степень клинического улучшения достигала 60%, а степень полного излечивания достигала 96,7%.

8. Острая токсичность

Эксперимент с пероральным введением

После голодания в течение 16 часов 100 мышей NIH с массой 19±1 г, половину из которых составляли самцы и половину самки, делили случайным образом на 10 групп, каждая из которых включала 10 мышей. Соотношение последовательной дозы между каждой группой было 1:0,75. Каждой мыши вводили посредством зондового питания 0,8 мл каждый раз. Ежедневный симптом токсичности и количество смертей наблюдали в течение 14 дней. Рассчитывали LD50 и доступный диапазон 95% в соответствии со способом Блисса. Получали следующие результаты: LD50 (самцы) = 463,90 мг/кг, доступный диапазон 95% был 406,16-529,86 мг/кг; и LD50 (самки) = 409,85 мг/кг, доступный диапазон 95% был 357,02-470,59 мг/кг. Животные, которые выживали в этом эксперименте, были в довольно хорошем состоянии с нормальным аппетитом и, соответственно, прибавляли в весе.

Эксперимент с наружным нанесением

(1) Тест острой токсичности на поцарапанной коже кроликов

16 кроликам (NZR) оголяли площади по 150 см² на спинках. Спустя 24 часа обнаженную кожу царапали наждачной бумагой (1^#) до экссудации. Затем этих 16 кроликов делили случайным образом на четыре группы (половину составляли самцы). Кроликам трех групп наносили соответственно мазь, содержащую 10, 20 и 30% суммарных кумаринов, 3 г на каждого, кроликам оставшейся группы наносили мазь без кумаринов, 5 г на каждого. Обработанную кожу закрывали масляной бумагой и марлей. Мазь удаляли спустя 24 часа. Общее состояние кроликов наблюдали в течение 7 дней. Результаты показали, что ни один кролик не умер и общее состояние кроликов, в том числе прием пищи, активность и перистальтика кишечника и т.д., сохранялось в нормальном виде.

(2) Тест острой токсичности на нормальной коже кроликов

Тест острой токсичности на нормальной коже кроликов проводили так же, как описано в тесте (1). Результаты показали, что смерти кроликов во всех четырех группах не наблюдалось. После обработки животные были в хорошем состоянии и не было видимых различных изменений в действиях и выделениях, причем нормальный аппетит и общее состояние кроликов, в том числе прием пищи, активность и перистальтика кишечника и т.д., сохранялись в нормальном виде.

Вывод

Тест острой токсичности как на нормальной, так и на поцарапанной коже кроликов показал, что не было токсичности в отношении животных при обработке суммарными кумаринами (10, 20 и 30%).

9. Хроническая токсичность

3 группы крыс делили на группы с высокой, средней и низкой дозами и им вводили суммарные кумарины - 250, 158 и 100 мг/кг в течение 90 дней. В результате одну группу крыс не обрабатывали ничем в качестве слепого контроля. Наблюдали общее состояние крыс и проводили гематологический контроль и клинический анализ сыворотки. Результаты показали, что все животные были нормальными за исключением того, что две крысы в группе, которой вводили 250 мг/кг, умерли, а у других крыс в этой группе увеличение массы тела было замедлено по сравнению с крысами в других группах.

Приведенные выше эксперименты показывают следующие преимущества данного изобретения.

(1) Суммарные кумарины плода Cnidium данного изобретения могут значимо ингибировать митоз вагинальных эпителиальных клеток у мышей.

(2) Суммарные кумарины плода Cnidium данного изобретения могут в сильной степени ускорять образование эпидермального зернистого слоя в чешуйках хвоста крысы и оказывают сильное ингибирующее действие на пассивную кожную анафилаксию крыс.

(3) Они могут уменьшать опухание уха мыши, индуцированное кротоновым маслом, а также опухание стопы крыс, вызываемое яичным белком.

(4) Эксперимент по действию против зуда на морских свинках показывает, что мазь данного изобретения может ослаблять реакцию зуда.

(5) Подтверждено, что суммарные кумарины могут стимулировать уменьшение кератодермы и оказывают противовоспалительное действие, действие против анафилаксии, противоаллергическое действие и фунгицидное действие.

(6) Суммарные кумарины, экстрагированные из плода Cnidium, являются безопасными для применения и имеют сильную многокомпонентную фармакологическую активность. Они могут вводиться как наружно, так и перорально.

(7) Суммарные кумарины данного изобретения могут улучшать клинический симптом пациента с псориазом и увеличивать степень излечивания (60, 96,7% общей эффективности).

(8) Материалы, используемые в данном изобретении, могут быть получены из множества источников.

Лекарственные средства данного изобретения могут быть приготовлены в виде различных готовых форм, таких как капсулы, сиропы, инъекционные растворы, мази, кремы, суппозитории, настойки и т.д.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано в виде следующих примеров.

Пример 1

1 кг плодов Cnidium monnieri (L.) Cusson измельчали до порошка и затем растворяли в 6 кг 85% этанола. Эту смесь выдерживали при 80°С в течение 2 часов и фильтровали. Остаток дважды экстрагировали 3000 мл 85% этанола при 80°С, каждый раз в течение 2 часов. Все фильтраты объединяли и выдерживали при комнатной температуре. Окрашенный осадок собирали фильтрованием. Затем фильтрат концентрировали при 80°С при пониженном давлении до концентрации этанола в фильтрате 45% и выдерживали при комнатной температуре. Спустя 24 часа зеленый осадок собирали и сушили при 60°С с получением экстракта суммарных кумаринов с выходом 1,2%.

Пример 2

1 кг плодов Cnidium monnieri (L.) Cusson измельчали до порошка и затем растворяли в 5 кг 95% этанола. Эту смесь выдерживали при 60°С в течение 2 часов и фильтровали. Остаток дважды экстрагировали 3000 мл 95% этанола при 60°С, каждый раз в течение 2 часов. Все фильтраты объединяли и выдерживали при комнатной температуре. Окрашенный осадок собирали фильтрованием. Затем фильтрат концентрировали при 60°С при пониженном давлении до концентрации этанола в фильтрате 45% и выдерживали при комнатной температуре. Спустя 24 часа зеленый осадок собирали и сушили при 80°С с получением экстракта суммарных кумаринов с выходом 1,2%.

Пример 3

Мазь масло-в-воде готовили с суммарными кумаринами, полученными в примере 1, и другими компонентами: суммарные кумарины 100 г, стеариновая кислота 80 г, глицерилмоностеарат 100 г, белый вазелин 80 г, глицерин 160 г, Твин-80 60 г, вода 280 г, глицерин и воду (4:10) добавляли до 1000 г. Приготовленная мазь была однородной и гладкой, не раздражающей кожу.

Пример 4

100 г суммарных кумаринов, полученных в примере 1, смешивали с крахмалом и увлажняли небольшим количеством этанола. Эту смесь гранулировали после однородного смешивания и сушили. Затем готовили 1000 таблеток таблетированием этих гранул, нанесением на них покрытия и полированием с использованием общепринятого способа после добавления смазывающего агента. Каждая таблетка содержала 0,1 г суммарных кумаринов.

Пример 5

300 г суммарных кумаринов, полученных в примере 2, смешивали с крахмалом и увлажняли небольшим количеством этанола. Эту смесь гранулировали после однородного смешивания и сушили. Затем готовили 1000 таблеток таблетированием этих гранул, нанесением на них покрытия и полированием с использованием общепринятого способа после добавления смазывающего агента. Каждая таблетка содержала 0,3 г суммарных кумаринов.

Пример 6

250 г суммарных кумаринов, полученных в примере 2, измельчали до тонкого порошка и просеивали. Просеянный порошок инкапсулировали. Готовили 1000 капсул, каждая из которых содержала 0,25 г суммарных кумаринов.

Пример 7

10 г суммарных кумаринов, полученных в примере 1, растворяли в 10 мл бензилового спирта и 10 мл Твина-80. К этой смеси добавляли воду для инъекций до 2000 мл. Этот раствор фильтровали, стерилизовали и помещали во флаконы по 2 мл каждый. Инъекционный раствор содержал 5 мг суммарных кумаринов на миллилитр.

Пример 8

20 г суммарных кумаринов, полученных в примере 2, растворяли в 200 мл бензилового спирта и 20 мл пропиленгликоля. К этой смеси добавляли воду для инъекций до 2000 мл. Раствор фильтровали, стерилизовали и помещали во флаконы по 2 мл в каждый. Инъекционный раствор содержал 10 мг суммарных кумаринов на миллилитр.