СПОСОБ ЗАЩИТЫ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ОТ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДАЗ

Изобретение относится к области фармакологии, ориентированной на применение синтетических пептидов в медицинских целях (лекарственные пептиды, therapeutic peptides). Синтетические пептиды, копирующие природные сигнальные пептиды, а также не имеющие природных аналогов, все чаще используются в медицине (Eur J Neurosci; Drug Discov Today; Curr Pharm Des; J Biol Chem; Int J Mol Sc; Журнал высшей нервной деятельности) [1-6]. Особенно широко используются аналоги нейропептидов, в том числе, обезболивающих (энкефалин, эндоморфины), противовоспалительные пептиды, копии «активных» доменов крупных белковых молекул и др.

Одним из главных препятствий на пути к еще более широкому использованию лекарственных пептидов является их быстрая инактивация, вызванная разрушающим действием внеклеточных ферментов пептидаз. Так, во внеклеточной среде мозга оперируют как свободные, так и связанные с клетками пептидазы. Они выполняют важные для функционирования органа и всего организма функции. Это трансформирование предшественников в активные пептидные формы (ангиотензин), контроль активности секретированных пептидов (энкефалин, эндоморфины, брадикинин, субстанция П (substance Р) и др.).

Однако действие внеклеточных пептидаз на пептиды, вносимые извне с лекарственными целями, приводящее к их деструкции и утере лекарственных свойств, является вредным. Из-за него приходится существенно повышать дозу пептида и частоту введений его в организм. Это сказывается на переносимости лечения и его стоимости.

В настоящее время ведутся разработки методов, которые делают пептиды труднодоступными для пептидаз.

Известен двухэтапный способ защиты пептидов от действия пептидаз [Bridon Dominique et al, Moditied therapeutic peptides with extended half lives in vivo, Patent US 2009175821 (A1), 2009-07-09] [7]. В качестве первого этапа защиты пептида было предложено осуществить его модификацию путем присоединения реакционно-способного соединения (малеимида), которое затем в организме (второй этап) связывается ковалентно с «компонентами крови». Благодаря этому пептид оказывается труднодоступен для пептидаз.

Авторы предупреждают, что в лекарственном пептиде подключать активные группы следует к «маловажным» аминокислотным остаткам. Однако таковых может и не оказаться, особенно, если пептид небольшой (3-12 аминокислотных звеньев). Но в этот интервал попадает большинство лекарственных пептидов. Кроме того, защищенные этим способом лекарственные пептиды оказываются весьма гетерогенными. «Компонентами крови», с которыми связывается активированный пептид, могут быть и белковые молекулы, и клетки крови, содержание которых неодинаково у разных индивидуумов. В результате, комплексы, в составе которых присутствует лекарственный пептид, оказываются крайне гетерогенными по конформациям, степени защищенности, доступности мишени (ионного канала, рецептора и др.). Все это должно затруднять определение оптимальной дозы и частоту введения препарата, что относится к недостаткам данного способа. Следует также иметь в виду, что комплекс многократно превышает размеры пептида, и для него непреодолимым препятствием должен стать гемато-энцефалический барьер, что исключает применение защищенных подобным образом пептидов в головном мозге, если они не внесены непосредственно в мозг.

В изобретении [Ван Иньсян и др., Аналоги глюкагоноподобного пептида-1 и их применение», патент RU 2531590, 29.04.2011] [8], касающемся определенного лекарственного пептида (глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1)), который разрушается в организме под действием фермента дипептидил-пептидазы IV за считанные минуты (полураспад 3 минуты), предложено вносить в организм не сам пептид, а его модификацию (пролекарство). Эта форма сама не активна, но устойчива в организме. Постепенно модификация снимается, и лекарственный пептид действует, пока не распадется.

Очевидно, что доза вносимого в организм пролекарства многократно превышает рабочую дозу лекарственного пептида, что может оказаться неприемлемым. Кроме того, в каждом новом случае необходимо создавать свое пролекарство.

В работе [Harbeck НТ, Mentlein R (1991) «Aminopeptidase Р from rat brain. Purification and action on bioactive peptides)), Eur J Biochem 198:451-458] [9] описана неудачная (по выводам самих авторов) попытка защитить нейропептиды от действия аминопептидазы Р (АРР). Этот фермент очень специфичен. Он «узнает» в пептиде N-концевую связь типа Х-Pro, т.е. N-концевая аминокислота - произвольная, а следующая - пролин. Такой структурой на N-конце обладает ряд нейропептидов, например, брадикинин и субстанция П (substance Р). Для того чтобы защитить эти пептиды от АРР, были сделаны попытки изменить в указанной позиции форму пролина или даже заменить пролин на другую аминокислоту.

Однако оказалось, что все эти замены приводят к потере пептидами их биологической активности. Это означает, что присутствие базовой формы пролина необходимо для проявления пептидом биологической активности.

Очевидно, что перечисленные ранее [7-9] способы защиты синтетических пептидов от действия пептидаз являются малоэффективными и существенно модифицированные пептиды не везде доступны. Их крупным недостатком является сложность определения оптимальной дозы и частоты введения препарата [7, 8]. Необходимость в создании модификаций пептидов (пролекарство) для каждого нового случая, и необходимость использовать их дозу, превышающую необходимую дозу лекарственного пептида [8]; потеря пептидами их биологической активности вследствие манипуляций с пролином [9].

Техническим эффектом заявляемого изобретения является создание эффективного, надежного способа защиты синтетических пептидов от действия пептидаз.

Это достигается тем, что заявляется способ защиты синтетических пептидов от действия пептидаз, заключающийся в том, что на обоих концах пептида помещают остатки бета-аланина.

Как показали эксперименты, благодаря этому концы пептида оказываются защищенными от действия пептидаз, так как последние не способны нарушить связь, в образовании которой участвует бета-аланин.

Особенную опасность для пептидов представляют низкоспецифичные пептидазы, воздействующие на широкий спектр пептидов. В мозге низкоспецифичные внеклеточные пептидазы присутствуют на наружной поверхности аксонных окончаний нейронов. Отделенные от клеток окончания аксонов именуют синаптосомами. Авторами было обнаружено, что связанные с синаптосомами низкоспецифичные экзопептидазы (амино- и карбокси-пептидазы, которые отщепляют аминокислоты с N-конца и С-конца пептида, соответственно) не способны разорвать связь, образованную с участием бета-аланина. (бета-аланин (betaA) - «необычная» аминокислота, отсутствующая в белках, но образующая вместе с гистидином нейродипептид карнозин)..

Графики на фиг. 1 демонстрируют эффективность предлагаемого метода защиты пептидов от действия разрушающих их с концов пептидаз (экзопептидаз) - сохранность пептидов при инкубации в суспензии синаптосом при 37°С (кривая 1 - пептид альфа-аланин-лизин-фенилаланин (AKF); кривая 2 - защищенный пептид betaA-AKF-betaA).

Основываясь на сказанном выше, авторы предлагают при синтезе лекарственных пептидов (особенно тех, которые предназначены для функционирования в мозге) поместить на оба их конца бета-аланин. Эффективность этого приема иллюстрируется результатами модельногоэксперимента. В этом эксперименте выделенные и промытые в квазифизиологической солевой среде (pH 7.4) синаптосомы были суспендированы в такой же среде при концентрации 10⁶ синаптосом/мл. Эта суспензия имитирует внеклеточную среду мозга. К порциям этой суспензии добавляли равные количества (250 мкМ) пептида AKF (контроль) и его же, защищенного на обоих концах остатками бета-аланина: betaA-AKF-betaA. Оба препарата инкубировали с отбором проб, которые анализировали методом тонкослойной хроматографии. Конкретно осуществлялась денситометрия исходного (d₀) и остаточного (d_t) пятна исходного пептида. Мерой сохранности исходного пептида в каждом случае было отношение (d_t/d₀). Результаты представлены на графиках фиг. 1. Они показывают, что в условиях эксперимента незащищенный пептид исчезает (подвергнут полному разрушению) в течение 40-60 минут (кривая 1), в то время как защищенный пептид сохраняется практически полностью в течение не менее 180 минут (кривая 2).

Предлагаемый авторами способ защиты пептидов представляется эффективным и в описанном выше случае [9], т.к. не связан с манипуляциями с пролином. Размещение на N-конце пептида бета-аланина делает связь X-Pro внутренней, которую АРР не сможет расщепить. При этом пролин сохраняется в исходной форме. Кроме того пептид оказывается защищен от других аминопептидаз, не способных расщепить связь с участием бета-аланина.

Принципиальным преимуществом предложенного авторами способа защиты пептидов от действия пептидаз является сохранение защищаемого пептида без модификаций за исключением добавления на концах остатков бета-аланина. Это особенно важно, если объектом защиты является лекарственный пептид, т.к. сохраняются его лекарственные качества. Важным преимуществом предлагаемого авторами метода является его универсальность: бета-аланин может быть подключен к концам любого пептида. В случае защиты синтетических аналогов природных пептидов, у которых на С-конце должна быть аминогруппа (NH₂), как, например, у эндоморфинов, бета-аланин размещается только на N-конце.

Преимуществом предлагаемого авторами способа защиты пептидов является также то обстоятельство, что защищенный пептид по своим физико-химическим свойствам и размерам мало отличается от исходного и с той же эффективностью способен преодолевать гемато-энцефалический барьер. Это означает, что возможны обычные инъекции защищенных лекарственных пептидов, предназначенных для функционирования в мозге.

Использование защищенных бета-аланином лекарственных пептидов позволит значительно снизить дозы препарата и сделать реже их повторные введения. Благодаря этому токсичность препаратов и их стоимость значительно уменьшатся.

Литература

1. Klementiev В., Novikova Т., Korshunova I., Berezin V., Bock E. (2008) The NCAM-derived P2 peptide facilitates recovery of cognitive and motor function and ameliorates neuropathology following traumatic brain injury. Eur J Neurosci 27:2885-2898.

2. Vlieghe P., Lisowski V., Martinez J., Khrestchatisky M (2010). Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug Discov Today 15:40-56.

3. Audie J., Boyd С. (2010). The synergistic use of computation, chemistry and biology to discover novel peptide-based drugs: the time is right. Curr Pharm Des16:567-582.

4. Chen Z.Y., Hu Y.T., Yang W.S., He Y.W., Feng J., Wang B., Zhao R.M., Ding J.P., Cao Z.J., Li W.X., Wu Y.L. (2012) Hg1, novel peptide inhibitor specific for Kv1.3 channels from first scorpion Kunitz-type potassium channel toxin family. J Biol Chem 287:13813-13821.

5. Yang Q., Qiao S. (2016) Antimicrobial Peptides as Potential Alternatives to Antimicrobial Peptides as Potential Alternatives to Antibiotics in Food Animal Industry. Int J Mol Sc May 3; 17(5).

6. Ашмарин И.П., Незавибатьков Н.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А. и др. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 - Семакс (15-летний опыт разработки и изучения) // Журнал высшей нервной деятельности. 1997, т. 47, с. 419-425.

7. Bridon Dominique др., Moditied therapeutic peptides with extended half lives in vivo. Patent US 2009175821 (A1), 2009-07-09.

8. Ван Иньсян и др. Аналоги глюкагоноподобного пептида-1 и их применение. Патент RU 2531590, 29.04.2011.

9. Harbeck Н.Т., Mentlein R. (1991) Aminopeptidase Р from rat brain. Purification and action on bioactive peptides. Eur J Biochem 198:451-458.