СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ ОБЛАДАЮЩИХ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт представляет комплекс биологически активных пептидов проявляющих нейротропную активность.

Биологически активные пептиды нейротропного действия широко и успешно используется в медицине в качестве лекарственных препаратов для профилактики и терапии нарушений мозгового кровообращения, черепно-мозговой травмы и ее последствий, энцефалопатии различного генеза, когнитивных нарушений (расстройства памяти и мышления), острых и хронических энцефалитов и энцефаломиелитов, эпилепсии, астенических состояний (надсегментарные вегетативные расстройства), сниженной способности к обучению, задержки психомоторного и речевого развития у детей, различных форм детского церебрального паралича.

Изобретение может использоваться при получении пептидных препаратов из ткани головного мозга в промышленных масштабах.

Известно несколько способов получения биологически активного пептидов из тканей различных участков головного мозга. Все они предусматривают операции гомогенизации ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (см., например (Патент РФ №2082429, кл. А61К 38/16, 1992 г., Патент РФ №2074726, кл. А61К 35/30, 1993, Патент РФ №2128511, кл. А61К 35/30, 1997 г.). Способы различаются условиями проведения технологических операций и веществами применяемые на данных стадиях. Известные способы не позволяют получать биологически активные пептиды из ткани головного мозга в достаточном количестве и высокого качества, а так же являются слишком сложными и длительными.

Известен способ получения пептидов из головного мозга скота по патенту Российской Федерации №2049472. Согласно патенту дефростированный или свежий головной мозг измельчают и гомогенизируют в воде с нейтральным или слабо щелочным значением рН (6,8-8,4) и подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой грибкового происхождения при температуре от +40 до +50°С в течение 4-5 ч. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до +90 - +95°С и выдерживают при этой температуре в течение 50 мин. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют 2,5 объема спирта и через 2 ч инкубации смесь последовательно фильтруют через мембранные фильтры с размерами пор 0,22-0,5 мкм и с молекулярным весом отсечения 5-15 кД. Спирт и воду отгоняют под вакуумом.

Добавляют консервант (0.3% фенола) и проводят стерильную фильтрацию на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22-0,32 мкм. Целевой продукт представляет собой раствор янтарного цвета и содержит комплекс биологически активных пептидов. Недостатками метода являются использование в технологии этилового спирта, что делает производство взрывоопасным и дорогостоящим. К недостаткам так же следует отнести извлечение в процессе экстракции из тканей головного мозга веществ непептидной природы (липидной и полисахаридной природы), которые невозможно удалить при осаждении спиртом и ультрафильтрацией и которые являясь примесями, не определяют биологическую активность и ухудшают качество целевого продукта. К тому же использование в технологических операциях спирта и фенола так же ведет к ухудшению качества получаемого продукта.

Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению являются способ получения нейротропных пептидов по патенту Российской Федерации №2275924. В соответствии с патентом исходное количество головного мозга скота подвергают гомогенизации до получения гомогенной массы. Проводят экстракцию 3%-ным раствором уксусной кислоты (рН 3,5), содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и раствора уксусной кислоты 1:5. Экстракционную массу постоянно перемешивают при температуре +7 - +16°С в течение 48 ч. По окончании процесса экстрагирования экстракт подают на сепаратор. Осветленный и очищенный на сепараторе экстракт обрабатывают ацетоном при температуре +3 - +5°С и массовом соотношении экстракта и ацетона 1:5. Смесь перемешивают и оставляют на 4 часа для формирования осадка. Полученный осадок промывают охлажденным ацетоном и сушат при +35°С до остаточной влажности не более 10%. Получают порошок. Затем проводят дважды экстракцию водорастворимых пептидов из порошка путем добавления воды для инъекций. Первичный и вторичный экстракты объединяют. Объединенный экстракт очищают от высокомолекулярных белков с молекулярной массой более 15000 Да методом ультрафильтрации на мембранах. В очищенный раствор добавляют глицин (аминоуксусную кислоту) для стабилизации раствора. Далее проводят операцию стерилизующей фильтрации путем пропускания раствора через мембрану с отверстиями не более 0,22 мм. Очищенный раствор разливают по флаконам замораживают и лиофильно высушивают. Целевой продукт представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета, содержит комплекс биологически активных пептидов.

В результате многочисленных экспериментов были выявлены следующие недостатки данного способа получения - низкий выход и качество целевого продукта (не более 7,0 гр 1 кг. сырья, количество пептидов составляет не более 37% от сухой массы продукта).

Задача настоящего изобретения состоит в разработке способа получения биологически активного целевого продукта, обеспечивающего высокий процент выхода и качества, что делает его наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение выхода, активности и качества целевого продукта, оптимизация технологического процесса.

Для достижения указанного технического результата предложен способ который включает в себя следующие стадии:

Кору головного мозга убойных животных замораживают, замороженную ткань измельчают, гомогенизируют и проводят экстракцию 3% раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5. Значение рН раствора должно быть рН 3.5. Для экстракции гомогенат выдерживают при температуре не выше +20°С при постоянном перемешивании в течение 48 часов. По окончании экстракции гомогенат сепарируют, отделяют твердую и жидкую фазы. К надосадочной жидкости добавляют охлажденный ацетона (температура не выше +5°С) в соотношении 1:5. Смесь перемешивают в течение 4 часов при температуре +5°С. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге и несколько раз промывают охлажденным ацетоном. Полученный влажный осадок сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают ацетоновый порошок. Ацетоновый порошок растворяют в воде для инъекций и устанавливают рН 7,0. добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до конечной концентрации 0,3%, выдерживают при температуре +65°С при постоянном перемешивании в течении 3 часов. Затем инактивируют фермент при температуре +90°С в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют, фильтруют и лиофилизируют. Далее проводят стерилизующую фильтрацию путем пропускания раствора через мембрану с диаметром пор 0,22 мм. Раствор разливают в емкости, замораживают и лиофилизируют. Целевой продукт представляет лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных пептидов.

Для производства используют кору головного мозга скота до 12-месячного возраста. Замороженную кору головного мозга используют не позднее чем через 8 месяцев после заморозки.

Применение протеолитического фермента сериновой эндопротеазы, обладающей широкой субстрат - специфичностью, при высокой ионной силе, способствует более полному высвобождению и накоплению биологически активных пептидов из ацетонового порошка. Конечная концентрация фермента при ферментативном гидролизе составляет 0,3%. Проведенными нами исследованиями, по кинетики высвобождения пептидов из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, установлено, что максимальное количество пептидов накапливается в гидролизате в течении 3 часов. В течении данного времени интенсивно протекает протеолиз и происходит максимальное накопление продуктов промежуточного гидролиза белково-пептидных субстратов. Применение ограниченного ферментативного гидролиза способствует полному удалению высокомолекулярных белковых примесей из целевого продукта, которые могут вызывать негативные последствия, такие как аллергические реакции и прионные заболевания. В данном случае ферментативный гидролиз можно рассматривать, как альтернативный вариант методу ультрафильтрации с целью удаления белковых веществ проявляющие побочные свойства. Отсутствие белковых примесей в целевом продукте подтверждено методами ВЭЖХ и электрофореза по Леммли (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклемновых кислот Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот М.: Наука, 1985. 536 с., Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.).

Согласно литературным данным при ограниченном протеолизе белков происходит высвобождение низкомолекулярных пептидов, которые обладают выраженными биологически активными свойствами. Например, при протеолизе казеина (белок содержащийся в молоке) высвобождаются пептиды, которые обладают анальгетическими свойствами - казоморфины, при протеолизе иммуноглобулинов, в частности иммуноглобулинов G, образуются иммуномодулирующие пептиды - тафцин, ригин, пептиды коллагена и фибронектина участвующие в тканевом и клеточном гомеостазе (Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов под ред. Чипенса Г.И. Рига: Зинатне, 1990. 324 с., Jinsmaa Y, Yoshikawa М, 1999; «Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphinfrom bovine beta-casein»; Peptides 20:957-962.,).

Использование ацетона на одной из стадий технологического процесса позволяет не только удалить липиды, пигменты и полисахариды, но и значительно сократить содержание уксусной кислоты и цинка хлористого в готовом продукте. Необходимо подчеркнуть, что из ацетонового порошка в основном извлекаются водорастворимые полипептиды и белки, что особенно важно при учете их фармакокинетики и биодоступности.

Сопоставимый анализ предлагаемого способа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что биологически активные водорастворимые пептиды выделяют на стадии экстракции из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, при этом значительно повышается выход и качество целевого продукта (таблица 1 и таблица 2)

Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа: Замороженное сырье в количестве 22 кг подвергают измельчению и гомогенизации до получения гомогенной массы с помощью измельчителя. Далее проводят экстракцию 3% раствором кислоты уксусной при рН 3,5, содержащий цинк хлористый в концентрации 1,2 г\л при массовом соотношении измельченной массы и экстракционного раствора 1:5 Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течении 48 часов при температуре не более +20°С. По окончании процесса экстракции проводят отделение жидкой и твердой части экстракционной смеси при помощи сепаратора. Режим сепарации 2000-3000 об\мин. Отфильтрованный раствор экстракта охлаждается при перемешивании в течении 24 часов, после чего начинается процесс осаждения. К охлажденному экстракту добавляют охлажденный ацетон, в соотношении 1:5, при температура не выше +5°С. Далее смесь перемешивают и выдерживают в течение 4 часов для формирования осадка. Осадок отделяется от жидкой фазы при помощи центрифуги. Твердая фаза несколько раз (2-3 раза) промывается охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светло-серый или белый цвет. Полученный влажный осадок ацетонового порошка направляют в вакуумно-сушильный шкаф для сушки при температуре не выше +20°С. Время высушивания составляет 2,5-3,0 часа. Получают ацетоновый порошок в количестве 1,0 кг. Водно-ацетоновая смесь направляют на регенерацию ацетона.

К ацетоновому порошку добавляют 19,5 л. воды для инъекций при рН 7,0. Затем вносят сериновую эндопротеазу (конечная концентрация 0,3%). После внесения фермента раствор полупродукта нагревают при постоянном перемешивании до +65°С. Нагрев осуществляют в течение 3 часов. Затем температуру реакционной массы увеличивают до +90°С и выдерживают в течение 30 минут для инактивации фермента. После окончания ферментативного гидролиза реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и подают на сепаратор для удаления твердой фазы. Режим сепарирования при 2000-3000 об/мин. Полученный фильтрат собирают и передают на стадию стерилизующей фильтрации.

Процессы стадии стерилизующей фильтрации осуществляют в помещении класса чистоты В. Санитарный статус фильтра для стерилизующей фильтрации предел отсечения 0,2 мкм. Фильтродержатель вместе с фильтром подвергают стерилизации на стерилизаторе температура стерилизации +134°С. Стерильный раствор разливают в предварительно подготовленные стерильные поддоны и передают на стадию лиофильной сушки. Процессы стадии осуществляются в помещении класса чистоты В с локальной зоной А в зоне загрузки/выгрузки сушки. Процесс производства осуществляют на лиофильной сушке в автоматическом режиме.

Высушенный готовый продукт представляет собой хорошо сформированный порошок белого или желтовато-белого цвета, потери в массе при высушивании не должны превышать 10%. Выход готового продукта составляет 0,4 кг сухого порошка. Высушенный готовый продукт упаковывается в первичную упаковку и передается в помещение для хранения, где маркируется и временно хранится в холодильнике.

Далее проводят контроль параметров полученного продукта. Методы контроля указаны в таблице 3.

Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на биологическую активность. Биологическую активность продукта оценивают по влиянию на рост нервных элементов или выселяющихся клеток в зоне роста в культуре ткани коры головного мозга куриных эмбрионов.

Эксперименты проводят на эксплантатах, представляющих собой фрагменты коры головного мозга 10-ти суточных куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы получают путем инкубирования яиц при 38,5°С в увлажненной атмосфере в СО² - инкубаторе (Lamsystems, Россия) на протяжении 10-ти суток. Далее в стерильных условиях проводят препарирование эмбриона, извлечения головного мозга и отделение фрагментов коры головного мозга, которые помещают в одноразовые стерильные чашки Петри с коллагеновым покрытием (Thermo Scientific, США) и инкубируют 15-20 мин при 37 С. После чего к эксплантатам добавляют питательную среду, содержащую исследуемые образцы в концентрациях 20 нг/мл и инкубируют при 37,8°С в течение 48 часов. В качестве контроля используют эксплантаты, культивируемые в условиях только питательной среды.

Эксплантаты коры головного мозга куриных эмбрионов оценивают с помощью фазово-контрастного инвертируемого микроскопа (ЛОМО, Россия). Критерием биологической активности служило определение интенсивности роста эксплантатов посредством определения индекса площади (ИП) эксплантатов, который рассчитывают как соотношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста (зону выселяющихся клеток), к исходной площади эксплантата (центральная зона). Значения ИП выражают в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%. За условную единицу площади принимают квадрат окуляр - сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5×10 равнялась 150 мкм). Значения ИП выражают в процентах, контрольное значение ИП принимают за 100%.

Общее количество проанализированных эксплантатов составило 62, из которых 22 являлись контрольными, 40 - опытными (n_1,2=20).

Для расчетов используют программу STATISTICA 10. Статистическую достоверность рассчитывают с применением однопараметрического ANOVA теста с применением критерия Дункана, в качестве значимого уровня выбрана вероятность 0,5. Препарат считают биологически активным, если ИП ткани коры головного мозга после культивирования с добавлением целевого продукта в концентрации 20 нг/мл не менее чем на 20% больше ИП в контрольной группе, без целевого продукта

Выявлено, что продукт полученный заявленным способом обладает выраженной биологической активностью - индексы площади эксплантатов коры головного мозга куриных эмбрионов достоверно превышали 20%, относительно контрольных значений (таблица 2)

Стоит отметить, что при добавлении в питательную среду продукта полученного по предлагаемому методу отмечалось более однородность образования монослоя клеток и формирование четких границ зоны роста эксплантатов. Проведенные испытания представлены в таблице 3.

Представленные в таблице 3 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.

Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического продукта - субстанции.