Результат интеллектуальной деятельности: Средство для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для повышения жизнеспособности трансплантата роговицы и пролонгирования сроков консервации для задней послойной кератопластики.

Ближайшим аналогом является средство для консервации донорских роговиц глаза (Патент РФ №2450515), содержащее: среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 St. III (Р/У ЛРС-008827/08-061108) при следующем соотношение компонентов, мас. %: Среда 199 25,0, Среда Хэма F-10 25,0, Хондроитин-сульфат А 0,5, Декстран-40 5,0, Гентамицин-сульфат 0,00014, Амфотерицин В 0,00015, NeyDIL №37 St. III 0,00015, Среда Дюльбекко-Игла остальное.

Недостатком этой среды является то, что использованные регуляторные пептиды NeyDIL №37 St. III не восстанавливают липидный слой клеток роговицы, не уменьшают внутриклеточный некроз эндотелия и кератоцитов.

Задачей изобретения является создание многокомпонентного средства для повышения жизнеспособности трансплантата роговицы и пролонгирования сроков консервации, как для сквозной, так и для задней послойной кератопластики.

Техническим результатом является повышение жизнеспособности трансплантата путем восстановления клеточных и внутриклеточных мембран, пролонгирование сроков консервации за счет сохранения плотности эндотелиальных клеток в режиме гипотермической (при температуре 4-8°C) консервации донорской роговицы.

Технический результат достигается тем, что данное средство для консервации донорской роговицы, в режиме гипотермической консервации, содержащее среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, Гентамицин-сульфат, амфотерицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат Фосфоглив при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При этом среда 199 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 25; Л-аргинина хлорид 70; аспарагиновая кислота 30; Л-цистеина хлорид - 0,0987; Л-цистина двунатриевая соль; Л глютаминовая кислота 66,82; Л-глютамин 100; глютатион 0,05; глицин 50; Л гистидина хлорид одноводный 21,88; Л гидрооксипролин 10; Л-изолейцин 20; Л-лейцин 60; Л лизина хлорид 70; Л-метионин 15; Л-фенилаланин 25; Л-пролин 40; Л-серин 25; Л-треонин 30; Л-триптофан 10; Л-тирозина двунатриевая соль - 49,72; Л-валин 25; Л-аскорбиновая кислота 0,05; биотин 0,01; кальциферол 0,1; Д-кальция пантотенат 0,01; холина хлорид 0,5; фолиевая кислота - 0,01; и-инозитол 0,05; менафтона натрия бисульфат трехводный 0,019; никотиновая кислота 0,025; никотинамид 0,025; пара-амино-бензойная кислота 0,05; пиридоксальхлорид 0,025; пиридоксинхлорид 0,025; рибофлавин 0,01; тиамина хлорид 0,01; Д-Л-токоферола фосфата двунатриевая соль 0,01; витамина А-ацетат 0,1147; кальция хлорид двухводный 185,5; железа нитрат девятиводный 0,01; калия хлорид 400; калия дегидроортофосфат 60; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 8000; натрия гидроортофосфат 47,5; аденина сульфат 10; 5-АМФ 0,2; АТФ двунатриевая соль 10; холестерол 0,2; 2-дезоксирибоза 0,5; Д-глюкоза 1000; гуанина хлорид - 0,3; гипоксантин 0,3; Д-рибоза 0,5; натрия ацетата 36,71; натриевая соль фенола красного 17; тимин 0,3; твин 80-5; урацил 0,3; ксантин 0,3.

Среда Хэма F-10 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 8,91; Л-аргинина хлорид 210,7; Л-аспарагин 1-водный - 15,01; Л-аспарагиновая кислота 13,31; Л-цистеина хлорид 31,53; Л-глютаминовая кислота 14,71; Л-глютамин 146,2; глицин 7,51; Л-гистидина хлорид одноводный 20,96; Л-изолейцин 2,62; Л-лейцин 13,12; Л-лизин 29,3; Л-метионин 4,48; Л-фенилаланин 4,96; Л-пролин 11,51; Л-серин 10,5; Л-треонин 3,57; Л-триптофан 0,61; Л-тирозина натриевая соль 2,25; Л-валин 3,51; биотин 0,024; Д-кальция пантотенат 0,715; хлорид холина 0,698; фолиевая кислота 1,32; и-инозитол 0,541; никотинамид 0,611; пиридоксин-хлорид 0,206; рибофлавин 0,376; тиамина хлорид 1,012; витамин В12 1,36; кальция хлорид двухводный 44,1; сульфат меди пятиводный 0,0025; сульфат железа семиводный 0,8346; хлорид калия - 285; калия дегидрофосфат 83; магния сульфат семиводный 152,7; натрия хлорид 7400; натрия гидроортофосфат 156,2; цинка сульфат семиводный 0,0288; Д-глюкоза 1100; гипоксантин 4,08; липоевая кислота 0,206; натриевая соль фенола красного 12; натрия пируват 110; тимидин 0,727.

Среда Дюльбекко-Игла имеет следующий состав, мг/л: Л-аргинин 84; Л-цистина двунатриевая соль 56,78; Л-глютамин 584; глицин 30; Л-гистидина хлорид одноводный 42; Л-изолейцин 104,8; Л-лейцин 104,8; Л-лизина хлорид 146,2; Л-метионин 30; Л-фенилаланин - 66; Л-серии 42; Л-треонин 95,2; Л-триптофан 16; Л-тирозина двунатриевая соль 89,5; Л-валин 93,6; Д кальция пантотенат 4; холина хлорид 4; фолиевая кислота 4; и-инозитол 7; никотинамид 4; пиридоксаль-хлорид 4; рибофлавин 0,4; тиамина хлорид 4; кальция хлорид двухводный 264,9; нитрат железа девятиводный 0,1; калия хлорид 400; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 6400; натрия бикарбонат 3700; натрия дигидроортофосфат двухводный 141,3; Д-глюкоза 4500; натриевая соль фенола красного 15; натрия пируват 110.

Фосфоглив (рег. №: Р N002528/02), содержит фосфолипиды (липоид С100) 500 мг, натрия глицирризинат (тринатриевая соль глицирризиновой кислоты) 200 мг; Вспомогательное вещество: мальтоза - 1800 мг.

Выбор сред объяснялся уязвимостью эндотелиальных клеток, относящихся к глиальной ткани. Наиболее оптимальным является выбор трех сред - среда 199, среда Хэма F-10 и среда Дюльбекко-Игла, в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.

Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращается механическое повреждение и десквамация клеток эндотелия роговицы в процессе гипотермической консервации донорского материала.

Декстран с молекулярной массой 40000 D относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, таким образом, подобранный в заявленной концентрации, создает в среде онкотическое давление равное 320 мосм/л, при котором предотвращается процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговицы в процессе длительной гипотермической консервации.

Для предотвращения роста патогенной микрофлоры добавлены: гентамицин-сульфат, оказывающий бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.

Фосфоглив - комбинированное средство. Препарат оказывает мембраностабилизирующее действие и способен восстанавливать клеточные и внутриклеточные мембраны, их структуру и функции при повреждении, оказывать цитопротекторный эффект, нормализовать белковый и липидный обмены. Дополнительно обладает антиоксидантной и противовирусной активностью.

Заявленное средство для консервации донорской роговицы благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях восстанавливает клеточные мембраны (мембрановостанавливающее действие) и обладает мембранопротективным действием.

В результате этого создаются условия для повышения жизнеспособности трансплантата роговицы и пролонгирования сроков консервации донорской роговицы для задней послойной кератопластики.

Это подтверждает морфометрическое и ультраструктурное исследование 32 роговиц от 16 доноров, полученных из Глазного банка МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова. Были сформированы три группы: опытная и две контрольные, при этом роговицы из опытной группы (правые) (n=16) от каждого донора подвергались консервации в заявленном средстве, а парные роговицы (левые) составляли контрольные группы: группа I - (n=8) помещалась в средство для консервации роговицы, полученное по патенту №2450515, остальные - группа II (n=8) - в среду, полученную по патенту №2069951. Все роговицы подвергались гипотермической консервации при 4-8°C в течение одних (n=4), двух (n=4), шести (n=4) и девяти (n=4) суток. Для оценки состояния мембран клетки и ее органелл использовалась трансмиссионная электронная микроскопия на электронном микроскопе (JEM 1200 EX II, Япония). Подсчет плотности эндотелиальных клеток проводился с помощью кератоанализатора для Глазных банков (модель 98, «Canon», Япония). Оценка на некроз проводилась с помощью окраски йодидом пропидия, с использованием конфокального лазерного сканирующего биологического микроскопа (FLUOVIEW FV10i, OLYMPUS Corporation, Япония).

При трансмиссионной микроскопии эндотелиальных клеток донорских роговиц разница между опытной и контрольными группами была отмечена уже на первые сутки эксперимента: в опытной группе наблюдалось уплотнение не только наружных клеточных, но и внутриклеточных мембран, с усилением эффекта на вторые сутки и сохранением его до шести суток консервации. В образцах опытной группы на девятые сутки были обнаружены участки начального повреждения внутриклеточных, в частности митохондриальных мембран эндотелиальных клеток донорских роговиц. На Фигуре 1 и 2 представлена трансмиссионная электронная микроскопия ультраструктуры эндотелиальных клеток роговиц на девятые сутки гипотермической консервации опытной группы при увеличении 10000х и 20000х, соответственно.

При этом в контрольных группах наблюдалось постепенное истончение и повреждение клеточных мембран, начиная с первых суток, выявлены грубые ультраструктурные изменения с паренхиматозной дегенерацией, то есть осаждением клеточных белков в матриксе цитоплазмы эндотелиальной клетки роговицы, что является проявлением необратимых клеточных процессов. На фигуре 3 и 4 представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из контрольной группы II на девятые сутки консервации при увеличении 10000х и 20000х, соответственно.

При оценке морфометрических характеристик выявлено, что за 9 суток консервации потеря плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной группе составила - 2,7%, в контрольной группе I - 5,1%, а контрольной группе II - 7,2%. На фигуре 5 представлена динамика изменения плотности эндотелиальных клеток в группах сравнения.

При анализе потери эндотелиальных клеток в связи с развитием некроза обнаружено, что количество поврежденных клеток увеличивалось постепенно. К девяти суткам консервации в опытной группе достигало - 3,1%, в контрольной группе I - 6,4%, а в контрольной группе II - 9,8%. На фигуре 6 представлена динамика потери эндотелиальных клеток донорских роговиц в связи с развитием некроза в опытной и контрольных группах на 1, 2, 6 и 9 сутки консервации.

Средство для консервации роговицы получают следующим образом: в условиях ламинарной комнаты в химически чистую и стерильную мерную колбу сливают вместе две среды: 25 мл среды 199 и 25 мл среды Хэма F-10. Далее последовательно вносят 0,00014 г гентамицин-сульфата, 0,00015 амфотерицина В. Состав разделяют на две равные части по 25 мл и растворяют в первой части 6-7 г декстрана-40, а во второй части 0,5 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения указанных компонентов растворы оставляют до полного набухания на 80-120 минут, после чего полностью растворяют. Затем оба раствора сливают вновь вместе в мерную колбу, и добавляют среду Дюльбекко-Игла до метки 100 мл. Затем средство подвергают префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, средство без добавления Фосфоглива разливают во флаконы, с одновременной «Глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Флаконы укупориваются стерильными крышками и помещаются в холодильник для хранения при температуре 4-8°C. Фосфоглив вносят непосредстенно перед использованием в соотношении 0,025-0,05 мас. %.

Использование предлагаемого средства для хранения донорской роговицы в Глазном банке ФГАУ МНТК «Микрохирургия глаза» позволило повысить жизнеспособность трансплантата роговицы путем восстановления клеточных и внутриклеточных мембран и пролонгировать сроки консервации за счет сохранения плотности эндотелиальных клеток, как для сквозной, так и для послойной кератопластики.