Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной терапии и касается получения из Вартонова студня пуповины человека биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток однородной клеточной популяции. Изобретение может найти применение в медицине для лечения различных заболеваний.

В настоящее время клеточная терапия находит все более широкое применение в медицине. Путем трансплантации стволовых клеток успешно лечат различные заболевания, такие, как остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005), выращивают органы для трансплантации, изготавливают фармпрепараты из их дериватов.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) нередко используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста.

Обычно МСК получают из костного мозга, (патент 2303632) хотя их можно выделять из фетальных органов гемопоэза, из скелетных мышц, из подкожной жировой ткани. Выделение и культивирование МСК относительно несложно, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации впрок. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используют традиционные методики работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р.Фрешни. М.: Мир. 1989 г. ), в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.

Однако одним из наиболее перспективных источников стволовых клеток является пуповина человека, (патент 2303632RU)

Известен способ лечения заболеваний роговицы у собак, заключающийся в ретробульбарном введении лекарственного вещества в непосредственной близости от патологического очага, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты, взятые после нормальных родов, при этом осуществляют ретробульбарное введение клеток путем инъекции 1-2 мл физиологического раствора, содержащего 0,075-0,20×10 6 клеток/кг веса одномоментно 1-2 раза в год. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты были получены в соответствии со стандартной методикой следующим образом. Образцы пуповины или плаценты человека собирали после нормальных родов на 39-40 неделе гестации. Вены пуповины и плаценты канюлировали и промывали вначале раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы I типа, приготовленным на среде DMEM без сыворотки, и инкубировали при 37°С 30 мин. Затем сосуды вновь промывали раствором Хенкса, ткань подвергали непродолжительному мягкому механическому воздействию, и собирали отделившиеся клетки. Полученные клетки осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 нг/мл базального фактора роста фибробластов (b-FGF), переносили в культуральные чашки и культивировали до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевали в соотношении 1:3. (патент 2481112 RU)

Известен СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ZNF281 (патент 2511417 RU)

Недостатком способа является то, что в крови подавляющая часть стволовых клеток преиндуцирована в сторону клеток крови и не может быть использована для лечения заболеваний, не связанных с патологией крови.

Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ И ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА, ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ (патент RU 2347579), включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, отличающийся тем, что осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,250/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, меняя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение аллогенных мезенхимальных клеток производят из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации. Клеточная культура для лечения заболеваний нервной системы, включающая полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, отличающаяся тем, что она получена с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток по п. 1, причем количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в клеточной культуре - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатком прототипа является низкий выход МСК и низкая жизнеспособность клеток, вызванная применением в качестве дезагреганта смеси смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С. Кроме того, такая культура может нести опасность для реципиента и медицинского персонала, проводящего манипуляции с такими препаратами из-за их возможной зараженности вирусами СПИДА, гепатитов В и С, микоплазмой.

Нами предложен способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека, включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня. При выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 200 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%), затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки. Данный способ отличается тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\ F12, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% CO2 до формирования 3\4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3\4 монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.

Предложенный способ позволяет получать биобезопасную культуру, не зараженную опасными вирусами. Пересев клеток при достижении ими 3\4 монослоя позволяет поддерживать их в стадии логарифмического роста, что препятствует дифференцировке и повышает пролиферативный потенциал. Применение в качестве дезагрегирующего агента смеси содержащей 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленной на среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 повышает выход и жизнеспособность клеток (табл. 1)