Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения лизоцимсодержащей биологически активной добавки

Изобретение относится к способу получения лизоцима, широко применяемого в разных областях народного хозяйства, в частности в пищевой промышленности, медицине, микробиологии.

Лизоцим используется как лекарственный препарат в качестве пищевой добавки и в молочной промышленности для обогащения защитными факторами продуктов детского и лечебного питания.

Известны различные способы получения лизоцима из животного и микробиологического сырья. Наиболее доступным сырьем животного происхождения для выделения лизоцима является яичный белок. Согласно известному способу [Авторское свидетельство СССР № 9247703, 1968 г.] получения лизоцима из яичного белка исходное сырье обрабатывают раствором хлористого натрия и едкого натра, осуществляют кристаллизацию фермента из раствора и отделяют кристаллы из стабилизированного раствора фильтрацией, при этом кристаллизацию фермента осуществляют трехкратной перекристаллизацией. Выход лизоцима от общего его количества в яичном белке – 80-95, температура хранения 3–4°С.

Недостатками известного способа являются сложность и длительность процесса, что ведет к тому же к потерям ферментного препарата. Препарат малоустойчив при температуре 18-23°С, поэтому его необходимо хранить при низкой температуре.

Также известен способ получения лизоцима, сущность которого заключается в том, что яичный белок обрабатывают растворами хлористого натрия и едкого натра с последующим отделением кристаллов лизоцима из раствора фильтрацией, перекристаллизацией и стабилизацией ферментного препарата солью одновалентного катиона, например, натрием хлористым или альбумином. В качестве стабилизатора используют комплекс натрия хлористого и альбумина. При этом натрий хлористый вводят в суспензию лизоцима, содержащую альбумин, сразу же после первой перекристаллизации, не выделяя целевой продукт из раствора, при одновременном установлении значения, рН 3,5-5,0; соотношение натрия хлористого и альбумина 1-15: 1, соотношение лизоцима и натрия хлористого 1-1,25:1,0-5,0 [Авторское свидетельство СССР № 712438, 1980 г.].

Недостатками способа также являются сложность и длительность процесса, что ведет к тому же к потерям ферментного препарата.

Также известен способ выделения лизоцима [Авторское свидетельство SU 1239147, 1986 г.] , согласно которому проводят экстракцию лизоцима водой при рН 3,0-4,0 и содержании хлорида щелочного металла в реакционной среде 0,5-4,0 мас.% с одновременным нагреванием реакционной среды до 80-95°С и последующим отделение балластных белков.

Недостатком данного способа также является сложность осуществления и низкий выход лизоцима.

Известен способ получения лизоцима из яичного белка путем прямой кристаллизации при добавлении 5% по массе NaCl и доведения pH до 9,8 щелочным агентом с последующей очисткой лизоцима двукратной перекристаллизацией, причем на стадиях кристаллизации и перекристаллизации добавляют затравочные кристаллы, в качестве щелочного агента используют NaHCO₃ и к яичному белку, освобожденному от лизоцима, добавляют HCl, что позволяет его использовать в пищевой промышленности, например, для получения яичного порошка [Патент RU №94025573, 1996 г.].

Также известен способ получения лизоцима [Авторское свидетельство СССР № 7123438, 1977 г. ], Сущность которого состоит в том, что в качестве щелочного раствора используют 0,6-1,4-ный раствора аммиака, а выделение проводят путем сорбции, осуществляемой последовательным пропусканием через силохром "СХ-3В", предварительно уравновешенный стартовым растворителем, в качестве которого используют 0.6-1,4-ный раствор аммиака раствора белка и снова стартового растворителя.

Кроме того, известен способ [Патент РФ № 2074732, 1997 г.], заключающийся в получении лизоцима из неразбавленного яичного белка путем колоночного хроматографического процесса на катионите, обеспечивающего обработку за 1 цикл большого количества белка малым количеством катионита, получение элюата высокой чистоты с высокой концентрацией лизоцима. Для этого яичный белок пропускают через колонку с сильнокислотными макропористым катионитом, затем катионит промывают водой или раствором натрия хлорида с концентрацией не выше 0,2 М, после чего элюируют лизоцим, пропуская щелочные растворы неорганических солей с рН 8,5-13,2. В состав элюента могут входить сода Na₂CO₃ или поташ K₂CO₃, хлориды, сульфаты или фосфаты натрия или калия в концентрации 0,05-2 М, а также этиловый спирт в концентрации 10-40%.

Существенным недостатком приведенных выше способов выделения являются сложность, многоступенчатость и длительность процесса, что приводит к удорожанию полученного лизоцима.

Технической задачей изобретения является упрощение технологии получения лизоцимсодержащих продуктов, и повышение выхода лизоцима и стабилизация его активности.

Техническая задача решается тем, что предложен способ получения лизоцимсодержащей биологически активной добавки, включающий приемку и подготовку яиц, разделение содержимого яиц на белок и желток, внесение в белок соли поваренной концентраций 0,4% к массе белка и кислоты аскорбиновой концентрацией 7% к массе белка, нагревание до температуры 65-70°С в течение 15-20 мин, фильтрацию, сушку фильтрата в виброкипящем слое и последующую фасовку.

Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии получения лизоцимсодержащих продуктов, повышение выхода лизоцима и его активности.

Способ получения лизоцимсодержащей биологически активной добавки осуществляется следующим образом.

Осуществляют приемку и подготовку яиц, для выявления недоброкачественных яиц используют овоскоп.

С целью устранения бактериальной обсемененности сырья, проводят дезинфекцию яиц раствором кальцинированной соды с концентрацией 0,2 % при t=30°С, по окончании обработки яйца промывают с целью удаления дезинфицирующего средства с поверхности.

Затем яйца разбивают и разделяют на белок и желток. Для удаления примесей проводят фильтрацию сырья.

В белок вносят соль поваренную концентрацией 0,4% к массе белка и кислоту аскорбиновую концентрацией 7% к массе белка, полученную смесь нагревают до температуры 65-70°С в течение 15-20 минут.

Затем смесь фильтруют и подвергают сушке в виброкипящем слое при t=64-70°С в течение 15-20 минут. Выход готового продукта составляет 97 %.

Готовую лизоцимсодержащую биологически активную добавку упаковывают.

Технологическая схема производства лизоцимсодержащей биологически активной добавки представлена на фиг. 1.

Наиболее простым и доступным способом получения лизоцимсодержащих препаратов является способ ступенчатой денатурации. Для этого в технологии получения яичного белка после операции фильтрации предусмотрено введение кристаллических волокон: пищевых кислот (лимонной) и поваренной соли к массе белка с последующей тепловой обработкой.

Для расширения способов получения высокоактивной пищевой добавки в качестве альтернативного способа, были проведены исследования по применению растворов пищевых кислот различных видов: лимонной, аскорбиновой, молочной, концентрацией от 2 до 10%.. Результаты представлены на фиг. 2.

Наибольшую активность лизоцим проявляет при использовании аскорбиновой кислоты. Пик активности наблюдается при применении раствора с массовой долей 7% и равен 11033 ЕД/см³. Минимальное значение при с=3% (8919 ЕД/см³).

Зависимость лизоцимной активности от рН белка и концентрации поваренной соли представлена на фиг. 3.

Исходя из представленных данных, можно сделать вывод, что наибольшую активность лизоцим проявляет при концентрации поваренной соли 0,4% и рН белка 5.

Дальнейшее увеличение как концентрации соли, так и рН белка является практически нецелесообразным.

Одним из важнейших факторов, влияющих на активность фермента, является температура.

Результаты исследования влияния температурной обработки на активность лизоцима представлено на фиг. 4.

Наибольшую активность (10760 ЕД/см³) имеет образец, полученный при температуре 70°С и продолжительности воздействия 20 мин. А наименую активность имеет лизоцим, выработанный при температуре 60°С и времени выдержки 10 мин- 9300 ЕД/см³ (фиг. 4).

Как при низкой, так и при более высокой (больше 70°С) температурах лизоцимная активность снижается.

По результатам исследования разработаны технологические режимы по получению лизоцима. Оптимальными условиями является:

- использование раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 7%;

- температурный режим 65-70°С;

- рН белка 5 и концентрация соли 0,4%;

- продолжительность температурного воздействия – 15-20 мин.

Способ получения лизоцимсодержащей биологически активной добавки иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Осуществляют приемку и подготовку яиц, для выявления недоброкачественных яиц используют овоскоп.

С целью устранения бактериальной обсемененности сырья, проводят дезинфекцию яиц раствором кальцинированной соды с концентрацией 0,2 % при t=30°С, по окончании обработки яйца промывают с целью удаления дезинфицирующего средства с поверхности.

Затем яйца разбивают и разделяют на белок и желток. Для удаления примесей проводят фильтрацию сырья.

В белок вносят соль поваренную концентрацией 0,4% к массе белка и кислоту аскорбиновую концентрацией 7% к массе белка, полученную смесь нагревают до температуры 65°С в течение 25 минут.

Затем смесь фильтруют и подвергают сушке в виброкипящем слое при t=64°С в течение 20 минут.

Готовую лизоцимсодержащую биологически активную добавку упаковывают.

Пример 2.

Осуществляют приемку и подготовку яиц, для выявления недоброкачественных яиц используют овоскоп.

С целью устранения бактериальной обсемененности сырья, проводят дезинфекцию яиц раствором кальцинированной соды с концентрацией 0,2 % при t=30°С, по окончании обработки яйца промывают с целью удаления дезинфицирующего средства с поверхности.

Затем яйца разбивают и разделяют на белок и желток. Для удаления примесей проводят фильтрацию сырья.

В белок вносят соль поваренную концентрацией 0,4% к массе белка и кислоту аскорбиновую концентрацией 7% к массе белка, полученную смесь нагревают до температуры 70°С в течение 15 минут.

Затем смесь фильтруют и подвергают сушке в виброкипящем слое при t=70°С в течение 20 минут.

Готовую лизоцимсодержащую биологически активную добавку упаковывают.

Осуществление предлагаемого способа позволяет:

– упростить технологию получения лизоцимсодержащих продуктов;

– повысить выход лизоцима и его активность.