Результат интеллектуальной деятельности: МЕТОД АНАЛИЗА ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ ВКУСОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Каждая ссылка, цитируемая в данном описании, полностью включена в него.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Это изобретение в целом относится к методам анализа, пригодным для идентификации модуляторов вкусовых рецепторов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Воздействие RebА вызывает интернализацию T2R14 (метод анализа кольцевого окрашивания) в клетках NCI-H716. Иммунофлуоресцентное окрашивание T2R14 (ThermoFisher) в клетках NCI-H716.

Фиг.2. Процент имеющих кольцевое окрашивание клеток при воздействии RebА (среднее значение ± SD).

Фиг.3А-В. Метод анализа кольцевого окрашивания, интернализация T1R2. Фиг.3А, иммунофлуоресцентное окрашивание T1R2 (ThermoFisher) в клетках NCI-H716. Фиг.3B, процент имеющих кольцевое окрашивание (среднее значение ± SD). Рециркуляция рецептора T1R2 коррелирует с уменьшением числа имеющих кольцевое окрашивание клеток.

Фиг.4A-B. GLUT4 является общим рецептором для искусственных подсластителей. Фиг.4А, Иммунофлуоресцентное окрашивание GLUT4 (Sigma) в клетках NCI-H716. Фиг.4В, процент имеющих кольцевое окрашивание клеток (среднее значение ± SD).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

1. Метод анализа интернализации вкусовых рецепторов («анализ кольцевого окрашивания»)

Это изобретение предлагает метод анализа для измерения интернализации вкусовых рецепторов. Этот метод анализа, описанный в конкретных примерах ниже и схематически показанный на фиг.1, является очень надежным и точно количественно оценивает локализацию как T2R14 (рецептора горького вкуса), так и T1R2 (рецептора сладкого вкуса). Метод анализа может быть использован для идентификации сладких молекул, а также для идентификации блокаторов горьких рецепторов, и особенно хорошо подходит для использования в высокопроизводительных методах анализа.

Метод анализа интернализации, раскрытый в данном документе, также называемый методом анализа кольцевого окрашивания, обнаруживает локализацию рецепторов с использованием специфичных к рецепторам антител. Первая детектируемая метка, специфичная к нуклеиновой кислоте (например, DAPI, Hoechst 33342, DRAQ5, DRAQ7, DRAQ9), используется для мечения клеточных ядер; это мечение обеспечивает такую информацию, как число клеток в поле и отделяет ядерный (например, DAPI-положительный) и цитоплазматический (например, DAPI-отрицательный) компартменты. Антитела, которые специфично связываются с вкусовыми рецепторами, используются в сочетании с вторичными антителами, конъюгированными со второй детектируемой меткой, которую можно отличить от первой детектируемой метки (например, FITC, TRITC, Су3, Су5, Alexa 350, 488, 546, 555, 568, 594, 633, 647). Диффузное кольцевое окрашивание наблюдается при отсутствии стимула (например, в присутствии только буфера). Однако в присутствии стимула визуализируется «кольцо» интернализованных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления имеющие кольцевое окрашивание клетки рассчитываются с использованием коэффициента корреляции для пиксельных значений сигналов от ядра и рецепторов. Степень интернализации может быть выражена как процент (среднее значение ± SD) клеток, образующих замкнутое кольцевое окрашивание, из нескольких повторов данных (например, четырех).

i. Рецептор сладкого вкуса

В некоторых вариантах осуществления, метод анализа кольцевого окрашивания используется для определения интернализации например, T1R2, T1R3 или GLUT4. Совместная экспрессия T1R2 и T1R3 дает вкусовые рецепторы, которые отвечают на сладкие вкусовые стимулы, включая природные и искусственные подсластители. Сладкие лиганды связываются с рецептором T1R2/T1R3 и активируют передачу сигнала по G-белковому сигнальному пути, который включает интернализацию рецепторов и внутриклеточную мобилизацию кальция, а также активацию нижележащих мишеней, такую как фосфорилирование ERK1/2. Рецепторы сладкого вкуса описаны, например, в патенте США 7402400. Антитела, которые специфично связываются с рецепторами сладкого вкуса, являются коммерчески доступными или могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в данной области.

ii. Рецепторы горького вкуса

В некоторых вариантах осуществления, метод анализа кольцевого окрашивания используется для обнаружения интернализации рецептора горького вкуса, такого как, например, T2R1, T2R3, T2R4, T2R5, T2R7, T2R8, T2R9, T2R10, T2R13, T2R14, T2R16, T2R38, T2R39, T2R40, T2R41, T2R42, T2R43, T2R44 (T2R31), T2R45, T2R46, T2R47 (T2R30), T2R48 (T2R19), T2R49 (T2R20), T2R50 и T2R60. Экспрессия T2R14 и других рецепторов горького вкуса дает вкусовые рецепторы, которые отвечают на горькие вкусовые стимулы, включая горькие нотки естественных и искусственных подсластителей. Горькие лиганды связываются с рецепторами горького вкуса и активируют передачу сигнала по G-белковому сигнальному пути, который включает интернализацию рецепторов и внутриклеточную мобилизацию кальция, а также активацию нижележащих мишеней. Рецепторы горького вкуса описаны, например, в патенте США 7022488. Антитела, которые специфично связываются с рецепторами горького вкуса, являются коммерчески доступными или могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в данной области.

iii. Тестируемые соединения

Тестируемые соединения могут быть природными или синтетическим. Белки, полипептиды, пептиды, полисахариды и низкомолекулярные вещества являются примерами тестируемых соединений, которые могут быть проанализированы с использованием раскрытых в данном документе способов.

iv. Клетки

Любая клетка, которая содержит, или может быть генетически модифицирована, чтобы содержать функциональные вкусовые рецепторы, может быть использована в методе анализа кольцевого окрашивания. В некоторых вариантах осуществления используются клетки NCI-H716 (АТСС, кат.№ CCL-251). Эти клетки экспрессируют рецепторы горького вкуса T2R1, T2R3, T2R4, T2R5, T2R7, T2R8, T2R9, T2R10, T2R13, T2R14, T2R16, T2R38, T2R39, T2R40, T2R41, T2R42, T2R43, T2R44 (T2R31), T2R45, T2R46, T2R47 (T2R30), T2R48 (T2R19), T2R49 (T2R20), T2R50 и T2R60, рецептор сладкого вкуса T1R2/T1R3, α-густдуцин и переносчик глюкозы GLUT4. Другие клетки могут быть генно-инженерно модифицированы для экспрессии T2R14, T1R2/T1R3, α-густдуцина и/или GLUT4 с использованием способов, хорошо известных в данной области. GLUT4 описан, в частности, в патенте США 7799538 и в приведенных в нем ссылках. См. патент США 8338115 и ссылки в нем и статью Adler et al., Cell 100, 693–702, 2000 для описания α-густдуцина.

Другие клетки, которые могут быть использованы в раскрытом методе анализа, включают, но не ограничены ими, 1A2, ARH-77, RWPE-1, WI-38, EJM, NCI-H1155, L-1236, NCI-H526, JM1, SHP-77, SNU-878, NCI-H2196, C3A, CA46, SNU-466, KS-1, SNU-738, MOLP-2, HDLM-2, Pfeiffer, HCC-15, клетки Alexander, L-540, KMS-12-BM, JK-1, NCI-H1092, SW 1990, NCI-H1184, SU-DHL-1, Hep 3B2.1-7, P3HR-1, NCI-H2029, SU-DHL-5, SNU-1, MOLP-8, SUP-M2, MONO-MAC-1, SNU-1040, KYM-1, HEC-59, HCC1569, OCI-LY3, Hs 819.T, DU4475, CI-1, S-117, OVCAR-8, SNU-626, HL-60, SUIT-2, T3M-4, RKO, MOR/CPR, DK-MG, GA-10, OCUM-1, HCT-15, HT, MONO-MAC-6, G-402, Toledo, COV362, SU-DHL-8, Daoy, NCI-H1435, LS513, Hs 839.T, Hs 172.T, BT-483, KMS-21BM, AGS, NCI-H2172, LC-1/sq-SF, SNU-201, NUGC-4, SK-HEP-1, SUP-B15, SNU-5, HT-1197, SUP-T1, AMO-1, KU812, AN3 CA, AML-193, VMRC-RCW, HLE, HuH28, Hs 751.T, NCI-H2110, MEG-01, MV-4-11, Hep G2, KYSE-30, KALS-1, BICR 6, RMUG-S, JHH-6, Ki-JK, IST-MES1, HCC-95, HPB-ALL, HSC-3, 697, LOU-NH91, KARPAS-299, GI-1, COLO 792, SK-N-FI, D341 Med, HGC-27, SR-786, COLO-818, MHH-CALL-2, SF126, NCI-H322, A-253, NCI-H1623, MCF7, HCC-44, FU97, OCI-LY-19, Hs 766T, NCI-H522, RL, HCC1428, RPMI 6666, U-937, NCI-H460, SW 1088, NCI-H1792, NCI-H1693, UACC-257, JHUEM-2, HuT 78, UACC-893, NCI-H929, A-704, OV56, LN-229, OE19, SK-MEL-24, RD-ES, NCI-H211, KCI-MOH1, NCI-H1963, Hs 706.T, ChaGo-K-1, EPLC-272H, OPM-2, KHM-1B, A549, HuG1-N, NCI-H508, MHH-CALL-3, SNU-1076, A3/KAW, MEL-HO, TO 175.T, Caki-1, Hs 936.T, SK-LU-1, WM-983B, K-562, EFE-184, SNU-520, NCI-H2291, HCC-1195, ABC-1, KE-39, NH-6, HCC2218, CMK, RS4;11, KYSE-450, OV7, KYSE-510, SK-UT-1, SNU-C1, OE33, P12-ICHIKAWA, DLD-1, COV434, HuNS1, SNU-899, SW480, COLO-678, LU99, KOPN-8, NCI-H2227, SW1463, Hs 675.T, JHH-4, NCI-H1703, HEC-1-A, BDCM, MIA PaCa-2, PC-3, TE-15, PK-45H, MKN-45, HCC-366, CAL-29, HEC-50B, CPC-N, KMRC-20, SW1116, EOL-1, COLO 205, EHEB, YD-38, MC116, SK-N-BE(2), BV-173, NCI-H2347, LU65, RT4, U-87 MG, LK-2, KP-N-YN, HEC-251, NCI-H1651, GP2d, RERF-LC-MS, NB-4, NCI-H2286, SNU-61, T-47D, huH-1, KYSE-180, ST486, SW 1353, M-07e, KASUMI-1, YH-13, NCI-H28, GAMG, JeKo-1, GOS-3, SNU-324, PA-TU-8902, MFE-280, SNU-245, NALM-1, RERF-LC-Sq1, BICR 22, ZR-75-1, COR-L23, SW579, COR-L88, KM12, Hs 611.T, OUMS-23, RERF-LC-Ad1, NCI-H1385, SK-LMS-1, COLO-320, BL-70, GRANTA-519, MCAS, Panc 08.13, AM-38, KMS-11, SIG-M5, SNU-407, JHOS-2, OVCAR-4, Set-2, OV-90, MeWo, HEL, HT-29, MDA-MB-231, TOV-21G, NCI-H1355, KMS-27, NALM-6, KMS-26, Caov-4, KASUMI-2, UACC-62, U266B1, Hs 695T, HT55, BICR 31, TCC-PAN2, KMS-20, Hs 578T, RI-1, Hs 606.T, NCI-H1341, THP-1, BCP-1, Hs 737.T, SW1417, MOLT-4, Raji, ESS-1, MEL-JUSO, SH-10-TC, Hs 683, ME-1, EB2, PLC/PRF/5, NCI-H1339, A4/Fuk, SEM, HEC-265, IST-MES2, KE-97, NCI-H1437, COLO-704, NCI-H1915, TE-5, NCI-H2023, NCI-H82, T1-73, SNU-840, HuT 102, NCI-H1944, KYSE-520, Kasumi-6, 1321N1, Hs 742.T, IM95, PL45, CL-40, WM1799, KMM-1, SNU-449, JHUEM-1, KARPAS-620, Loucy, SNU-1079, Daudi, HCC-56, HSC-2, COR-L47, PA-TU-8988S, OAW28, COR-L311, L-363, Malme-3M, NOMO-1, Hs 870.T, SU-DHL-10, Hs 229.T, NCI-H810, KYSE-410, RPMI-8402, SNU-175, EBC-1, RVH-421, K029AX, PA-TU-8988T, LXF-289, OVSAHO, CAL-12T, Hs 940.T, MM1-S, SUP-HD1, LNCaP клон FGC, HSC-4, NU-DHL-1, NCI-H2228, BEN, CAL-78, Sq-1, NCI-H1793, SNU-C2A, MDA-MB-134-VI, COV318, KE-37, TYK-nu, MOTN-1, T98G, SW837, EB1, Becker, PE/CA-PJ34 (клон C12), Hs 616.T, NCI-H446, WM-88, CHP-126, Calu-1, SNU-283, NCI-H1573, SW 1271, SNU-16, JHOS-4, ACHN, Calu-3, KMRC-1, SW 1783, TE-11, TE-9, HuH-6, P31/FUJ, HT-1376, NCI-H520, 786-O, KNS-60, Caki-2, OVK18, PL-21, NCI-H2452, JURL-MK1, TEN, JHH-7, MDA-MB-157, Calu-6, RKN, NUGC-2, ONS-76, J82, OUMS-27, SNU-1196, Hs 739.T, RPMI-7951, NCI-H854, JHH-5, JVM-2, Hey-A8, 5637, KYSE-140, Capan-2, KYSE-150, HEC-1-B, BICR 16, HEL 92.1.7, MHH-NB-11, SNU-387, SK-OV-3, SK-MEL-28, IGROV1, ML-1, HLF-a, CHL-1, YKG1, A-204, OCI-M1, 8505C, JVM-3, NCI-H647, DB, COLO-800, PK-59, FaDu, HLF, OVMANA, EFO-27, PF-382, NCI-H747, LS123, SU-DHL-6, SJRH30, PANC-1, NCI-H2342, KM-H2, DND-41, HH, HuCCT1, F-36P, DMS 454, Hs 274.T, AU565, NCI-H1666, EN, RH-41, NCI-H1373, NCI-H838, SK-MEL-30, MOLM-6, DEL, NCI-H226, NCI-H1648, NCI-H661, 143B, Mino, C32, KMS-34, NCI-H1694, SK-ES-1, UACC-812, GDM-1, NCI-H23, Panc 02.03, CCF-STTG1, LOX IMVI, SJSA-1, MDST8, PK-1, NCI-H716, SU-DHL-4, MPP 89, MJ, COLO 829, PE/CA-PJ15, HD-MY-Z, BxPC-3, WM-793, COLO 668, T84, JHOM-1, PEER, LS411N, GMS-10, KMBC-2, RMG-I, KELLY, SNU-761, NALM-19, HEC-151, G-361, OVTOKO, A-498, SW 900, LCLC-103H, FTC-133, QGP-1, Reh, CMK-11-5, NU-DUL-1, BT-20, Hs 600.T, Hs 604.T, KATO III, SNU-410, NCI-H2126, SK-MEL-5, MDA-MB-468, AsPC-1, HUP-T3, KP-N-SI9s, L-428, SNU-1105, HUP-T4, 769-P, LMSU, NCI-H1869, NCO2, MOLM-16, CAL 27, HCC70, NCI-H1930, COV644, Hs 863.T, HCC-2279, D283 Med, Hs 944.T, HCC1599, MDA-MB-415, HCC2157, NCI-H1618, SNU-308, HCC1954, DMS 153, HPAF-II, T24, CJM, VM-CUB1, UM-UC-3, LAMA-84, NCI-H1734, JHH-2, VMRC-RCZ, MFE-319, MDA-MB-453, SNU-503, TOV-112D, B-CPAP, GSU, HCC-78, NCI-H2171, CAMA-1, HEC-108, HCC4006, CAL-85-1, NCI-H2122, COLO-699, NCI-H196, LUDLU-1, SW 780, RPMI 8226, LP-1, PC-14, HuTu 80, T.T, SW948, 22Rv1, HARA, NCI-H596, IPC-298, SCaBER, NCI-H1838, NB-1, Hs 934.T, Hs 895.T, DMS 114, KYSE-70, KP-3, KP4, DAN-G, NCI-H2009, OC 316, SCC-25, U-138 MG, RCC10RGB, MFE-296, NCI-H1755, RERF-LC-KJ, 8305C, WSU-DLCL2, ES-2, MSTO-211H, SCC-15, ZR-75-30, PSN1, SNU-423, NCI-H2106, TE-1, UT-7, KMS-28BM, NCI-H2081, SK-MM-2, COLO 741, OC 314, HCC1395, MOLT-13, LN-18, Panc 10.05, PE/CA-PJ41 (клон D2), Hs 746T, CW-2, SKM-1, NUGC-3, TE-10, NCI-H358, NCI-H69, BFTC-909, HOS, BICR 18, NCI-H1395, OVKATE, Hs 698.T, EFM-19, COLO-783, MHH-CALL-4, ACC-MESO-1, NCI-H1436, KP-N-RT-BM-1, SK-MEL-31, NCI-H1105, CAL-51, YD-15, NCI-H2085, NCI-H2444, HCC1187, Hs 939.T, CAL-120, SCC-9, TUHR14TKB, KMRC-2, KG-1-C, ECC10, CGTH-W-1, NCI-H841, C2BBe1, SUP-T11, RCH-ACV, CADO-ES1, JURKAT, 647-V, SK-MEL-2, MDA-MB-175-VII, MKN74, SNU-C4, LCLC-97TM1, SCC-4, BHY, IGR-37, KYO-1, Hs 281.T, TT, TUHR4TKB, HT-1080, NCI-H660, TE 441.T, LS1034, KNS-42, Panc 04.03, HCC1419, AZ-521, SNG-M, NCI-N87, G-292, клон A141B1, KPL-1, MDA-MB-361, CL-14, NCI-H2170, HuH-7, RD, NCI-H2066, IGR-1, TE-14, VCaP, BL-41, SNU-620, SK-MES-1, MEC-2, NCI-H1299, IGR-39, RT112/84, SF-295, DV-90, A2780, BICR 56, NCI-H510, NCI-H2141, YD-8, NCI-H2405, TF-1, MEC-1, CCK-81, NCI-H1048, Hs 822.T, NCI-H2052, KO52, CAL-54, Hs 840.T, SW620, SK-CO-1, BT-474, CL-11, KNS-62, NCI-H1650, G-401, MOLT-16, SNU-398, COLO-680N, EM-2, Hs 294T, CAL-62, KMRC-3, A101D, KG-1, BT-549, HT115, A-375, SW-1710, WM-115, KLE, JHUEM-3, MKN7, CHP-212, HCC202, BC-3C, NCI-H1568, KMS-18, PE/CA-PJ49, COLO-849, SIMA, OCI-AML3, GSS, EC-GI-10, EFO-21, RCM-1, DMS 273, KU-19-19, RERF-GC-1B, SH-4, SK-MEL-3, RERF-LC-Ad2, M059K, JHOM-2B, MDA PCa 2b, Hs 852.T, RL95-2, Panc 03.27, SNU-216, Panc 02.13, CFPAC-1, SK-N-SH, OCI-AML2, LoVo, SBC-5, NCI-H1876, NCI-H441, SK-N-AS, COR-L24, HCC38, NCI-H1781, DOHH-2, NCI-H1563, U-251 MG, HPAC, JIMT-1, U-2 OS, A-673, TC-71, NCI-H650, NIH:OVCAR-3, CAS-1, JL-1, SK-MEL-1, MDA-MB-435S, Ishikawa (Heraklio) 02 ER-, TE 617.T, SU.86.86, RERF-LC-AI, TT2609-C02, LS 180, YAPC, HDQ-P1, KNS-81, FU-OV-1, KP-2, DMS 53, SNU-1272, Detroit 562, 42-MG-BA, L3.3, COLO-679, NCI-H2087, NCI-H2030, GCT, NCI-H889, Caov-3, MDA-MB-436, NCI-H524, MKN1, KCL-22, Capan-1, CML-T1, H4, NCI-H727, Hs 343.T, MHH-ES-1, NMC-G1, HCC-1171, REC-1, Hs 618.T, A172, YD-10B, SW48, MUTZ-5, TE-6, JHH-1, HCT 116, TE-4, IA-LM, MG-63, NCI-H1975, TALL-1, HCC1806, HMCB, SCLC-21H, HCC1500, CL-34, Panc 05.04, SW403, TM-31, HCC1937, JMSU-1, DMS 79, SNB-19, NCI-H1836, Li-7, HCC827, 639-V, MOLM-13, SK-BR-3, IMR-32, TUHR10TKB, OAW42, SK-N-MC, TGBC11TKB, NCI-H1581, EFM-192A, YMB-1, HCC2935, ECC12, HCC-33, DU 145, NCI-H146, SNU-1214, SNU-1077, 23132/87, HT-144, SNU-182, Hs 888.T, SNU-475, GCIY, Hs 729, JHOC-5, SW 1573, HEC-6, OCI-AML5, Hs 688(A).T, Hs 821.T, PCM6, RT-112, SK-N-DZ, SNU-478, SNU-119, HCC1143, NCI-H209, 8-MG-BA, COR-L105, COR-L95, SNU-46, COV504, CAL-148, SNU-C5, DBTRG-05MG, BHT-101, WM-266-4, BFTC-905, KYSE-270, TE-8, SNU-213, U2-OS и SH-SY5Y.

2. Методы анализа кольцевого окрашивания с использованием клеток NCI-H716

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки NCI-H716 используются для обнаружения клеточных ответов на потенциальные блокаторы горьких рецепторов. Клетки NCI-H716 контактируют с тестируемым соединением. Интернализация рецепторов горького вкуса в присутствии тестируемого соединения указывает на то, что тестируемое соединение является потенциальным модулятором горького вкуса. Модуляторы горького вкуса могут быть включены в различные продукты потребления, включая пищевые продукты, напитки и лекарственные препараты.

В некоторых вариантах осуществления клетки NCI-H716 используются для обнаружения клеточных ответов на сладкие вкусовые вещества (например, молекулы, которые сами по себе вызывают сладкий вкус, или которые усиливают сладкий вкус). Клетки NCI-H716 контактируют с тестируемым соединением. Интернализация T1R2 указывает на то, что тестируемое соединение является сладкой молекулой. Сладкие молекулы могут быть включены в различные продукты потребления, включая пищевые продукты, напитки и лекарственные препараты.

ПРИМЕР 1

Метод визуализации интернализации T2R14 для большого количества образцов

Культивирование клеток, материалы. Клетки NCI-H716 выращивали в среде RPMI1690 с 10 % фетальной бычьей сывороткой. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку на покрытые PDL 384-луночные планшеты. Кроличьи анти-T2R14 антитела и кроличьи анти-T1R2 антитела были куплены в ThermoFisher. Alexa 488-конъюгированные антитела и Hoechst 33342 были куплены в Life Technology.

Обработка соединением. 20000 клеток в PBS + 10% FBS, высевали на покрытые PDL 384-луночные планшеты с прозрачным дном и черными стенками, пригодные для получения изображений большого количества образцов. Для исследований T2R14, соединения добавляли к клеткам. Исходные растворы всех соединений разводили в диметилсульфоксиде (DMSO) и использовали в концентрации 10 мМ. Контрольные группы клеток также получали DMSO (0,1%) в среде.

Методы анализа кольцевого окрашивания. Клетки NCI-H716 стимулировали RebА (PureCircle) в концентрации 10 мМ в указанные моменты времени при 37°С. Клетки затем фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресценции с вторичными антителами против рецептора горького вкуса T2R14. Все изображения были получены с помощью 20-кратного объектива с использованием автоматизированного микроскопа ImageXpress Micro. Окрашивание Hoechst 33342 является псевдо-синим цветом, а специфичное окрашивание антителом является псевдо-зеленым цветом. Наложенные изображения показывают диффузное кольцевое окрашивание при обработке буфером; обработка клеток NCI-H716 RebА давало кольцевое окрашивание. Окрашивающиеся кольцом клетки были рассчитаны с использованием коэффициента корреляции для пиксельных значений сигналов от Hoechst 33342 (ядеро) и FITC (T2R14). Степень интернационализации выражается как процент (среднее значение ± SD) клеток, имеющих замкнутое концевое окрашивание, из четырех повторов. Рециркуляция рецептора T2R14 коррелирует с уменьшением числа имеющих кольцевое окрашивание клеток.

Статистический анализ и графики были выполнены с использованием Tibco Spotfire или GraphPad Prism.

В анализе кольцевого окрашивания при окрашивании рецепторов T2R14 специфичными антителами авторы изобретения наблюдали большинство T2R14 рецепторов на клеточной поверхности, что давало диффузное кольцевое окрашивание. Когда клетки обрабатывали RebA или RebС, происходила интернализация и трафик рецепторов T2R14, в результате чего появлялось кольцевое окрашиванием. С использованием аналитического алгоритма для оценки перемещений множественных сигналов (Molecular Devices) авторы показали, что интернализация T2R14 увеличивается после стимуляции клеток NCI-H716 с использованием RebA или RebС. В отличие от этого интернализация не наблюдалась после обработки RebD. Этот пример демонстрирует связь между методами визуализации клеток с большим количеством образцов и сенсорными данными, тем самым обеспечивая подход на основе in vitro механизма, который может использоваться для обнаружения новых блокаторов горьких рецепторов. Результаты показаны на фиг.2.

ПРИМЕР 2

Метод визуализации интернализации T1R2 для большого количества образцов

Авторы исследовали влияние сладких соединений на энтероэндокринную клеточную линию NCI-H716 человека, которая эндогенно экспрессирует рецептор сладкого вкуса T1R2/T1R3 и α-густдуцин. Необработанные клетки NCI-H716 экспрессируют рецепторы T1R2 на клеточной поверхности. Воздействие D-глюкозы вызывает интернализацию рецепторов T1R2, приводя к типичному кольцевому окрашиванию (фиг.3А). С использованием аналитического алгоритма для оценки перемещений множественных сигналов (Molecular Devices) авторы количественно оценили интернализацию эндогенного T1R2 в клетках NCI-H716, обработанных сладкими на вкус соединениями. Интернализация T1R2 усиливалась после стимуляции D-глюкозой, D-фруктозой, сахарозой, сукралозой, аспартамом и Асе-К, тогда как процесс интернализации T1R2 не наблюдался после воздействия сахарина (фиг.3В).

Наблюдалась корреляция между молекулярными структурами сахара и маршрутами рециркуляции T1R2. Таким образом, T1R2 возвращается обратно в клеточную мембрану очень быстро после воздействия моносахаридов, D-глюкозы и D-фруктозы, тогда как медленная рециркуляция T1R2 наблюдалась при использовании дисахарида сахарозы и его аналога сукралозы (фиг.3В).

ПРИМЕР 3

Метод визуализации интернализации GLUT4 для большого количества образцов

В последнее время сенсорные исследования и исследования на животных предоставили доказательства существования дополнительных рецепторов сладкого вкуса, особенно, отвечающих на искусственные соединения, такие как сахарин. Авторы предположили, что транспортер глюкозы GLUT4 (Entrez Gene # 6517) может представлять собой вышележащую молекулу в сигнальном пути сахарина в клетках NCI-H716. GLUT4 экспрессируется преимущественно в T1R3-положительных вкусовых клетках, и интернализация GLUT4 является ключевым механизмом регулирования потребления глюкозы в отсутствие инсулина. Клетки NCI-H716 экспрессируют эндогенный GLUT4 (база данных Oncomine), который может опосредовать наблюдаемый Ca⁽²⁺⁾-ответ в этих клеточных линиях.

Для дальнейшего изучения роли GLUT4 в передаче сигнала от искусственных подсластителей авторы протестировали интернализацию эндогенного GLUT4 в клетках NCI-H716. Воздействие сахарина приводило к быстрому перераспределению GLUT4 внутри клетки, давая концевое окрашивание (фиг.4А). Количественное определение интернализации GLUT4, измеренное как увеличивающееся число клеток, имеющих кольцевое окрашивание, показало, что интернализации GLUT4 увеличилась после стимуляции Асе-К, аспартамом и сахарином, тогда как природные сахара были неспособны активировать процесс интернализации GLUT4 (фиг.4В).

В совокупности эти результаты показывают, что GLUT4 является общим рецептором для искусственных подсластителей. Сахарин активирует Ca⁽²⁺⁾-ответ только через GLUT4, тогда как Асе-К и аспартам активируют как T1R2/T1R3, так и GLUT4 пути.