Результат интеллектуальной деятельности: Штамм "ВН-3" вируса гепатита утят типа I рода Avihepatovirus семейства Picornaviridae для производства вакцинных препаратов и диагностических наборов

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а точнее к производству вакцинных препаратов против вирусного гепатита утят типа I и может быть применено для изготовления диагностических наборов.

Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ-I) - малоизученная сверхострая контагиозная болезнь утят до 6-недельного возраста и латентно протекающая у уток, характеризующаяся преимущественным поражением печени и высокой смертностью среди молодняка от 30 до 95% [1, 3, 4, 5, 6, 7]. Экономический ущерб, причиняемый ВГУ-I, складывается из убытков гибели и выбраковки птицы, потери мясной продуктивности, нарушения племенной работы и затрат на проведение оздоровительных мероприятий. В настоящее время болезнь распространена по всему миру и включена МЭБ в перечень особо опасных болезней Санитарного кодекса наземных животных (2010).

Возбудитель ВГУ-I - РНК - содержащий вирус, принадлежащий к роду Avihepatovirus семейства Picornaviridae [8].

Важным средством борьбы против вирусного гепатита утят типа I, заболевания причиняющего значительный ущерб промышленному утководству, является вакцинопрофилактика. Технология производства вакцин предусматривает лиофилизацию препарата, воздействие химического агента, поэтому штамм вируса должен обладать выраженной устойчивостью к действию температурных факторов и процессу инактивации, не изменяя при этом антигенную структуру вируса.

В качестве прототипа выбран штамм «КМИЭВ-16» вируса гепатита утят [2]. Штамм выделен от утят 10 - суточного возраста при остром течении вирусного гепатита утят на 11-12 - суточных утиных эмбрионах при инокуляции суспензии в аллантоисную полость. Штамм вызывает гибель утиных эмбрионов, отставание в росте и развитии зародыша, нарушение его гемодинамики, воспалительно-дегенеративные изменения в печени и сердечной мышце. Штамм индуцирует цитопатический эффект литического типа в культуре клеток утиных эмбрионов. Физико-химические, биологические и морфологические маркеры прототипа представлены в табл.1.

В Республике Беларусь указанный штамм используется для производства аттенуированной вакцины против вирусного гепатита утят типа I [4]. Однако, штамм приведенного прототипа уступает по биологической и антигенной активности.

Задачей изобретения является получение вакцинного штамма вируса гепатита утят типа I, обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью, как до и после инактивации, в сочетании со способностью к высокому уровню репродукции в культуре клеток и утиных эмбрионах, отсутствием реактогенности для утят и сохранением термоустойчивости.

Поставленная задача достигается штаммом «ВН-3» вируса гепатита утят типа I рода Avihepatovirus семейства Picornaviridae для производства вакцинных препаратов и диагностических наборов, депонированным в Государственной коллекции вирусов в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, ФГБНУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России под №2859.

Вакцинный штамм адаптирован к утиным эмбрионам и культуре клеток утиных фибробластов, при этом сохраняет патогенность для эмбрионов и иммуногенность для утят.Штамм «ВН-3» соответствует по антигенной специфичности в 98% случаев эталонному и эпизоотическим изолятам вируса гепатита, циркулирующим в РФ.

Характеристика штамма «ВН-3»

Морфологическая характеристика

Вирионы сферической формы, размером 30-40 нм, нуклеокапсид содержит РНК.

Патогенные свойства

В опытах по определению патогенности заявляемого штамма использовали 11-12 - суточные утиные эмбрионы и утят 2 - суточного возраста. Утиные эмбрионы инфицировали в аллантоисную полость в дозе 3,0 lg ЭЛД₅₀/0,2 см³, а утят внутримышечно, подкожно и интранозально в дозе 3,0 lg ЭЛД₅₀/0,2 см³. Эмбрионы инкубировали в течение 72 часов при температуре (37±0,5)°С и относительной влажности 60-70%. За утятами наблюдали в течение 30 сут.

Результаты изучения патогенности штамма «ВН-3» для утиных эмбрионов представлены в табл. 2, а утят в табл. 3.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что при инокуляции в аллантоисную полость вируса гепатита штамма «ВН-3» вызывает 70-80% гибели утиных эмбрионов.

Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что штамм «ВН-3» не вызывает гибель и клиническое проявление болезни у утят.

Репликация в культуре клеток

Штамм репродуцируется в культуре утиных фибробластов и клетках почки утиного эмбриона, вызывая острую форму инфекции с выраженным цитопатическим эффектом через 72 - 96 часов и 48 - 72 часа соответственно и накапливается в титрах 4,5±0,25 и 5,75±0,3 lg ТЦД₅₀/СМ³.

Терморезистентность

Штамм «ВН-3» термостабилен. Константа скорости инактивации (lgK=2,3V_t/V_O:t) при температуре 56°С в течение 60 мин равняется 2,8 10^-2lg.

Устойчивость к химическим агентам

Штамм «ВН-3» вируса гепатита не чувствителен к инактивирующему действию (20% конечная концентрация) эфира и хлороформа. Формальдегид в 0,1% концентрации при 37°С в течение 24 часов инактивировал инфекционную активность штамма с кинетической скоростью равной 5,9×10^-4lg/ч.

Стерильность

Штамм «ВН-3» вируса гепатита свободен от контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и другими вирусами.

Антигенная активность

Штамм «ВН-3» вируса гепатита индуцирует у утят выработку штаммспецифических вируснейтрализующих антител, а инактивированный вируссодержащий материал в адъювантной форме, введенный парентерально утятам, инициирует синтез антител в высоких титрах, регистрируемых в реакции нейтрализации (РН) и иммуноферментном анализе (ИФА), табл. 4.

Стабильность

Штамм «ВН-3» стабилен, его свойства сохраняются неизменными в течение 10 пассажей в культуре клеток и на утиных эмбрионах.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования:

Пример 1. Получение антигена.

Вируссодержащий материал разводили до оптимальной заражающей дозы, равной 3,0 lg ЭЛД₅₀/0,2 см³. Инокулировали 11-12 - суточные утиные эмбрионы в аллантоисную полость в оъеме 0,2 см³. Инфицированные эмбрионы инкубировали в термостате при температуре (37,0±0,5)°С и относительной влажности 60-70% в течение 72 ч. Овоскопирование проводили два раза в сутки. Эмбрионы, погибшие в течение 24 часов после заражения, выбраковывали, а павшие эмбрионы в последующие сутки хранили в холодильнике при температуре 4-6°C.Охлажденные эмбрионы вскрывали в асептических условиях, а хориоаллантоисную жидкость и зародышей собирали во флаконы емкостью 250-450 см³. Вируссодержащий материал гомогенизировали при 3000-5000 об/мин и центрифугировали при 3000 оборотов в течение 30 минут. Надосадочную жидкость проверяли наотсутствие контаминации высевами на среды: МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом и бульон Сабуро, а также на биологическую активность штамма вируса. Вируссодержащий материал с активностью не ниже 6,5-7,0 lg ЭЛД₅₀/СМ³ хранили при температуре минус 20°С и использовали для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Пример 2. Изготовление инактивированной вакцины.

Для приготовления инактивированной эмульгированной вакцины против вирусного гепатита утят типа I использовали штамм «ВН-3», полученный по методике, указанной в примере 1. Инактивацию вируссодержащего материала проводили теотропином (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазациклодекан) в конечной концентрации 0,15% в течение 24 ч при температуре (37,0±0,5)°Си постоянном перемешивании. Контроль полноты инактивации вируса проводили методом трех последовательных пассажей на развивающихся утиных эмбрионах.

Эмульсию получали методом гомогенизации водного и масляного компонентов в соотношении 30:70 с помощью гомогенизатора Ultraturrax-T-25. В качестве масляной фазы использовали адъювант MontanidISA 70 фирмы «SEPPIC». Полученную вакцину контролировали на стерильность, стабильность эмульсии, безвредность и антигенную активность.

Пример 3. Определение антигенной активности вакцины.

Для изготовления инактивированной вакцины использовали вируссодержащий материал с биологической активностью равной 6,5 lg ЭЛД₅₀/СМ³, определенной до инактивации. Утки взрослые в количестве 20 голов были разделены на 2 группы по 10 голов в каждой. Подопытные утки в количестве 10 голов вакцинировали подкожно в среднюю треть шеи в объеме 0,5 см³. Утки - 10 голов оставили в качестве контроля. Титр антител к вирусу гепатита в сыворотках крови определяли через 28 суток после вакцинации методом ИФА. Вакцину считали антигенно активной, если титры специфических антител к вирусу гепатита утят типа I были не ниже 10log₂ при отсутствии антител в сыворотках крови у уток в контрольной группе.

Заявленный штамм «ВН-3» вируса гепатита утят типа I обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, найдет широкое применение в промышленном утководстве в качестве основного компонента вакцинных препаратов против вирусного гепатита утят типа I и в изготовлении диагностических наборов ИФА для контроля напряженности иммунитета.

Источники информации

1. Бубашко О.А. Вирусный гепатит утят в Республике Беларусь и его профилактика / О.А. Бубашко // Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. - 2005 а. - №1. - С.25-28.

2. Бубашко О.А. Физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства штамма КМИЭВ-16 вируса гепатита утят: Автореф. дис... канд. вет.наук: спец. 16.00.03 /О. А. Бубашко/ Ин-т экспер.вет.им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2005. - 19 с.

3. Князев В.П. Болезни водоплавающих птиц: монография / В.П. Князев // Владимир, 2010. - 160 с.

4. Курилович A.M. Иммуноморфогенез у утят, вакцинированных против вирусного гепатита, и влияние на него натрия тиосульфата: автореферат дис... канд. ветеринар, наук. / А. М. Курилович. - Витебск, 2003. -20 с.

5. Паникар И.И. Вирусный гепатит утят: эпизоотология, диагностика и специфическая профилактика / И.И. Паникар // Пробл. зооинженерии и вет.мед.: сб. науч. статей, повящ. 150-летию со дня основания Харьковского зооветеринарного ин-та. - Харьков, 2001. -Вып.9 (33). - Ч. 1. - С.24-27.

6. Kim М.С.Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) and multiplex polymerase chain reaction / M.C. Kim, Y. K. Kwon, S.J. Joh [et al.] // Avian Pathology. - 2008. - V. 37. - P. 171-177.

7. Kim M.C. Development of duck hepatitis A virus type 3 vaccine and it's use to protect ducklings against infections / M.C. Kim, M.J. Kim, Y.K. Kwon [et al.] // Vaccine. - 2009. - V. 27. - P. 6688-6694.

8. Tseng C.H, Knowles N.J., Tsai H.J. Molecular analysis of duck hepatitis virus type I indicates that it should be assigned to a new genus/C. H. Tseng, N.J. Knowles, H.J. Tsai// Virus Research. - 2007, - V. 123. - 190-203.