ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УКОРЕНЕНИЯ ПОБЕГОВ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала при помощи методов клонального микроразмножения.

Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для укоренения ягодных и плодовых растений in vitro (Алексеенко Л.В. Подбор питательных сред для клонального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники. / Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М., 1997. - Т. IV. - C. 77-82, Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях. / Шипунова А.А., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М, 2001. Т. VII. С. 158-163).

Наиболее часто для укоренения побегов, полученных в культуре in vitro, исследователи используют половину макро- и микросолей по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS ½), (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497).

Для наиболее эффективного ее применения исследователи практически всегда оптимизируют ее состав, изменяя гормональный фон или вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, препаратов нового поколения (Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники/ Белошапкина О.О., Жаркова И.В. // Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С. 284-289). Значительно реже исследователи изменяют минеральный состав и, как правило, незначительно.

При этом следует отметить, что минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (MS) плохо подходит для укоренения побегов, полученных in vitro, так как среда разрабатывалась для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде неоптимальные относительно потребности в них микрорастений винограда, что в процессе культивирования приводит к дисбалансу минеральных солей, сдвигу pH питательной среды и как следствие ухудшает параметры развития микрорастений винограда.

Наиболее часто применяемая среда для укоренения (MS ½) содержит следующие компоненты мг/л: NH₄NO₃ - 825; KNO₃ - 950; KH₂PO₄ - 85; MgSO₄*7H₂O - 185 мг/л, CaCl₂ - 220; FeSO₄*7H₂O - 13,4-13,8; Na₂ ЭДТА 2Н₂O - 18,5-18,9; Н₃ВO₃ - 3,0-3,2; MnSO4*4H₂O - 11,0-11,4; ZnSO₄*7H₂O - 4,1-4,5; KJ - 0,40-0,44; Na₂MoO₄ - 0,11-0,15; CuSO₄*5H₂O - 0,011-0,015; CoCl₂⋅6H₂O - 0,011-0,015; миоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2-0,3; аскорбиновая кислота 0,4-0,6; ИМК - 0,5-1,5; сахароза - 14000-16000; агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,5-5,9.

Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда - Н2, разработанная для укоренения побегов винограда, полученных на этапе пролиферации (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда/ВНИИВиПП «Магарач» (П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев), ИФР АН СССР (Р.Г. Бутенко), ИФР АН УССР (Б.А. Левенко), и др. - Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с.).

Прототип питательной среды содержит следующие компоненты мг/л: NH₄NO₃ - 210; KNO₃ - 717; KH₂PO₄ - 68; MgSO₄*7H₂O - 233 мг/л, CaCl₂ - 356; FeSO₄*7H₂O - 7,0; Na₂ ЭДТА^⋅2Н₂O - 9,3; Н₃ВO₃ - 1,6; MnSO4*4H₂O - 6,0; ZnSO₄*7H₂O - 2,2; KJ - 0,21; Na₂MoO₄ - 0,06; CuSO₄*5H₂O - 0,006; CoCl_2⋅6H₂O - 0,006; миоинозит - 50; никотиновая кислота - 0,2; ИУК - 0,1; феруловая кислота - 1,0; сахароза - 1000; агар - 7500; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,6-5,8.

Недостатками данной среды для укоренения являются высокое содержание хлора, несбалансированность элементов по магнию и фосфору, а также низкое содержание хелата железа и микроэлементов (1/4 прописи МС), что при укоренении побегов негативно сказывается на регенерации корней и последующем развитии побегов и листьев. Кроме того, несбалансированное содержание макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани и преждевременное старение эксплантов.

Задача, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных побегов и преодоление сортовой специфики виноградного растения на этапе укоренения.

Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией концентрации и соотношением макросолей, входящих в состав питательной среды: NH₄NO₃ уменьшается до 150 мг/л; KNO₃ - 750 мг/л; уровень содержания фосфора в среде возрастает в два раза, при этом KH₂PO₄ заменяется на NaH₂PO₄ -140 мг/л; MgSO₄⋅7H₂O - 220 мг/л, основным источником кальция в среде становиться Ca(NO₃)₂⋅4H₂O - 400 мг/л; CaCl₂ - 25 мг. Остальные компоненты питательной среды добавляются в следующем количестве мг/л: FeSO₄⋅7H₂O - 27,8÷30,0; Na₂ЭДТА⋅2Н₂O - 37,3÷40,0; Н₃ВO₃ - 6,0÷6,4; MnSO4⋅4H₂O÷22,0-22,6; ZnSO4⋅7H₂O - 8,0÷9,2; KJ 0,80÷0,90; Na₂MoO4 - 0,2÷0,3; CuSO₄⋅5H₂O - 0,02÷0,03; CoCl₂⋅6H₂O - 0,02÷0,03; миоинозит - 50÷70; тиамин, пиридоксин, по 0,2÷0,5; в качестве ауксина добавляется ИМК или ИУК - 0,1÷0,2; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000; pH - 5,6÷5,8.

Заявленное решение отличается от прототипа и (1/2 МС) не только меньшим содержанием солей NH₄NO₃ и CaCl₂, но и заменой фосфорнокислого калия на фосфорнокислый натрий. На Фиг. 1 представлены сравнительные характеристики разработанной питательной среды и прототипа по концентрации макроэлементов по действующему веществу (д.в.).

Заявленное решение отличается от прототипа и наиболее часто применяемой среды ½ МС тем, что: в 1,5 и 4,0 раза соответственно снижено содержание аммиачной формы азота, в 14,6 и 8,8 раза снижено содержание хлора, источник фосфора KH₂PO₄ заменен на NaH₂PO₄, при этом являясь источником Na, эта соль способствует повышению буферности питательной среды, предотвращая снижение ее pH. Изменен основной источник кальция в среде с CaCl₂ на Ca(NO₃)₂*4H₂O. Кроме того, хелат железа и микроэлементы в предлагаемой среде даны по прописи МС в полном объеме. Все это положительно влияет на укоренение побегов и рост образовавшихся микрорастений в культуре in vitro. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

Заявленное решение обладает изобретательским уровнем, так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности автора изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - промышленному применению, что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.

Пример осуществления способа

В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг), макроэлементы: NH₄NO₃ - 150; KNO₃ - 750; NaH₂PO₄⋅140; MgSO₄⋅7H₂O - 220, Ca(NO₃)₂⋅4H₂O - 400; CaCl₂ - 25; Мезоэлементы: FeSO₄⋅7H₂O - 27,8-30,0; Na₂ЭДТА⋅2H₂O - 37,3-40,0; микроэлементы: H₃BO₃ - 6,0-6,4; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,6; ZnSO₄⋅7H2O - 8,0-9,2; KJ - 0,80-0,90; Na₂MoO₄ - 0,2-0,3; CuSO₄⋅5H₂O - 0,02-0,03; CoCl₂⋅6H₂O - 0,02-0,03; витамины: миоинозит - 50-70; тиамин и пиридоксин, по 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.

В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают pH 5,6-5,8 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм. (температура 119-121°C) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку срезанных с этапа пролиферации побегов.

Испытание разработанной прописи питательной среды показало эффективность ее применения на всех сортах, учувствовавших в испытании. Влияние разработанной питательной среды, для укоренения срезанных с пролиферации побегов, на их рост и развитие через 70 дней, 2016 г. представлено в Табл. 1

Как видно из представленных данных в варианте, где для укоренения побегов примененяли разработанную пропись питательной среды, укореняемость микропобегов была лучше, стабильно улучшалось их развитие, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития. При этом положительный эффект получен на всех подопытных сортах. Особенно заметный эффект был на сортах, которые при использовании прототипа регенерировали слабо, проявляя сортовую специфичность.

Таким образом, установлено, что заметное снижение концентраций некоторых макросолей (NH₄NO₃, CaCl₂), с одновременной оптимизацией их соотношений в питательной среде с другими макросолями, замена соли KH₂PO₄ на NaH₂PO₄ на фоне применения стандартной (не уменьшенной) прописи микроэлементов и хелата железа по Мурасиге и Скуга, заметно повышает процессы регенерации и развития микрорастений на этапе укоренения побегов.

Использование предложенной питательной среды для укоренения микропобегов винограда в условиях in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:

1. Повышает количество укоренных побегов винограда in vitro, срезанных с этапа пролиферации, и соответственно выход укорененных микрорастений в среднем на 20,0-30,0%. Соответственно снижает количество отбракованных эксплантов из-за некроза и отсутствия развития.

2. Заметно улучшает развитие микрорастений винограда, ростовые процессы при этом ускоряются минимум в два раза.

3. В разработанной питательной среде для достижения значительного положительного эффекта предусмотрено использование стандартных и общепринятых (в клональном микроразмножении растений) компонентов и не требуется дополнительно применение редких или малоизученных физиологически активных веществ.