Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО УЧЕТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В СМЕСИ В ПИЩЕВОМ ПРОДУКТЕ

Настоящее изобретение относится к дифференциации и подсчету исследуемых бактериальных штаммов, присутствующих в смеси в пищевом продукте, особенно молочном продукте.

В производстве ферментированных продуктов, и особенно молочных продуктов, смеси бактерий, которые могут составлять бактерии различных родов и/или бактерии одного рода и различных видов или подвидов, и/или различные штаммы бактерий того же вида или подвидов, обычно используют в качестве закваски. В частности, пробиотические продукты обычно включают, кроме одного или более пробиотических штаммов, один или более "технологических" штаммов, которые не обязательно имеют пробиотические свойства но способны, например, улучшать рост пробиотических штаммов и/или позволяют придавать желаемые свойства (аромат, текстура и др.) конечному продукту.

Чтобы гарантировать качество ферментированных продуктов во время их производства, в конце их производства и в течение их хранения, необходимо быть способными специфически дифференцировать и подсчитывать пробиотические и технологические штаммы, присутствующие в таких продуктах, что может быть проблематичным особенно в случаях, в которых, по меньшей мере, два штамма, используемые в продукте, принадлежат к соседним видам того же рода, или к одним видам или даже к одним подвидам.

Следовательно, желательно иметь надежные и быстрые аналитические технологии, которые позволят дифференциально подсчитывать такие штаммы.

Авторы изобретения разработали способ на основе использования селективной культуральной среды и/или селективных условий культивирования, в комбинации с применением различных хромогенных субстратов.

Следовательно, задачей настоящего изобретения является способ отличия одного от другого и подсчета штаммов молочнокислых бактерий или бифидобактерий известной смеси, которые присутствуют в различных популяционных количествах в пищевом продукте, предпочтительно молочном продукте, ферментированном с использованием указанных штаммов, отличающийся тем, что он включает:

a) инокуляцию аликвот необязательно разведенного пищевого продукта в серии культуральных чашек, содержащих химически определенную агаровую среду M1 и по меньшей мере два хромогенных субстрата, дающие различные окраски, каждый из указанных субстратов потребляется по меньшей мере одним из указанных бактериальных штаммов и не потребляется по меньшей мере другим из указанных штаммов;

b) необязательно, инокуляцию аликвот необязательно разведенного пищевого продукта в серии культуральных чашек, содержащих химически определенную агаровую среду M2, позволяющую рост штаммов молочнокислых бактерий, присутствующих в тестируемом продукте, указанные штаммы не могут расти на среде M1, и по меньшей мере один хромогенный субстрат, потребляемый по меньшей мере одним из указанных бактериальных штаммов;

c) инкубацию указанных чашек в течение времени, необходимого для образования бактериальных колоний, и подсчет колоний для каждой из окрасок, наблюдаемых в каждой культуральной чашке.

В описании изобретения выражение "молочнокислые бактерии или бифидобактерии" предпочтительно относится ко всем анаэробным, частично кислород-толерантным грам-положительным бактериям, которые обычно не продуцируют споры, такие бактерии находятся в форме палочки или кокка и способны ферментировать сахара до молочной кислоты. Более предпочтительно, молочнокислые бактерии в рамках изобретения принадлежат к, по меньшей мер, одному из семейств Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Streptococcaceae или Bifidobacteriaceae, и еще более предпочтительно к одному из родов Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella или Bifidobacterium. Наиболее часто предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, в рамках настоящего изобретения принадлежат к, по меньшей мере, одному из видов Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckei, в частности L. delbruckei supsb. bulgaricus или lactis, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus mali, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus paracasei, в частности L. paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus vini, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus cremoris, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, или Bifidobacterium longum; бифидобактерии в рамках изобретения объединяют бактерии, принадлежащие к семейству Bifidobacteriaceae, особенно к роду Bifidobacterium.

"Известная смесь" обозначает смесь бактериальных штаммов, известен качественный состав которой, иными словами природа и характеристики различных штаммов, которые ее составляют. Это относится более специфически к смеси штаммов, используемой для получения ферментированного продукта, который анализируют. Перед осуществлением метода в соответствии с изобретением, такие штаммы подвергают фенотипическому анализу с целью освещения их физиологических и метаболических характеристик, так, чтобы установить фенотипический профиль, специфический для каждого штамма. Такой анализ может особенно относиться к применению различных типов источников углерода, азота, фосфата и серы, к применению заданных пищевых добавок и/или к устойчивости к различным стрессовым агентам (соли, pH, антимикробные средства и др.).

Термин "химически определенная среда" используют в настоящем описании в его обычном смысле для обозначения культуральной среды, все компоненты которой полностью известны и определены. Химически определенная агаровая среда по изобретению предпочтительно является агаровой средой для культивирования бактерий, более предпочтительно агаровой культуральной средой для молочнокислых бактерий или бифидобактерий.

В настоящем описании выражение "хромогенный субстрат" предпочтительно обозначает субстрат, потребление которого бактериями дает вещество, которое абсорбирует свет при одной или более длинах волн, особенно окрашенные вещества. Специалист в области техники хорошо понимает, что длина(ы) волн, абсорбируемые продуцируемым веществом, предпочтительно отличаются от таковой(таковых), необязательно абсорбируемых хромогенным субстратом, который может в частности быть бесцветным. Хромогенные субстраты, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, известны как таковые; ими могут быть, в частности, 6-хлор-3-индоксил-β-D-галактопиранозид (лососевый Gal), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид (X-Glu), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal).

Агаровая среда части культуральных чашек может также включать по меньшей мере одну добавку, селективно обеспечивающую рост по меньшей мере одного из указанных бактериальных штаммов, и/или агаровая среда части культуральных чашек может также включать по меньшей мере одну добавку, селективно ингибирующую рост по меньшей мере одного из указанных бактериальных штаммов.

Также, часть культуральных чашек может инкубироваться в селективных условиях, благоприятных для роста по меньшей мере одного из указанных бактериальных штаммов, и другая часть указанных культуральных чашек может инкубироваться в других селективных условиях, благоприятных для роста по меньшей мере одного другого из указанных бактериальных штаммов.

Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для анализа продуктов, в которых по меньшей мере два из присутствующих бактериальных штаммов принадлежат к одним видам или подвидам.

Предпочтительно, по меньшей мере один из бактериальных штаммов, присутствующих в тестируемом продукте, принадлежит к роду Lactobacillus и/или по меньшей мере один из бактериальных штаммов, присутствующих в тестируемом продукте, принадлежит к роду Streptococcus.

В соответствии с частным вариантом осуществления настоящего изобретения, тестируемый продукт содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus. Преимущественно, он также содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus.

В контексте настоящего варианта осуществления изобретения для подсчета бактерий вида Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, и Streptococcus thermophilus, использовали среду M1 со следующим составом: агар: 15 г/л; триптон: 2,5 г/л; пепсин-переваренный мясной пептон: 2,5 г/л; папаин-переваренный соевый пептон: 5 г/л; глицерофосфат натрия: 19 г/л; лактоза: 5 г/л; экстракт дрожжей: 2,5 г/л; мясной экстракт: 5 г/л; сульфат магния: 0,25 г/л; аскорбиновая кислота: 0,5 г/л; 6-хлор-3-индоксил-β-D-галактопиранозид (лососевый Gal): 0,2 г/л; 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид.

Для подсчета бактерий видов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, использовали среду M2 со следующим составом: полипептон: 10 г/л; экстракт дрожжей: 5 г/л; мясной экстракт: 10 г/л; фосфат дикалия: 2 г/л; ацетат натрия: 5 г/л; цитрат аммония: 2 г/л; сульфат магния: 0,2 г/л; сульфат марганца: 0,05 г/л; агар: 15 г/л; 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal): 0,15 г/л.

Преимущественно, для подсчета бактерий видов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, и Streptococcus thermophilus:

- первая часть чашек, содержащих среду M1, не включает каких-либо добавок, вторая часть указанных чашек включает ванкомицин в качестве добавки, и третья часть указанных чашек включает рамнозу в качестве добавки; и/или

- инокулированные чашки инкубировали в течение приблизительно 48 часов в контролируемой атмосфере, содержащей от 6 до 16% O₂ и от 2 до 10% CO₂, часть указанных чашек инкубировали при приблизительно 37°C, и другую часть при приблизительно 44°C.

Предпочтительно, для подсчета бактерий видов Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, инокулированные чашки среды M2 инкубировали в течение приблизительно 48 часов при приблизительно 47°C в контролируемой атмосфере, содержащей менее чем 1% O₂ и, по меньшей мере, 13% CO₂.

Настоящее изобретение будет более понятно посредством следующего дополнительного описания, которое дает ссылки на неограничивающие примеры, иллюстрирующие осуществление способа в соответствии с изобретением для дифференциации различных штаммов молочнокислых бактерий и для подсчета бактерий каждого из таких штаммов в ферментированных молочных продуктах.

ПРИМЕР: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ПОДСЧЕТ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Материалы и методы:

Состав тестируемых продуктов

Продукт 1:

Продукт 1 представляет собой ферментированный продукт, содержащий 5 бактериальных штаммов, принадлежащих к трем видам, а именно:

- 1 пробиотический штамм L. casei subsp. paracasei (далее называемый как Lactobacillus paracasei штамм 1);

- 3 технологических штамма S. thermophilus;

- 1 технологический штамм L. delbrueckii subsp. Bulgaricus.

Теоретическая бактериальная нагрузка, ожидаемая в начале периода хранения (D4) и в конце периода хранения (D35) продукта показана в таблице I ниже.

Продукт 2:

Продукт 2 представляет собой ферментированный продукт, содержащий 7 бактериальных штаммов, принадлежащих к трем видам, а именно:

- 2 пробиотических штамма L. casei subsp. paracasei (Lactobacillus paracasei штамм 1 и Lactobacillus paracasei штамм 2);

- 1 пробиотический штамм L. rhamnosus;

- 3 технологических штамма S. thermophilus;

- 1 технологический штамм L. delbrueckii subsp. Bulgaricus.

Теоретическая бактериальная нагрузка, ожидаемая в начале периода хранения (D4) и в конце периода хранения (D35), продукта показаны в таблице II ниже.

Ферментативная активность штаммов:

Различные штаммы тестировали в отношении их β-глюкозидазной и β-галактозидазной активности.

Результаты показаны в таблице III ниже:

Подсчет бактерий в продуктах 1 и 2:

Условия и среда для культивирования:

Условия и среды для культивирования в настоящее время использованные для подсчета бактериальных штаммов, присутствующих в продуктах 1 и 2, суммированы в таблицах IV и V, соответственно, ниже. Такие контрольные культуральные условия и среды использовали в качестве контроля.

Среды MRS, кислая MRS и M17 являются обычными коммерчески доступными средами (AES CHEMUNEX).

Для культур в контролируемой атмосфере, использовали системы создания газа GasPak^® для получения следующих условий:

- анаэробные условия: %O₂<1%; %CO₂≥13%

- CO₂:%CO₂>2,5%

- микроаэробные условия: 6%<%O₂<16%; 2%<%CO₂<10%

- аэробные условия: окружающий воздух

Получали две хромогенные среды, далее называемые как M1 и M2,: состав таких сред указан в таблицах VI и VII ниже, соответственно:

Тесты проводили с тремя различными партиями каждой из сред M1 и M2.

Условия культивирования, используемые для продуктов 1 и 2 соответственно, показаны в таблицах VIII и IX ниже:

Рабочий протокол:

Образцы получали в двух фазах периода хранения продуктов: начало хранения и конец хранения.

Для продукта 1, исходные образцы начала хранения получали на 4, 5 и 6 дни после получения ферментированного продукта и образцы конца периода хранения получали в 31, 32 и 33 дни после производства; для продукта 2, образцы начала хранения получали в 7, 8 и 9 дни после производства и образцы конца хранения получали в 28, 29 и 30 дни после производства.

Для каждого тестируемого образца диапазон разведений до 1/10 проводили в пробирках триптоновой соли. Три разведения, выбранные как функция теоретических популяций (см. таблицы I и II), инокулировали на каждой из используемых сред. Для каждого разведения, 1 мл разведенного продукта инокулировали в 1 чашку Петри и 15 мл используемой среды вливали в чашку.

Чашки инкубировали в условиях и в течение продолжительности времени, указанных в таблицах IV, V, VIII и IX.

Результаты

Идентификация штаммов:

На среде M1:

- при 44°C, штамм Lactobacillus rhamnosus продуцирует колонии синего цвета и штаммы Streptococcus thermophilus продуцируют колонии пурпурного цвета; штаммы Lactobacillus paracasei 1 и 2 и штамм Lactobacillus bulgaricus не растут;

- при 37°C с добавлением рамнозы штамм Lactobacillus rhamnosus и штамм Lactobacillus paracasei 2 продуцируют бесцветные колонии; штамм Lactobacillus paracasei 1 продуцирует колонии бирюзового цвета и штаммы Streptococcus thermophilus продуцируют колонии пурпурного цвета. Штамм Lactobacillus bulgaricus не растет;

- при 37°C с добавлением ванкомицина штамм Lactobacillus rhamnosus продуцирует синие колонии; штамм Lactobacillus paracasei 1 продуцирует колонии бирюзового цвета и штамм Lactobacillus paracasei 2 продуцирует бесцветные колонии; штаммы Streptococcus thermophilus и штамм Lactobacillus bulgaricus не растут.

На среде M2:

- штамм Lactobacillus rhamnosus продуцирует бесцветные колонии и штамм Lactobacillus bulgaricus продуцирует синие колонии. Штаммы Streptococcus thermophilus и штаммы Lactobacillus paracasei 1 и 2 не растут.

Полученные результаты суммированы в таблице X ниже:

Продукт 1:

M1 среда, следовательно, позволяет подсчитать Lactobacillus paracasei и Streptococcus thermophilus, и среда M2 позволяет подсчитать Lactobacillus bulgaricus.

Продукт 2:

M1 среда, следовательно позволяет подсчитать:

- при 44°C: Lactobacillus rhamnosus и Streptococcus thermophilus

- с добавлением рамнозы при 37°C: Lactobacillus paracasei штамм 1;

- с добавлением ванкомицина при 37°C: Lactobacillus paracasei штамм 2.

M2 среда позволяет подсчитать Lactobacillus bulgaricus.

Бактерии, считающие бактерии:

Продукт 1:

Рано в периоде хранения:

Результаты проиллюстрированы в таблице XI.

Вариабельность метода подсчета была следующая:

-на среде M1: между 5,7×10⁸ КОЕ/мл и 6,2×10⁸ КОЕ/мл для L.paracasei 1, между 5,3×10⁸ КОЕ/мл и 6,8×10⁸ КОЕ/мл для S. thermophilus,

- на среде M2: между 2,8×10⁶ КОЕ/мл и 3×10⁶ КОЕ/мл для L.bulgaricus.

Затруднения в подсчете L. bulgaricus на контрольной среде кислой MRS, необходимо отметить:

- день 5: различие на один log относительно среды M2 и количества с D4,

- день 6: отсутствие роста.

Конец периода хранения:

Результаты проиллюстрированы в таблице XII.

M1 среда позволяет эффективно различить Lactobacillus paracasei и Streptococcus thermophiles, присутствующие в продукте. Количество для L. paracasei варьируется между 4×10⁸ КОЕ/мл и 4,5×10⁸ КОЕ/мл по трем партиям и в течение трех дней анализа. Нагрузка S.thermophilus варьируется между 1,9×10⁸ КОЕ/мл и 2,2×10⁸ КОЕ/мл.

Такие тесты также демонстрируют отсутствие L. bulgaricus в продукте на этой стадии хранения, или на референсной среде или на среде M2.

Продукт 2:

Рано на стадии хранения:

Результаты проиллюстрированы в таблице XIII.

Вариабельность метода подсчета была следующая:

- на среде M1: между 1,6×10⁸ КОЕ/мл и 1,8×10⁸ КОЕ/мл для L.paracasei 1, между 2,3×10⁷ КОЕ/мл и 3×10⁷ КОЕ/мл для L.paracasei 2, между 8,7×10⁸ КОЕ/мл и 9,8×10⁸ КОЕ/мл для S.thermophilus, 2,3×10⁸ КОЕ/мл для трех партий L.rhamnosus

- на среде M2: между 2,6×10⁵ КОЕ/мл и 5×10⁵ КОЕ/мл для L.bulgaricus.

Конец периода хранения:

Результаты проиллюстрированы в таблице XIV.

Количество по трем партиям среде M1 варьировалось между 1,5×10⁸ КОЕ/мл и 1,6×10⁸ КОЕ/мл для L.paracasei 1, между 1,4×10⁷ КОЕ/мл и 2,2×10⁷ КОЕ/мл для L.paracasei 2, между 6,6×10⁸ КОЕ/мл и 7,5×10⁸ КОЕ/мл для S.thermophilus, 2,0×10⁸ КОЕ/мл для трех партий L.rhamnosus.

Тесты также демонстрируют отсутствие L. bulgaricus в продукте на этой стадии хранения, и на референсной среде и на среде M2.

Применение способа, описанного выше, позволяет различить три бактериальных штамма, присутствующие в продукте 1, и четыре, присутствующие в продукте 2.