Результат интеллектуальной деятельности: ЭРИТРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ ТКАНЕВОГО ДЫХАНИЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности к физиологии крови, и может быть использовано для оценки интенсивности тканевого дыхания в организме человека в норме, при физической нагрузке, при патологии, а также в условиях искусственного кровообращения.

Применяемые в настоящее время в медицинской практике методы морфологического анализа эритроцитов, направленные на измерение их количества, диаметра, гематокрита, цветового показателя, а также особенностей морфологии, выполнены на фиксированных образцах крови. Это обуславливает сглаживание многих функциональных характеристик эритроцитов, существующих in vivo, в частности особенностей их прижизненного строения, связанных с газотранспортной функцией (Идельсон А.И., 1970; Царкина А.С., 1975; Золотницкая Р.П., 1987; Липунова Е.А., 2007; Байбеков И.М., 2008).

Исследование тканевого дыхания производится, в основном, микрометрическими методами или с использованием ионоселективных электродов для определения напряжения кислорода и двуокиси углерода. Поскольку подобные исследования проводятся на иссеченных образцах тканей, их изучение в медицинской практике затруднено из-за сложности необходимого оборудования и длительности получения результатов анализа (Уильямс Б., Уилсон К., 1978).

Морфометрический способ определения интенсивности тканевого дыхания основан на не известном раннее факте, что оксигенированные и деоксигенированные эритроциты (артериальная и венозная кровь) отличаются не только по спектральным характеристикам содержащегося в них гемоглобина, но и по морфологическим особенностям их строения. Так, поверхность эритроцитов, находящихся в венозном русле и отдавших кислород, покрыта ворсинками (шипами), длина которых превышает 0,4 мкм (0,4-1 мкм) - крупноворсистые (крупношипованные) формы эритроцитов. Число ворсинок (шипов) может достигать 20-30. В артериальной крови преобладают эритроциты, насыщенные кислородом. Они также покрыты ворсинками (шипами), но размеры их меньше 0,4 мкм и находятся на границе разрешающей способности светового микроскопа - мелковорсистые (мелкошипованные) формы эритроцитов. В артериальной крови их число значительно больше, чем крупношипованных. Эти особенности строения эритроцитов можно обнаружить только на нефиксированных образцах крови, так как фиксация нивелирует различия в морфологии, связанные с газотранспортной функцией.

Появление ворсинок (шипов) на поверхности эритроцитов - это скопление микропузырьков кислорода, которыми эритроцит насыщается при прохождении через легкие, и отражают не их морфологическую форму, а процесс насыщения кислородом в легких и отдачи кислорода тканям.

Целью настоящего изобретения явилось создание метода анализа образцов крови, способного дать достаточно быструю и полную информацию о red-ox-реакциях в организме человека в норме, при физической нагрузке, при патологии, а также в условиях искусственного кровообращения.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в эритрометрическом способе оценки интенсивности тканевого дыхания, включающем анализ крови, для анализа производят забор 50 мкл крови из любой фаланги пальца кисти либо пробу крови из контура аппарата искусственного кровообращения, далее образец крови разводят в 100 раз 0,9%-ным раствором хлористого натрия, затем 40 мкл разбавленной таким образом крови наносят на предметное стекло и покрывают покровным стеклом размером 20×20 мм и толщиной не более 150 мкм, затем проводят анализ крови под микроскопом, при этом для подсчета эритроцитов применяют измерительную сетку с квадратными ячейками, вставленную в окуляр, и подсчитывают общее число эритроцитов в квадратных ячейках по двум взаимно перпендикулярным направлениям; определяют соотношение эритроцитов-эхиноцитов и эритроцитов с отростками менее 0,5 мкм, при этом снижение указанного соотношения ниже 4-х свидетельствует о наличии патологических процессов, отражающихся нарушением тканевого дыхания. Об интенсивности тканевого дыхания судили на основании не известного ранее факта о том, что форма эритроцитов зависит от степени насыщения их кислородом: оксигенированные и деоксигенированные эритроциты (артериальная и венозная кровь) отличаются не только по спектральным характеристикам содержащегося в них гемоглобина, но и по морфологическим особенностям их строения. Отмечено, что кровь, насыщенная кислородом (артериальная) при нормальных условиях газообмена в легких, на 90-95% состоит из эритроцитов-эхиноцитов (длина ворсинок (шипов) - менее 0,4 мкм), венозная кровь представлена в основном крупноворсистыми (крупношипованными) формами эритроцитов (длина ворсинок (шипов) - 0,4-1,0 мкм). Ворсинки (шипы) на поверхности эритроцитов - это микропузырьки кислорода, которыми эритроцит насыщается при прохождении через легкие, и отражают не их морфологическую форму, а процесс насыщения кислородом в легких и отдачи кислорода тканям. Форма эритроцитов обратима и изменяется как после прохождения через легкие (оксигенатор), так и после газообмена в тканях.

Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показана микрофотография эритроцитов-эхиноцитов человека in vivo (обьектив 40^х, масштаб 10 мкм), фиг. 2, на которой показана микрофотография крупношипованных эритроцитов человека in vivo (обьектив 40^х, масштаб 10 мкм).

Способ эритрометрической оценки интенсивности тканевого дыхания реализуется следующим образом. Для анализа берется 50 мкл крови из любой фаланги пальца кисти общепринятым методом. Особое внимание уделяется приостановке венозного оттока путем пережатия пальца. Далее образец крови разводится в 100 раз 0,9%-ным раствором хлористого натрия. 40 мкл разбавленной таким образом крови наносится на предметное стекло и покрывается покровным стеклом размером 20×20 мм и толщиной не более 150 мкм. Анализ крови проводится под микроскопом в проходящем свете с использованием объектива 40^х и апертурой не ниже 0,65. Увеличение окуляра от 10^х и выше. Для подсчета эритроцитов применяется измерительная сетка с квадратными ячейками, вставленная в окуляр. Подсчитывается общее число эритроцитов в квадратных ячейках по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Достаточно точные результаты получаются при числе эритроцитов не менее 500 шт. Общее количество подсчитанных эритроцитов принимается за 100% и определяется процентное соотношение эритроцитов-эхиноцитов и эритроцитов с отростками менее 0,5 мкм.

Проведенный анализ образцов периферической крови указанным выше способом показал, что поверхность эритроцитов из артериальной крови не является всегда гладкой. Часто она содержит выпячивания (шипы) от 0,4 до 1 мкм. Шипы менее 0,4 мкм хорошо различимы только с применением оптики с высокой разрешающей способностью - фиг. 1.

С целью доказательства возможного влияния степени насыщения эритроцитов кислородом на их форму были проведены исследования образцов периферической крови у 30 практически здоровых людей мужского пола в возрасте от 18 до 65 лет, взятой из последней фаланги среднего пальца кисти.

В артериальной периферической крови практически здоровых людей в возрасте от 18 до 65 лет (от 18 до 25 лет - 20 чел., от 35 до 40 лет - 5 чел., от 60 до 65 лет - 5 чел.) содержится от 50 до 90% крупноворсистых эритроцитов. Причем в возрасте от 18 до 25 лет - 82±5%, от 35 до 40 лет - 71±6% и от 60 до 65 лет - 54±7%. Сравнение образцов венозной и периферической артериальной крови по процентному содержанию эритроцитов-эхиноцитов и эритроцитов с отростками менее 0,5 мкм позволило предположить, что преобладание в крови крупноворсистых форм связано со степенью ее насыщения кислородом, а так как содержание кислорода в венозной крови ниже чем в артериальной, то был сделан вывод, что появление шипов (ворсинок) на поверхности Эр. (крупноворсистые Эр.) отражает процесс отдачи кислорода эритроцитами окружающим тканям во время прохода крови по капиллярному руслу. Переход из одной формы эритроцитов в другую осуществляется быстро (от нескольких мс до нескольких десятков мс) и определяется скоростью течения крови в альвеолярных и тканевых капиллярах. Об этом так же свидетельствуют результаты опытов, в которых через венозную кровь пропускали атмосферный воздух (Р=766 мм рт.ст., относительная влажность 80%) и чистый кислород (превышение над атмосферным давлением 10 мм рт.ст.) в течение двух минут. Объем крови составлял 2,5 мл, диаметр пор барбатера 100 мкм. До продувания кислорода содержание крупноворсистых эритроцитов составляло 100%, а после пропускания кислорода - 10±5%. При пропускании через кровь атмосферного воздуха число крупноворсистых эритроцитов уменьшалось до 30±4%. В опытах на образцах периферической крови, взятой о людей в возрасте 18-25 лет, после пропускания атмосферного воздуха или кислорода, так же было отмечено уменьшение содержания крупноворсистых эритроцитов до 32±5%. У лиц старше 60 лет (54±7% крупноворсистых эритроцитов в норме) при пропускании через их пробу крови выдыхаемого воздуха количество крупноворсистых эритроцитов увеличивалось до 80±4%.

Таким образом, как показали приведенные выше опытные данные, процентное содержание эритроцитов-эхиноцитов и эритроцитов с отростками менее 0,5 мкм отражает степень насыщения крови кислородом и связано с интенсивностью тканевого дыхания. Так, у людей старше шестидесяти лет содержание крупноворсистых эритроцитов в артериальной периферической крови составляет 54%, а в возрасте 20-25 лет - свыше 82%. Интенсивность метаболических процессов в этом возрасте, как известно, намного выше.

Соотношение крупношипованных и мелкошипованных эритроцитов является показателем интенсивности окислительно-восстановительных реакций и интегральной характеристикой функционального состояния организма. Величина показателя от 8 до 10 характерна для практически здоровых лиц молодого возраста, с 4 до 8 - практически здоровых лиц среднего и пожилого возраста, а снижение его ниже 4-х свидетельствует о наличии патологических процессов, отражающихся нарушением тканевого дыхания.

Данный метод экспресс-диагностики тканевого дыхания не требует дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала, может стать незаменимым для оценки функционального состояния организма военнослужащих в различных ситуациях, а также спортсменов до и после тренировок. Кроме того, с помощью данного метода можно быстро и эффективно оценить интенсивность тканевого дыхания при проведении операций в условиях искусственного кровообращения и своевременно принять необходимые меры.