Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ХРЯЩА У СОБАК

В данной заявке испрашивается приоритет согласно заявке на патент США № 11/057718, поданной 14 февраля 2005 г., раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам лечения артрита и связанных с артритом состояний у животных-спутников, конкретнее у собак.

Описание предшествующего уровня техники

Артрит, конкретнее остеоартрит, является дегенеративным заболеванием суставов, обычно поражающим людей и животных-спутников. См., например, Richardson et al. (1997), Vet. Clin. North Amer. Small Animal Practice 27, 883-911.

При остеоартрите возникает прогрессирующая деградация суставного хряща с потерей протеогликана и коллагена и пролиферация новой костной ткани, которые сопровождаются в разной степени выраженной воспалительной реакцией синовиальной мембраны. Остеоартрит - наиболее распространенная форма суставного и скелетно-мышечного заболевания, поражающая собак, но относительно редко встречающаяся у кошек. См., например, Schoenherr et al. (2000) in Hand et al, eds.: Small Animal Clinical Nutrition, 4th ed., 907-921, Walsworth Publishing Co., Marceline, MO; Hedborn et al. (2002) Cell Mol. Life Sci. 59, 45-53; Pool (1999) Front. Biosci. 4, D662-D670.

Лечение остеоартрита может включать фармакологические препараты, хирургическое лечение, нутрицевтические препараты и изменение питания. Однако такие современные подходы к лечению сосредоточены на ослаблении симптомов, кроме того, они не всегда успешны в лечении заболевания или лежащей в его основе патологии. Следовательно, сохраняется потребность в новых подходах к лечению остеоартрита у животных-спутников, конкретнее собак.

Омега-3 (также известные как n-3) жирные кислоты - незаменимый компонент пищи млекопитающих. Омега-3 жирные кислоты являются природными веществами, содержащимися в пище, кроме того, их используют в биологически активных добавках. Schoenherr et al. (2000), см. выше, проанализировали применение жирных кислот, включая n-3 жирные кислоты, при воспалительных заболеваниях, включая артрит, и дали ссылку на сделанную Miller et al. (1992) Canine Practice 17(6), 6-8, компиляцию наблюдений владельцев собак, которые ощущали ослабление клинических симптомов артрита у своих собак на фоне лечения жирными кислотами, начатого по поводу дерматологических проблем.

В настоящее время в качестве компонентов диеты наибольший интерес представляют три омега-3 жирные кислоты: эйкозопентаеновая кислота (EPA), докозагексаеновая кислота (DHA) и альфа-линоленовая кислота (ALA). До настоящего времени больших различий, касающихся этих трех кислот, не обнаружено.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время обнаружено, что у собак омега-3 жирные кислоты не равны по своей активности при артритических состояниях с поражением хряща. В исследованиях, упомянутых в данном документе, только EPA, но не DHA или ALA, в значительной степени абсорбировались хрящом собаки, и повреждение хряща, измеренное по высвобождению гликозаминогликана (GAG), значительно снижалось после воздействия EPA, но не DHA или ALA. Положительные эффекты от применения конкретной омега-3 жирной кислоты EPA у собаки, больной артритом, могут включать увеличение подвижности собаки, увеличение переносимости нагрузок на конечность собаки и ослабление боли, связанной с артритом.

Соответственно, предлагается способ увеличения подвижности собаки, больной артритом. Способ предусматривает введение собаке EPA в количестве, эффективно уменьшающем повреждение хряща у собаки.

Кроме того, предлагается способ увеличения переносимости нагрузки на конечность собаки, больной артритом, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно уменьшающем повреждение хряща у собаки.

Дополнительно предлагается способ ослабления боли, связанной с артритом, у собаки, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно уменьшающем повреждение хряща у собаки. Следующий вариант осуществления изобретения относится к способу модулирования ферментативного разрушения суставного хряща у собаки, предусматривающему введение собаке EPA в количестве, эффективно модулирующем ферментативное разрушение.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу уменьшения повреждения хряща у собаки путем введения собаке эйкозопентаеновой кислоты в количестве, уменьшающем повреждение хряща.

Согласно вышеупомянутым способам EPA может вводиться различными путями, включая пероральный, в качестве компонента пищевой композиции или в качестве добавки.

Дополнительно преимущества и положительные эффекты настоящего изобретения станут очевидными специалисту в данной области техники при чтении данного описания изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к введению EPA в качестве способа лечения остеоартритических заболеваний и состояний, и их симптомов у собак.

Омега-3 жирные кислоты представляют собой общепризнанную группу полиненасыщенных длинноцепочечных (обычно содержащих 12-26 атомов углерода) карбоновых кислот. Физиологически более важные омега-3 жирные кислоты имеют неразветвленные цепи длиной 18-22 атомов углерода. Все омега-3 жирные кислоты имеют двойную связь между 3-м и 4-м атомами углерода, если считать от метильного (омега) конца молекулы. Эйкозопентаеновая кислота (EPA) имеет цепь длиной 20 атомов углерода и в общей сложности содержит пять двойных связей, включая одну в омега-3 положении.

Когда в данном документе упоминаются омега-3 жирной кислоты, в частности EPA, подразумевается, что их производные, известные специалистам в данной области техники, могут быть замещенными, если это желаемо. Примеры подходящих производных включают сложные эфиры, такие как разветвленные или неразветвленные и/или насыщенные или ненасыщенные C₁-C₃₀ алкильные или циклоалкильные сложные эфиры, в частности C₁-C₆ алкильные эфиры омега-3 жирных кислот, в частности EPA.

EPA может вводиться собаке посредством одного или более из многих путей введения, таких как пероральный, интраназальный, парентеральный (например, внутривенный или подкожный) пути и тому подобные. Особенно подходящим является пероральный путь, и EPA может вводиться перорально в нутрицевтической или фармацевтической дозированной форме или в виде компонента пищевой композиции.

Если EPA присутствует в пищевой композиции, которая может быть влажной или сухой, EPA может включаться в ее состав, например, посредством любой подходящей процедуры смешивания, и/или распределяться на поверхности кусочков пищи, например, путем распыления, агломерации, обсыпания или осаждения на поверхности. В конкретных вариантах осуществления EPA присутствует в пищевой композиции, обеспечивающей диетическую пищу per se, в закуске, добавке или лакомстве, или в жидкой части пищи, такой как вода или другая жидкость.

Альтернативно EPA может вводиться в твердой форме, такой как порошок, или в форме жидкости или геля, или в нутрицевтической или фармацевтической дозированной форме, такой как капсула, таблетка, таблетка в форме капсулы (caplet), шприц или тому подобное. Внутри такой дозированной формы EPA может присутствовать в твердой, жидкой или гелевой форме. Вместе с EPA может использоваться любой обычный нутрицевтический или фармацевтический носитель, включая воду, глюкозу, сахарозу и тому подобное.

В определенных вариантах осуществления вводятся пищевые композиции, содержащие EPA, которые по существу не содержат DHA и/или ALA. Предполагается, что «по существу не содержащий DHA и/или ALA» означает то, что одна или обе из DHA и ALA по существу отсутствуют, или что присутствует только малое и незначительное количество одной или обоих из DHA или ALA, например, менее приблизительно 0,1%, менее приблизительно 0,03%, менее приблизительно 0,01%, менее приблизительно 0,003% или менее приблизительно 0,001% по массе композиции. В вариантах осуществления, которые «по существу не содержат DHA и/или ALA» в данном документе, любое количество DHA и/или ALA присутствует в концентрации, достаточно низкой, чтобы у собаки, больной остеоартритом, не возникало никакого существенного прироста влияния на остеоартрит или на его прогрессирование, или на вызванные им симптомы.

В других вариантах осуществления вместе с EPA могут присутствовать другие омега-3 жирные кислоты, такие как DHA и ALA, в существенных количествах. В некоторых вариантах осуществления также могут присутствовать омега-6 жирные кислоты, такие как линолевая кислота, гамма-линоленовая кислота (GLA) и/или особенно арахидоновая кислота (AA). Относительно большие количества омега-3 и омега-6 жирных кислот могут быть обнаружены в таких источниках, как рыбий жир и рыбная мука. По настоящему изобретению преимущества в уменьшении повреждения хряща при введении смеси омега-3 жирных кислот или смеси омега-3 и омега-6 жирных кислот в значительной степени или по существу полностью приписываются EPA. Следовательно, важно, чтобы в любой такой смеси EPA присутствовала в количестве, эффективно уменьшающем повреждение хряща у собаки.

EPA, введенная по настоящему способу, эффективна против различных форм остеоартрита, а также других форм артрита, включая ревматоидный артрит.

EPA действует, чтобы ингибировать развитие дегенеративного процесса в суставном хряще или чтобы ослабить дегенеративный процесс и тем самым улучшить здоровье суставов у собак с остеоартритом или у собак, у которых мог бы иным образом развиться остеоартрит. Этот эффект представляет собой дополнение к любому противовоспалительному действию омега-3 жирных кислот, которое при остеоартрите у собак может иметь меньшее значение из-за ограниченной роли воспаления при остеоартрите.

Применение in vitro процедуры эксплантации суставного хряща, которая показана в нижеприведенных примерах, продемонстрировало, что из EPA, DHA и ALA единственной омега-3 жирной кислотой, значительно уменьшающей индуцированное высвобождение гликозаминогликана (GAG) из хряща, является EPA. GAG являются структурным компонентом протеогликана, поэтому высвобождение GAG указывает на разрушение протеогликана.

Что касается профилактики повреждения суставов, вызванного остеоартритом, то конкретная целевая группа собак включает тех, которым требуется такое профилактическое вмешательство. Например, крупные породы, такие как лабрадор, ротвейлер, немецкая овчарка и тому подобные, более восприимчивы к остеоартриту, что доказывается большей частотой остеоартрита у этих пород. Кроме того, остеоартрит значительно чаще возникает у собак старше 6 лет. Также риску подвергаются активные собаки, мускулистые собаки и страдающие ожирением собаки.

Количество EPA для введения может существенно меняться. Как показано в примерах, приведенных в данном документе, наблюдается фактический дозозависимый эффект: чем выше введенное количество EPA, тем сильнее антиартритический эффект. Как правило, требуется минимум приблизительно 0,2 мас.% пищи, удовлетворяющей обычные ежедневные потребности собаки. В различных вариантах осуществления могут использоваться по меньшей мере приблизительно 0,2%, по меньшей мере приблизительно 0,25%, по меньшей мере приблизительно 0,3%, по меньшей мере приблизительно 0,4%, по меньшей мере приблизительно 0,5% или по меньшей мере приблизительно 0,6% от массы пищи. Соответственно, пища может содержать, в различных вариантах осуществления, до приблизительно 5%, до приблизительно 4%, до приблизительно 3%, до приблизительно 2,5%, до приблизительно 2,25% или до приблизительно 2 мас.% EPA. Все процентные содержания по массе, указанные в данном документе, если не указано другого, приведены в расчете на сухую массу.

Конкретное количество EPA может ежедневно включаться в обычную порцию пищи, или то же самое количество может ежедневно даваться животному в лакомстве или добавке. Может использоваться комбинация этих или любых других путей дозирования, при условии, что ежедневно предоставляется эффективное количество EPA.

В смесях омега-3 и омега-6 жирных кислот массовое отношение омега-3 жирных кислот к омега-6 жирным кислотам может значительно меняться. В различных вариантах осуществления массовое отношение омега-6 к омега-3 может составлять от приблизительно 1,1:1 до приблизительно 0,2:1 или от приблизительно 1,08:1 до приблизительно 0,42:1;, например, около 0,2:1, около 0,25:1, около 0,3:1, около 0,4:1, около 0,5:1, около 0,6:1, около 0,8:1, около 1,0:1 или более. В различных вариантах осуществления массовое отношение омега-6 к EPA может составлять от приблизительно 12,5:1 до приблизительно 1,0:1 или от приблизительно 12,4:1 до приблизительно 1,12:1, например, около 0,2:1, около 0,25:1, около 0,3:1, около 0,4:1, около 0,5:1, около 0,6:1, около 0,8:1, около 1,0:1, около 1,5:1, около 2:1, около 2,5:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7,5:1, около 10:1, около 12,5:1 или более. В различных вариантах осуществления массовое отношение арахидоновой кислоты (AA, омега-6 жирной кислоты) к EPA может составлять от приблизительно 2,8:1 до приблизительно 0,01:1 или от приблизительно 0,28:1 до приблизительно 0,08:1, например, около 0,01:1, около 0,02:1, около 0,04:1, около 0,06:1, около 0,08:1, около 1,0:1, около 1,5:1, около 2,8:1 или более.

EPA может вводиться в количестве, вычисленном как мг/кг массы тела. Таким образом, например, 20-килограммовая собака потребляет ежедневный рацион, равный приблизительно 275 г пищи в сутки. Количество EPA в пище, составляющее приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5% или приблизительно 0,6% по массе, привело бы к тому, что такая собака получала приблизительно 27,5, приблизительно 41,25, приблизительно 55, приблизительно 68,75 или приблизительно 82,5 мг/кг массы тела соответственно. Конкретнее EPA может вводиться собаке в количестве от приблизительно 20 до приблизительно 150 мг/кг массы тела в сутки, например, приблизительно 20, приблизительно 28, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 69, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 82, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 120 или приблизительно 150 мг/кг массы тела, или более.

В пищевой промышленности для домашних животных пищевые продукты обычно разделяются на «влажные» и «сухие». Влажная пища содержит относительно высокое количество воды и обычно находится в банке или другом контейнере, в котором воздух по существу или полностью отсутствует. Примерами таких продуктов являются композиции «кусок и соус», композиции, содержащие отдельные твердые частицы вместе с жидким соусом, и композиции типа хлеба, которые, как правило, имеют форму контейнера. Сухие продукты, как правило, представляют собой печеные или экструдированные материалы, последние затем разрезаются на порции индивидуальной формы, обычно известные как кусочки. EPA легко включается в состав влажной пищи обычными способами. Чтобы защитить EPA от окисления воздухом в сухой пище, может использоваться инкапсуляция. Кроме того, можно использовать антиоксиданты и продувку упаковок азотом. Иллюстрацией этому служит патент США No. 4895725, в котором особый акцент сделан на микрокапсуляцию определенных разновидностей рыбьего жира. Жиры с высоким содержанием омега-3 жирных кислот включают жир менхаден, лосося, трески и тому подобные.

Настоящее изобретение также относится, в различных вариантах осуществления, к способам, предусматривающим введение композиции, содержащей EPA, собаке для того, чтобы уменьшить тяжесть и частоту клинических симптомов остеоартрита, и боль, связанную с этим заболеванием, без существенных побочных реакций или побочных эффектов. Кроме того, различные варианты осуществления изобретения относятся к способу замедления клинического прогрессирования остеоартритического состояния у собаки, предусматривающему введение композиции, содержащей EPA. В различных вариантах осуществления способ, который описан в данном документе, по существу улучшает общее остеоартритическое состояние собаки так, что это улучшение можно объективно измерить по увеличению переносимости нагрузки на остеоартритические конечности. Настоящее изобретение также относится к способам, предусматривающим введение EPA в комбинации с другими методиками лечения остеоартрита, включая введение различных антиартритических лекарственных препаратов и/или кормление животного едой, позволяющей управлять его массой; обе из этих методик известны в данной области техники.

Считается, что эффект EPA по уменьшению повреждения хряща, связанного с остеоартритом, может по меньшей мере частично опосредоваться снижением экспрессии одного или более генов, ответственных за разрушение хряща. В некоторых случаях один или более генов, ответственных за разрушение хряща, могут быть выключены. Согласно варианту осуществления изобретения, в хрящевой ткани собаки уменьшается экспрессия мРНК фермента, вызывающего разрушение хряща, например, аггреканазы. Показателем уменьшенного повреждения хряща может быть снижение индуцированного высвобождения гликозаминогликана (GAG) из хрящевой ткани. Таким образом, нижеупомянутое является дополнительными вариантами осуществления изобретения.

Способ снижения экспрессии одного или более генов, относящихся к ферментативному разрушению суставного хряща у собаки, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно снижающем экспрессию гена.

Способ выключения одного или более генов, относящихся к ферментативному разрушению суставного хряща у собаки, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно выключающем ген.

Способ снижения экспрессии в хрящевой ткани собаки мРНК фермента, вызывающего разрушение хряща, например, аггреканазы, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно снижающем экспрессию мРНК.

Способ уменьшения индуцированного высвобождение GAG из хрящевой ткани собаки, предусматривающий введение собаке EPA в количестве, эффективно снижающем высвобождение GAG.

Изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реактивами, описанными в данном документе, потому что они могут меняться. Кроме того, в данном документе терминология используется исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Как используется в данном документе и прилагаемой формуле изобретения, единственные формы включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иного. Сходным образом слова «содержат», «содержит» и «содержащий» должны интерпретироваться включительно, а не исключительно.

Если не определено иного, все технические и научные термины и любые акронимы, используемые в данном документе, имеют те же самые значения, которые обычно придаются им средним специалистом в области, к которой относится изобретение. Хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения могут использоваться любые композиции, способы, изделия или другие средства или вещества, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, в данном документе описаны предпочтительные композиции, способы, изделия или другие средства или вещества.

Все патенты, заявки на патент, публикации и другие ссылки, процитированные или упомянутые в данном документе, включены в данный документе в пределах, разрешенных законом. Обсуждение этих ссылок предназначено только для того, чтобы суммировать сделанные в них утверждения. Не сделано никакого допущения, что любые такие патенты, заявки на патент, публикации или ссылки или любая их часть являются релевантным уровнем техники для настоящего изобретения, и право оспорить точность и уместность таких патентов, заявок на патент, публикаций и других ссылок специфично зарезервировано.

ПРИМЕРЫ

Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, хотя будет подразумеваться, что эти примеры включены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения, если конкретно не указано иного.

Пример 1

Этот пример иллюстрирует высвобождение гликозаминогликана (GAG) под влиянием омега-3 жирных кислот в культивируемой хрящевой ткани собаки.

Суставной хрящ получали из правого и левого коленных суставов (как из мышелка бедренной кости, так и из большеберцового плато) четырех собак. Хрящевые эксплантаты культивировали 3 дня в среде, содержащей 10% сыворотки коровьих эмбрионов, затем 3 раза промывали средой, не содержащей сыворотки. После этого эксплантаты культировали 6 дней в среде, свободной от сыворотки, но содержащей 0, 100 или 300 мкг/мл n-3 жирной кислоты (EPA, ALA or DHA). После этого периода всех эксплантаты 3 раза промывали в среде, не содержащей жирных кислот и сыворотки. Затем эксплантаты культивировали по отдельности в трех экземплярах в течение 4 дней в 1 мл среды, не содержащей жирных кислот и сыворотки, а также добавок (контроль, С), содержащей 10^-6 М ретиноевой кислоты (RA) или 50 нг/мл онкостатина M (OSM). Примечания: не все обработки были возможны для всех собак из-за недостаточной доступности хряща. Измеряли высвобождение GAG в среду (мкг/мл влажной массы) в конце культивирования. В нижеприведенных таблицах среднее и стандартное отклонение (SD) высвобождения GAG даны для тройных культур для каждой из четырех собак. Кроме того, для каждой обработки приведена концентрация лактата в среде (мкг/мл влажной массы).

**не анализировалось

Как показано в таблице 1, существенное снижение высвобождения GAG наблюдалось в культурах, обработанных 100 мкг/мл EPA и OSM, и при 300 мкг/мл - в культурах, обработанных RA и OSM. При любых дозах EPA не зарегистрировано существенного снижения концентрации лактата в среде.

** не анализировалось

Как показано в таблице 2, EPA, но не ALA или DHA, существенно снижала высвобождение GAG в культурах, обработанных OSM. Любая доза любой жирной кислоты не оказывала существенного влияния на концентрацию лактата в среде.

** не анализировалось

Как показано в таблице 3, ни одна из жирных кислот не оказывала существенного влияния на высвобождение GAG из стимулированного RA или OSM хряща данного животного. Любая доза любой жирной кислоты не меняла концентрацию лактата в среде.

Как показано в таблице 4, EPA в концентрации 300 нг/мл, но не любая другая жирная кислота в любой дозе, значительно снижала высвобождение GAG из культур, обработанных RA. Отмечено существенное уменьшение концентрации лактата в среде в контрольной культуре, культурах, обработанных RA и OSM при предварительной обработке 300 мкг/мл OSM.

Пример 2

Этот пример иллюстрирует инкорпорацию омега-3 жирной кислоты в мембраны хондроцитов собаки.

Большинство этих экспериментов выполняли на однослойных культурах, однако в одном эксперименте была проанализирована инкорпорация жирных кислот в культуры эксплантата собачьего хряща.

Однослойные культуры: по истечении 24 или 48 часов не было инкорпорации 18:3 омега-3 жирной кислоты ALA в мембраны хондроцитов двух собак. Процентное содержание от ALA в хондроцитах, инкубированных в среде в чистом виде, составило <1% из 5 (диапазон 0,3-0,9%) и после 24 или 48 часов инкубации с 100 или 300 мкг/мл ALA, это процентное содержание существенно не менялось (диапазон 0,3-2,5%).

По истечении 48 часов не было существенной инкорпорации 20:5 омега-3 жирной кислоты EPA в мембраны хондроцитов одной собаки. Процентное содержание EPA повысилось с <1% (диапазон 0,2-0,6%) до примерно 7% (диапазон 5,6-8%), когда культуры были обработаны 100 или 300 мкг/мл EPA в течение 48 часов. Инкорпорация не отличалась, если культивирование производилось в присутствии или отсутствии 5% сыворотки коровьих плодов (FCS).

По истечении 48 часов наблюдалась существенная инкорпорация 20:5 омега-3 жирной кислоты EPA, но не 18:3 омега-3 жирной кислоты ALA в мембраны хондроцитов одной собаки (дозы каждой жирной кислоты 300 мкг/мл). Процентное содержание EPA повысилось с <1% до примерно 15%.

По истечении 3 или 6 дней наблюдалась существенная инкорпорация 20:5 омега-3 жирной кислоты EPA в мембраны хондроцитов одной собаки (доза EPA 300 мкг/мл). Процентное содержание EPA повысилось с <1% до 16-18%, при этом различия между 3 и 6 днями инкубации отсутствовали.

Культура эксплантатов: по истечении 6 дней наблюдалась явная инкорпорация 20:5 омега-3 жирной кислоты EPA, но не 8:3 омега-3 жирной кислоты DHA или омега-6 жирной кислоты АА в эксплантаты хряща одной собаки (дозы каждой жирной кислоты 300 мкг/мл). Процентное содержание EPA повысилось с 0% (не определимого) до примерно 2%.

Выводы: эти данные свидетельствуют о том, что EPA, но не другие омега-3 жирные кислоты, были инкорпорированы в мембраны хондроцитов собаки как в монослое, так и в культурах эксплантатов.

Пример 3

Этот пример иллюстрирует влияние омега-3 жирной кислоты на метаболизм хондроцитов собаки.

Чтобы оценить потенциальный влияние омега-3 жирной кислоты на метаболизм белка и протеогликана в собачьем хряще, были получены культуры, как описано в примере 1, за исключением последних 4 дней культивирования, когда катаболические стимулы не добавлялись (то есть все культуры были «контрольными»). В последние 24 часа культивирования к среде добавляли (i) ³⁵SО₄ (чтобы измерить синтез протеогликана) или (ii) ³⁵S-метионин и ³⁵S-цистеин (чтобы измерить синтез белка), чтобы радиоактивно пометить заново синтезированные протеогликаны и белки соответственно. Включение радиоактивной метки в матрикс хряща измеряли в конце культивирования. Не было сделано попыток количественно оценить потерю радиоактивно помеченного материала за 24-часовой период мечения. Среднее и стандартное отклонение SD) включения ³⁵SО₄ ("PG") или ³⁵S-метионина и ³⁵S-цистеина («PROT») в виде DPM/мг влажной массы приведены в таблице 5 ниже.

Как показано в таблице 5, не было существенного влияния любой омега-3 жирной кислоты на синтез и инкорпорацию белка в матрикс. EPA в дозе 100 мкг/мл значительно повышал синтез и инкорпорацию протеогликана. Любая другая доза или жирная кислота существенно не влияли на синтез и инкорпорацию протеогликана в матрикс хряща.

Чтобы измерить уровни экспрессии мРНК матричных протеиназ (аггреканазы-1 и -2), циклооксигеназы-1 и -2, липооксигеназы-5 и-12 и потенциальных аутокринных цитокинов и их рецепторов (например, IL-1, IL-6 и TNF) использовалась ПЦР с обратной транскрипцией.

Результаты этого исследования показали, что мРНК аггреканазы-1 и аггреканазы-2 экспрессировались в «нормальной» ткани хряща собаки. Кроме того, у некоторых собак экспрессировалась мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), хотя у этих животных не было признаков патологии суставов. Это позволило мониторировать влияние добавления омега-3 и омега-6 жирных кислот на экспрессию мРНК аггреканаз и ЦОГ-2 в нестимулированных эксплантатах суставного хряща собак. EPA была единственной жирной кислотой, способной снизить мРНК для ферментов, способных к разрушению, аггреканазы-1 и аггреканазы-2, в суставном хряще собак. Это продемонстрировало способность EPA «выключать» гены, отвечающие за разрушение хряща.

Пример 4

Данный пример иллюстрирует эффекты омега-3 жирных кислот в клинических исследованиях остеоартрита у собак.

На домашних собак с клиническим диагнозом остеоартрита было проведено три исследования. Ветеринары общей практики и специалисты по ортопедии регистрировали клиентов-владельцев собак, которые отвечали конкретным критериям включения. От всех пациентов требовалось (i) иметь рентгенологическое подтверждение остеоартрита с измеримыми клиническими проявлениями заболевания, основанными на анамнестическом отчете владельцев и физикальном исследовании, проведенном ветеринарами; (ii) быть здоровыми в других отношениях и свободными от сопутствующих заболеваний, что устанавливалось на основе физикального исследования, общего и биохимического анализа крови; и (iii) следовать режиму терапии, если они получали лекарственные препараты или добавки, назначенные по поводу остеоартрита, в течение 30 дней до включения в исследование.

Выполняли следующие измерения. Профиль жирных кислот в сыворотке: определялся методом газовой хроматографии, включающим экстракцию жирных кислот смесью хлороформа и метанола (2:1), метилирование с использованием трифторида бора-метанола (BF₃:MeOH), за которым следовало определение ионизации в пламени (FID). Метиловые эфиры жирных кислот выявляли, сравнивая время удерживания с данным показателем для известных стандартов, и оценивали количественно, используя внутренний стандарт. Ветеринарное клиническое обследование: ветеринары проводили как физикальное исследование, так и клиническую оценку остеоартритического состояния пациента во время фазы скрининга и по окончанию каждого интервала кормления в течение клинического исследования. Ветеринары оценивали тяжесть пяти остеоартритических параметров: хромота, нежелание нести нагрузку, снижение объема движений, нежелание поднимать на контралатеральную конечность и боль при пальпации сустава. В течение периода кормления измеряли изменения показателей тяжести этих отдельных параметров. Полную ветеринарную клиническую оценку влияния изменений питания на остеоартритическое состояние пациента выводили, объединяя изменения в показателях тяжести для всех пяти отдельных параметров.

Субъективная оценка владельцев собак. От владельцев собак требовалось заполнить опросник для включения в исследовании перед тем, как принять в нем участие, а также дополнительные опросники по окончанию каждого интервала кормления в течение клинического исследования

Опросник для включения в исследование. Владельцы оценивали частоту и тяжесть наиболее частых признаков остеоартрита у собак, включая затруднения при вставании после отдыха, хромоту, тугоподвижность, болезненность при дотрагивании, отставание во время прогулок, повизгивание или вой от боли, агрессивное поведение, трудности при беге, трудности при ходьбе, трудности при подъеме, трудности при прыжках, трудности при играх, нарушения подвижности и общий уровень активности. Кроме того, владельцы оценивали общее остеоартритическое состояние своих домашних животных.

Опросник питания. Владельцы домашних животных оценивали и частоту, и изменения тяжести признаков остеоартрита у собак, которые они отметили при включении в исследование. Кроме того, владельцы животных оценивали выраженность боли у своих собак, связанной с остеоартритом.

Анализ походки с нагрузочной плитой. В каждом учреждении собак оценивали, используя компьютеризированную биомеханическую нагрузочную плиту через 0, 6 и 12 недель. Плита была смонтирована по центру и находилась на одном уровне с поверхностью 10-метровой пешеходной дорожки. Дрессировщик пускал собак рысью поперек нагрузочной плиты, и наблюдатель оценивал каждый проход поперек плиты, чтобы подтвердить удары лап и походку. Испытание считали действительным, если имелись различные ипсилатеральные удары передней и задней лапы за время, когда собака пробегала рысью поперек нагрузочной плиты со скоростью 1,7-2,0 м/с с ускорением, варьировавшим в пределах -0,5-0,5 м/с². Во время каждого испытания измеряли поступательную скорость движения собаки, используя миллисекундный таймер и два фотоэлектрических переключателя. Каждое испытание записывали на видеоленту для анализа и подтверждения действительных ударов лап. Старались убедиться в том, что собака привела в действие таймер, и что соответствующая скорость (по ощущениям дрессировщика и наблюдателя) сохранялась от края до края плиты во время каждого испытания.

За время каждого тестового периода для каждой пораженной конечности и каждой ипсилатеральной конечности каждой собаки было проведено пять действительных испытаний. Ортогональные усилия опорной реакции грунта, состоящие из пикового вертикального усилия, вертикального импульса, пиковых усилий торможения и поступательного движения и импульсов торможения и поступательного движения, измеряли и записывали специализированной компьютерной программой (Acquire, Sharon Software, DeWitt, MI). Все усилия были нормализованы по отношению к массе тела в килограммах. Данные действительных испытаний для каждой конечности усредняли. чтобы получить среднее значение для каждого усилия или импульса за каждый период времени.

Сравнивали данные по усилию опорной реакции грунта для группы лечения и группы плацебо в виде процента различий между хромающей и ипсилатеральной конечностью за один и тот же промежуток времени. Различия в процентах для данных по усилию опорной реакции грунта для хромающей конечности сравнивали в начале и в конце каждого периода кормления.

Исследование номер 1: исследование собак было предпринято, чтобы изучить диетическое влияние кормление повышенным количеством n-3 жирных кислот на собак с диагнозом остеоартрита. Чтобы включать пациентов в исследование, было набрано 18 ветеринаров общей практики. В общей сложности 131 собака была рандомизирована на два диетических лечения; кормление продолжалось 180 дней. Тестовый и контрольные продукты питания были схожи по профилю макроэлементов, но значительно различались по составу жирных кислот (таблица 6). Тестовая диета содержала высокие уровни ALA, EPA и DHA и имела низкое отношение n-6/n-3. Контрольная диета представляла собой лидирующее по продажам коммерчески доступное питание для собак с типичными уровнями n-3 жирных кислот и соотношением n-6/n-3, характерным для промышленности.

*NFE = содержание растворимых углеводов в виде свободного от азота экстракта

Жирные кислоты сыворотки и оценки владельцев животных записывали на 0-й, 45-й, 90-й и 180-й день. Профили жирной кислоты сыворотки значительно модулировались тестовой пищей. У тестовой группы были статистически значимо выше концентрации n-3 жирных кислот (Р<0,01), а именно EPA, DHA и ALA, статистически значимо ниже концентрации АА (Р<0,01) и статистически значимо ниже отношения n-6/n-3 (Р<0,01) по сравнению с контрольной группой по завершении каждого интервала кормления (таблица 7). Тестовая группа показала значимое улучшение поднятия после отдыха, бега и игры ко дню 45 и ходьбы - ко дню 90 и 180 по сравнению с контрольной группой на основе наблюдений владельцев (р<0,05), даже при наличии сильного эффекта плацебо (таблица 8).

* Шкала тяжести остеоартрита: 1 = улучшение, 2 = без изменений, 3 = ухудшение.

* nsd - различия статистически незначимы.

Исследование номер 2: исследование собак было предпринято, чтобы изучить диетическое влияние кормление повышенным количеством n-3 жирных кислот на собак с диагнозом остеоартрита. Пациентов в исследование включали два специалиста по ветеринарной ортопедии. В общей сложности 38 собак были рандомизирована на два диетических лечения; кормление продолжалось 180 дней. Тестовое и контрольное питание было произведено с теми же партиями пищевых продуктов, как описано выше (таблица 6).

Жирные кислоты сыворотки, анализ походки на нагрузочной плите и ветеринарные клинические обследования записывали на 0-й, 45-й и 90-й день. Профили жирной кислоты сыворотки значительно модулировались тестовой пищей. У тестовой группы была статистически значимо выше концентрации n-3 жирных кислот (Р<0,01), а именно EPA, DHA и ALA, статистически значимо ниже концентрации АА к 90-му дню (Р<0,01) и статистически значимо ниже отношения n-6/n-3 (Р<0,01) по сравнению с контрольной группой по завершении каждого интервала кормления (таблица 9).

Биомеханическая оценка наиболее пораженной остеоартритом конечности собаки объективно оценивалась с использованием анализа походки на нагрузочной плите (таблица 10). Пиковое вертикальное усилие было ключевым параметром, который измеряли, чтобы определить нагрузку на пораженную конечность. Не было значимых различий в среднем пиковом вертикальном усилии в течение 90 дней кормления в контрольной группе (P=0,91), хотя в тестовой группе было статистически значимое повышение среднего пикового вертикального усилия с течением времени P=0,01). Процент среднего изменения пиковом вертикальном усилии также значимо отличался между группами (Р<0,05), указывая на то, что в тестовой группе повысилась нагрузка на пораженную конечность, в то время контрольная группа не показала изменений в нагрузке в течение исследования. Способность переносить нагрузку также можно представить, отражая распределение частоты процента изменения пиковой вертикальной нагрузки для каждой группы питания. Только 31% животных в контрольной группе показал улучшение переносимости нагрузки после 90 дней кормления, в то время как у 82% собак в тестовой группе в течение исследования переносимость нагрузки повысилась.

Субъективные клинические оценки, сделанные ветеринарным ортопедическим хирургом, дали дополнительное подтверждение эффективности тестовой диеты. На основании полной ветеринарной клинической оценки улучшение было отмечено у статистически значимо большего процента собак, потреблявших тестовую пищу, по сравнению с собаками, которые потребляли контрольную пищу (Р<0,05). В тестовой группе ветеринарный специалист также наблюдал больший процент собак с ослаблением боли при пальпации сустава по сравнению с контрольной группой (Р=0,05).

Исследование номер 3: исследование собак было проведено, чтобы определить дозовый эффект кормления собак, у которых был диагностирован остеоартрит, повышенными уровнями n-3 жирных кислот. Пациентов в исследование включали 28 ветеринарных врачей общей практики. В общей сложности 177 собак были рандомизированы для трех диетических лечений; кормление продолжалось 90 дней. Примерно две трети собак, принимавших участие в исследовании, получали лекарственные препараты и/или добавки, назначенные для лечения остеоартрита, в дополнение к оцениваемым терапевтическим диетам. Три тестовых пищи имели сходный профиль макроэлементов, но отличались по составу EPA и DHA, переменная А содержала самые низкие уровни, а переменная С - самые высокие (таблица 11).

*NFE = содержание растворимых углеродов в виде свободного от азота экстракта

Жирные кислоты сыворотки, оценки владельцев животных и ветеринарные клинические оценки записывались в 0-й, 21-й, 45-й и 90-й день. Профили жирных кислот сыворотки значимо модулировались всеми тремя диетическими переменными. У собак, которых кормили тестовыми переменными В и С, сывороточные концентрации n-3 жирных кислот были статистически значимо выше (Р<0,01), особенно EPA, DHA и ALA, концентрации n-6 жирных кислот были статистически значимо ниже (Р<0,01), особенно АА (Р<0,01), и отношения n-6/n-3 были статистически значимо ниже (Р<0,01) по сравнению с собаками, которых кормили тестовой переменной А, к концу каждого интервала кормления (таблица 12).

Владельцы животных сообщили об улучшении 13 из 14 отдельных признаков остеоартрита у собак, получавших любую из диетических переменных в течение 21 дня (таблица 13). Кроме того, владельцы животных сообщили о снижение тяжести 13 из 14 отдельных признаков остеоартрита у собак, получавших любую из диетических переменных в течение 90 дней (таблица 14). Владельцы животных также сообщили о существенном снижении частоты наблюдаемых признаков остеоартрита, после того, как собаки потребляли любую из диетических переменных в течение 90 дней (таблица 15).

Вышеприведенные значения "p" относятся к изменениям средних со дня 0 ко дню 21

Вышеприведенные значения "p" относятся к изменениям средних со дня 0 ко дню 90

По данным ветеринарных клинических оценок сообщалось, что у собак, потреблявших более высокие концентрации n-3 жирных кислот, имелось более выраженное улучшение остеоартритического состояния и более выраженное ослабление прогрессирования остеоартрита, чем у собак, получавших более низкие дозы (таблица 16). При сравнении группы, получавших лекарственные препараты и/или добавки, и группы, не получавших лекарственных препаратов, статистически значимых различий в улучшении остеоартритического состояния или ослабления прогрессирования артрита выявлено не было (таблица 17). Это указывает на то, что терапевтические диеты действуют синергично с другими терапевтическими средствами или по меньшей мере не препятствуют действию других терапевтических средств, предоставляя собакам, страдающим от артрита, дополнительные преимущества.

Сообщалось о крайне низкой частоте побочных реакций или побочных эффектов у собак, принимавших участие в исследовании. Только у 5 собак из 215, которым была назначена пища, отмечена диарея и рвота, которые, вероятно, были приписаны употреблению одной из диетических переменных. В предыдущих двух обсуждаемых исследованиях сообщалось о сходной частоте побочных реакций или побочных эффектов у собак, употреблявших терапевтические диеты (1/88 и 1/26 для примеров 1 и 2 соответственно).

В описании изобретения раскрыты типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения и, хотя использованы специальные термины, они использованы только в общем и описательном смысле, а не для целей ограничения объема изобретения, изложенного в формуле изобретения. Очевидно, что в свете вышеупомянутых идей возможны многочисленные модификации и изменения изобретения. Поэтому следует понять, что в объеме прилагаемой формулы изобретение может быть осуществлено на практике иначе, чем конкретно описано.