КОСМЕТИЧЕСКИЙ АКТИВ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТОВ ПЛОСКИХ ЧЕРВЕЙ ПЛАНАРИЙ

Изобретение относится к области косметологии и касается использования косметических активов для приготовления косметических препаратов. Экстракт из регенерирующих плоских червей планарий используется в качестве косметического актива для добавки в различного рода косметические средства - крем, сыворотки, флюиды, маски. Данный актив обладает противозрастными и регенеративными эффектами на клетки кожи человека.

Пресноводные плоские черви - планарий обладают уникальной способностью к регенерации за счет наличия большого количества стволовых клеток. Пролиферация и дифференцировка этих клеток обеспечивает восстановление утраченных частей тела и обновление организма животного [1, 2]. Несмотря на то, что эти животные примитивны, основные механизмы, обеспечивающие процесс регенерации планарий, активность стволовых клеток достаточно схожи с таковыми у млекопитающих и человека [3]. Анализ транскриптома и протеома этих животных показывает высокую степень гомологии основных сигнальных белков, регулирующих стволовые клетки и регенерацию [4]. Также в процессе регенерации в теле планарий в большом количестве синтезируются и более простые соединения в частности нейротрансмиттеры - серотонин, мелатонин, аденозин, серии, допамин, эпинефрин, норэпинефрин, октапамин, ацетилхолин, гистамин и др., которые способны в этих физиологически-активных дозах оказывать благотворное воздействие на клетки кожи человека [5]. Особо стоит отметить и наличие сложной системы пептидной регуляции регенерации планарий и их стволовых клеток, причем большинство олигопептидов и их производных (ди, трипетидов, т.д) идентичны пептидам, регулирующим активность стволовых клеток человека [6, 7]. Слизь планарий также в своем составе имеет богатый набор физиологически-активных веществ, способных оказывать воздействие на клетки кожи человека. В частности там присутствуют ферменты-антиоксиданты (каталаза, пероксиредоксин, супероксиддисмутаза), мукополисахариды (гепарансульфат, хондроитинсульфат) [8, 9]. Таким образом, экстракт регенерирующих планарий можно рассматривать как мощный физиологически-активный актив для применения в косметических средствах.

В настоящее время косметическая промышленность практически перестала применять активы на основе стволовых клеток человека, так как после обработок (для устранения возможных патогенов) эти экстракты теряют всю свою физиологическую активность в силу денатурации пептидных компонентов и разрушения низкомолекулярных физиологически-активных веществ [10]. Некоторые производители перешли на применение в качестве активов экстрактов стволовых клеток растений [11-13], но как показывает литературный анализ, регуляция стволовых клеток растений и млекопитающих в корне отличаются друг от друга и в принципе активы на их основе не могут воздействовать должным образом на клетки человека [14-17]. Применение экстрактов планарий в качестве косметического актива позволяет безопасно использовать его в нативном виде, только с предварительной фильтрацией для стерилизации, и использовать в качестве актива для косметических средств. Уникальная способность к регенерации и бесполому размножению, неприхотливость планарий при содержании и культивировании позволяет их размножать в больших количествах в относительно малом объеме воды и за короткий промежуток времени, что было показано заявителем [18]. Это позволяет получать необходимую биомассу планарий для промышленного применения их экстрактов в качестве косметического актива.

Целью настоящего изобретения является применение экстракта плоских червей планарий в качестве косметического актива для добавления в косметические кремы, сыворотки, флюиды, маски.

Заявителем были проведены исследования биологической активности экстракта планарий на пролиферацию, дифференцировку и жизнеспособность стволовых клеток человека in vitro.

Пример 1. Исследование биологической активности экстракта планарий.

В данном примере представлено описание полученных результатов исследования биологической активности экстрактов плоских червей планарий на примере культивируемых первичных мезенхимальных стволовых клеток человека. Было определено влияние экстрактов на жизнеспособность рост, пролиферацию и метаболическую активность клеток.

Фиг. 1 показывает результаты исследования цитотоксичности экстрактов планарий (Э1 и Э2) в разведении 1:10, 1:50 и 1:100 на культивируемые мезенхимальные стволовые клетки человека Th при культивировании клеток в течение 4-х суток. Показаны значения среднего и 95% доверительный интервал. Испытания серии разведений полученных экстрактов планарий in vitro на уровне культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека продемонстрировали полное отсутствие цитотоксических эффектов даже высоких концентраций экстракта планарий.

На фиг. 2 показано воздействие экстрактов планарий (Э1 и Э2) в разведении 1:10, 1:50 и 1:100 на метаболическую активность (фиг. 2, А) и рост клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека Th (фиг. 2, Б). Показаны значения среднего и 95% доверительный интервал. Метаболическая активность мезенхимальных стволовых клеток на 2 сутки инкубации после добавления экстрактов в серии разведений 1:10, 1:50 и 1:100 не отличалась от контрольной культуры клеток, не подвергавшихся воздействию экстракта. Добавление экстрактов планарий к культивируемым стволовым клеткам приводило к стимуляции роста культуры. В разведении 1:50 и 1:100 экстракт Э1 на 36 ч и 48 ч способствовал увеличению количества клеток (пролиферации) на 26% (p<0,01) и 33% (p<0,01). Добавление экстракта планарий Э2 в культуру клеток человека также способствовало увеличению пролиферации клеток на 31% (p<0,01) в концентрации 1:50.

Таким образом, полученные экстракты из плоских червей планарий не обладают цитотоксичностью, не влияют на метаболическую культивируемых клеток человека, при этом способны увеличивать их пролиферативную активность. Это указывает на высокий уровень биосовместимости данного препарата и его регенеративной активности на уровне клеток человека.

Методы

Типы используемых клеток и их культивирование

В работе использовали первичные культуры мезенхимальных стволовых клеток (МСК) - пульпы зуба (Th), которые выделяли из зачатка третьего моляра, у здорового пациента 16 лет.Клетки извлекали путем промывки через иглу шприца, вставленную в верхушку канала зуба струей среды DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 200 Ед/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина ("Life technologies", США,). Далее клетки диссоциировали 0,25% трипсином с 0,02% ЭДТА ("ПанЭко", Россия) в при 37°С течение 30 минут.

Полученные клетки центрифугировали 2 минуты при 1500 g, а затем ресуспензировали в среде DMEM/F12 («ПанЭко») в соотношении 1:1 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS). Далее суспензию переносили в 25 см² флаконы и культивировали в атмосфере 5% CO₂, при 37°С в среде DMEM («ПанЭко»), содержащей 10% FBS (HyClone), 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина и добавлением 2 мМ L-глютамина. При достижении субконфлюентного состояния клетки обрабатывали 0,25% раствором трипсин-ЭДТА и пассировали в 75 см² флаконы в соотношении 1:3. Дальнейшее культивирование проводили в среде α - MEM («ПанЭко»), с 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина и добавлением 2 мМ L-глютамина. При проведении исследований использовали культуры 3 пассажа.

Использованные клетки были фенотипированы по наличию антигенов CD44, CD90, CD105 и отсутствию CD34, CD45 и HLA-DR.

Исследование скорости роста культуры клеток

Скорость роста клеточной культуры оценивали по динамике изменения конфлюентности (занимаемой площади) с помощью планшетного ридера Clone Pix Imager (Molecular Devices, США). Съемку проводили каждые 24 часа в течение 5 суток. На каждую экспериментальную точку приходилось не менее 4 измерений (по 96 лункам каждое). Затем, на основе полученных значений строили кривые роста плотности клеточной культуры.

Определение метаболической активности клеток

Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью колориметрического МТТ-теста. Данный тест основан на принципе восстановления бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) до формазана цитоплазматическими и митохондриальными дегидрогеназами живых метаболически активных клеток. Для контроля фоновой активности использовалась культуральная среда, подвергшаяся воздействию условий и процедур исследования. Для проведения теста исходную культуральную среду удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора МТТ 0,5 мг/мл в бессывороточной культуральной среде DMEM/F12. Далее смесь инкубировали в течение 3 часов при 37°С в увлажненной атмосфере 5% CO₂ затем удаляли жидкость и вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и при постоянном встряхивании планшетов в течение 10 мин при комнатной температуре добивались растворения солей формазана. Окраску в лунках 96 луночного планшета регистрировали по измерению оптической плотности при длине волны 540 нм фотометром (модель 680 BIO-RAD, США).

Определение жизнеспособности клеток

Для определения цитотоксических эффектов экстрактов планарий использовали набор для определения доли живых и мертвых клеток (Invitrogen, Life Technologies, США). После воздействия экстрактов на клетки производили окраску клеток в 96 луночном планшете согласно прилагаемому протоколу. После 25 мин. инкубации клетки визуализировали путем фотографирования с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия) с использованием фотокамеры Canon А620 (Canon, США). Зеленая флуоресценция (краситель SYTO 9 λ=485/498 nm) характеризовала живые клетки, красная флуоресценция (йодистый пропидий λ=535/617 nm) характеризовала мертвые клетки. Производили подсчет количества живых и мертвых клеток.

Статистический анализ

Каждый эксперимент повторяли не менее 3-х раз, в каждой серии разведений экстрактов. Статистический анализ производили с использованием методов вариационной статистики, с определением среднего и стандартного отклонения среднего. Для проверки значимости отличий использовали программу "Sigma-Plot 9.11" (Systat Software Inc., Германия) и алгоритм ANOVA с применением t-теста Стьдента.

Литература

1. Karami A., Tebyanian Н., Goodarzi V. et al. Planarians: an In Vivo Model for Regenerative Medicine, International journal of stem cells, 8 (2015) 128-133.

2. Sahu S., Dattani A., Aboobaker A.A. Secrets from immortal worms: What can we learn about biological ageing from the planarian model system?, Seminars in cell & developmental biology, 70 (2017) 108-121.

3. Zhu S.J., Pearson B.J. (Neo)blast from the past: new insights into planarian stem cell lineages, Current opinion in genetics & development, 40 (2016) 74-80.

4. Labbe R.M., Irimia M., Currie K.W. et al. A comparative transcriptomic analysis reveals conserved features of stem cell pluripotency in planarians and mammals, Stem cells, 30 (2012) 1734-1745.

5. Rangiah K., Palakodeti D. Comprehensive analysis of neurotransmitters from regenerating planarian extract using an ultrahigh-performance liquid chromatography/mass spectrometry/selected reaction monitoring method, Rapid communications in mass spectrometry: RCM, 27 (2013) 2439-2452.

6. Collins J.J. 3rd, Hou X., Romanova E.V. et al. Genome-wide analyses reveal a role for peptide hormones in planarian germline development, PLoS biology, 8 (2010) e1000509.

7. Ong Т.Н., Romanova E.V., Roberts-Galbraith R.H. et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea, The Journal of biological chemistry, 291 (2016) 8109-8120.

8. Bocchinfuso D.G., Taylor P., Ross E. et al. Proteomic profiling of the planarian Schmidtea mediterranea and its mucous reveals similarities with human secretions and those predicted for parasitic flatworms, Molecular & cellular proteomics: MCP, 11 (2012) 681-691.

9. Yamada S., Sugahara K., Ozbek S. Evolution of glycosaminoglycans: Comparative biochemical study, Communicative & integrative biology, 4 (2011) 150-158.

10. Na Y.K., Ban J.J., Lee M. et al. Wound healing potential of adipose tissue stem cell extract, Biochemical and biophysical research communications, 485 (2017) 30-34.

11. Morus M., Baran M., Rost-Roszkowska M. et al. Plant stem cells as innovation in cosmetics, Acta poloniae pharmaceutica, 71 (2014) 701-707.

12. WO 2010067212 A2, дата приоритета 20081212.

13. CN 102477411 А, дата приоритета 20101130.

14. Rahni R., Efroni I., Birnbaum K.D. A Case for Distributed Control of Local Stem Cell Behavior in Plants, Developmental cell, 38 (2016) 635-642.

15. Tucker M.R., Laux Т., Connecting the paths in plant stem cell regulation, Trends in cell biology, 17 (2007) 403-410.

16. Drummond-Barbosa D. Regulation of Stem Cell Populations, in: Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006.

17. Strauss R., Hamerlik P., Lieber A. et al., Regulation of stem cell plasticity: mechanisms and relevance to tissue biology and cancer, Mol Ther, 20 (2012) 887-897.

18. Ermakov, A.M., Ermakova, O.N., Kudravtsev, A.A. et al. Mol Biol Rep, 39 (2012) 3073.