Результат интеллектуальной деятельности: АНТИАРИТМИЧЕСКОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается фармацевтической комбинации, включающей в себя лаппаконитин, глицирризиновую кислоту и метилурацил при мольном соотношении компонентов лаппаконитин : глициризиновая кислота : метилурацил, равном 1:4:2, в качестве лекарственного средства с антиаритмической активностью, которое может применяться для профилактики и лечения предсердных и желудочковых, в том числе и злокачественных, нарушений сердечного ритма.

Проблема профилактики и лечения злокачественных нарушений сердечного ритма и, как следствие этого, снижения риска возникновения внезапной сердечной смерти является одной из наиболее актуальных задач, стоящих перед современной кардиофармакологией.

В настоящее время для лечения нарушений ритма сердца применяют медикаментозные и интервенционные методы лечения. Медикаментозное лечение этой патологии основано на применении антиаритмических препаратов I-IV классов по классификации Vaughan Williams, в основе механизма действия которых лежит их способность подавлять аномальную активность трансмембранных, потенциалзависимых ионных каналов (Na, K и Са), встроенных в клеточную мембрану кардиомиоцитов. К сожалению, представленные на фармацевтическом рынке антиаритмические лекарственные средства, несмотря на достаточно высокую эффективность, обладают целым рядом существенных побочных эффектов (бронхоспазм, ортостатическая гипотензия, проатерогенное действие и др.), а также способностью угнетать функциию основного водителя ритма сердца - синусового узла [В.Г. Кукес. Клиническая фармакология // Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2014.). Не менее важно, что всем им присуще проаритмическое действие [Wolberette D.L. // Am. J. Cardiol., 2003, v. 91, P. 39D-44D; Nishimura H. Nippon Rinsho., 2007, v. 65, Suppl. 8. - Р. 430-435].

В связи с этим представляется очевидным, что целью антиаритмической терапии должно быть не только эффективное устранение нарушений сердечного ритма, но и улучшение качества жизни больного с гарантией безопасности применяемой терапии, т.е. при выборе антиаритмического лекарственного средства предпочтение должно быть отдано препарату, обладающему наименьшим количеством побочных эффектов, включая проаритмическое действие, особенно при необходимости его длительного регулярного приема.

На фоне многих синтетических антиаритмических лекарственных средств особое место занимает препарат растительного происхождения Аллапинин, получаемый из травы борца белоустого (Aconitum leucostomum Worosch) и корней и корневищ борца северного (Aconitum septentrionale Koelle (A. excelsum Reichenb)) семейства лютиковых - Ranunculaceae. Аллапинин (лаппаконитин гидробромид) предложен и запатентован отечественными учеными [SU 1335293, 08.05.1987] как лекарственное средство для лечения аритмии сердца; получены патенты в США [US 4656178, 07.04.1987], во Франции [FR 2551975, 22.03.1985], Швейцарии [СН 661208, 15.07.1987] и других странах [JPS 6061527, 09.04.1985], [JPH 0341448, 24.06.1991].

Аллапинин является ингибитором быстрого входящего трансмембранного натриевого тока и относится к классу IС антиаритмиков по классификации Vaughan Williams, замедляет проведение импульсов по предсердиям и системе Гиса-Пуркинье, однако в отличие от большинства антиаритмиков I класса не угнетает автоматизм синусового узла, не оказывает отрицательного инотропного действия и не вызывает гипотензию. Лаппаконитин гидробромид с успехом применяют для купирования как предсердных, так и желудочковых нарушений ритма сердца, а также предупреждения пароксизмов наджелудочковых тахиаритмий. Препарат блокирует антеградные (аномальные) проводящие пути, что делает его особенно эффективным при лечении больных с синдромом WPW, в том числе и рефрактерных к другим антиаритмическим лекарственным средствам [http://allapinin.ru/faq.php?page=1. С.Ф. Соколов. Аллапинин® и современные подходы к лечению нарушений ритма сердца (методические рекомендации по применению препарата) ФГУ РКНПК Росмедтехнологий].

Согласно ФСП 42-8380-07 использующийся в медицинской практике препарат Аллапинин® представляет собой гидробромид алкалоида лаппаконитина с сопутствующими алкалоидами и используется в виде 0,5% раствора для инъекций [RU №2238103] и таблеток 25 мг [Р N000405/02-010811], содержащих вспомогательные вещества - сахарозу (сахар), крахмал картофельный; кальция стеарат; натрий кроскармеллозу. Известно техническое решение, представляющее собой композицию (Аллафорте®), обеспечивающую пролонгированное антиаритмическое действие активного компонента лаппаконитин гидробромида с сопутствующими алкалоидами, содержащую прожелатинизированый крахмал, моногидрат лактозы гипромеллозу, стеарат кальция и коллоидный диоксид кремния [RU 2513580, 20.04.2014]. Известно техническое решение, относящееся к средствам для лечения различных форм нарушения ритма сердца и представляющее собой комплексное соединение дитерпенового алкалоида лаппаконитина с глицирризиновой кислотой [RU 2180583, 20.03.2002], однако данные о доклинических исследованиях отсутствуют. Известно техническое решение, относящееся к области медицины, а именно к кардиохирургии, которое касается профилактики нарушений ритма сердца при коронарном шунтировании и предусматривает использование лаппаконитин гидробромида в предоперационно - и после операционном периодах [RU 23929939, 27.06.2010]. В настоящее время из перечисленных в медицинской практике используется только препарат Аллапинин®.

Несмотря на высокий антиаритмический индекс, высокая токсичность не позволяет в клинике проявить все преимущества Аллапинина перед существующими препаратами аналогичного типа действия. В ранние сроки лечения лаппаконитин гидробромидом наиболее часто встречаются внекардиальные побочные эффекты. Более выраженные головокружения, часто сочетающиеся с головной болью и нарушением фиксации взора, могут обусловить необходимость снижения дозы препарата. Установлено, что эти симптомы вызваны высокими дозами лаппаконитин гидробромида. Описаны другие редкие внекардиальные побочные эффекты, определенно связанные с приемом аллапинина (почечная колика, кожный зуд).

Побочные эффекты лаппаконитина гидробромида в 22,4% случаев не позволяют достичь терапевтической дозы препарата. При достижении этой дозы они встречаются у 31,2% больных [С.Ф. Соколов. Современные подходы к лечению больных с нарушениями ритма сердца и результаты клинического изучения препарата аллапинин // Вестник аритмологии. 2011. №64. С. 60].

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение, заключается в создании эффективного, низкотоксичного комбинированного лекарственного средства для лечения различных форм нарушения ритма сердца и, следовательно, расширения спектра используемых в клинике антиаритмических лекарственных средств.

Поставленная задача решается созданием фармацевтической комбинации на основе растительного алкалоида лаппаконитина, обладающей антиаритмическим действием. Наиболее близким аналогом заявляемой фармацевтической комбинации является лекарственное средство Аллапинин (лаппаконитин гидробромид).

Сущность предлагаемого технического решения заключается в составе фармацевтической комбинации, включающей лаппаконитин, глицирризиновую кислоту и метилурацил при мольном соотношении компонентов: лаппаконитин : глициризиновая кислота : метилурацил, равном 1:4:2.

В предлагаемом техническом решении, так же как и в прототипе, активным веществом, обладающим антиаритмическими свойствами, является алкалоид лаппаконитин, используемый в прототипе в виде гидробромида, а в заявленном техническом решении в виде компонента в составе фармацевтической комбинации.

Известно, что оксидативный стресс играет важную роль в патогенезе различных нарушений ритмической активности сердца, вызывая нарушение метаболизма сократительных кардиомиоцитов и клеток проводящей системы сердца и, как следствие этого, развитие электрической нестабильности миокарда [Tse G. et al., Reactive Oxygen Species, Endoplasmic Reticulum Stress and Mitochondrial Dysfunction: The Link with Cardiac Arrhythmogenesis // Front Physiol. 2016 Aug 3; 7:313; 1-11; Joseph LC. et al., Mitochondrial oxidative stress during cardiac lipid overload causes intracellular calcium leak and arrhythmia //Heart Rhythm. 2016 Aug; 13(8): 1699-706], что и послужило основанием для рекомендаций об использовании в качестве компонента антиаритмической терапии соединений с антиоксидантной активностью [Sirish Р et al., Molecular Mechanisms and New Treatment Paradigm for Atrial Fibrillation // Circ Arrhythm Electrophysiol. 2016. May; 9(5). P ii: e003721].

Показано, что глицирризиновая кислота является растительным селективным ингибитором тромбина, перспективна для применения при патологических процессах в сердце, сопровождающихся воспалительными и некротическими изменениями миокарда, в частности при миокардитах и инфаркте миокарда; снижает повышение сывороточного уровня маркерных ферментов (креатинфосфаткиназы, лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови, препятствует снижению содержания в миокарде гликогена и повышению содержания общих липидов, активации перекисного окисления липидов и снижению антиоксидантной активности сыворотки крови [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П. и др. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. - Новосибирск: Гео, 2006. - 311 с.]. Самостоятельного терапевтического значения при лечении нарушений ритма сердца не имеет.

Метилурацил ускоряет процессы клеточной регенерации, стимулирует клеточные и гуморальные факторы защиты, оказывает иммуностимулирующее и противовоспалительное действие, является стимулятором лейкопоэза, обладает анаболической и антикатаболической активностью [Фтизиатрия. Национальное руководство / Под ред. М.И. Пепельмана. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 505 с.]. Метилурацил применяют при различных состояниях, связанных с нарушением обменных процессов. Он повышает устойчивость тканей к гипоксии, способствует усвоениию глюкозы, стимулирует обмен нуклеиновых кислот, активирует холинергическую передачу и т.д. Как монопрепарат не имеет терапевтического значения при лечении нарушений ритма сердца.

В рамках доклинических исследований заявляемой фармацевтической комбинации (далее заявляемая комбинация) изучали:

1. Острую токсичность изучали на лабораторных животных по стандартной методике. В экспериментах на мышах было установлено, что LD₅₀ заявляемой комбинации у самцов составила 260,7 мг/кг при внутрижелудочном способе введения и 71 мг/кг при внутрибрюшинном пути поступления. В отношении самок мышей установленная LD₅₀ при внутрижелудочном способе введения составила 365 мг/кг и 94 мг/кг при внутрибрюшинном пути поступления.

Исследования острой токсичности, выполненное на крысах, показало, что LD₅₀ у самцов составила 500 мг/кг при внутрижелудочном способе введения и 70 мг/кг при внутрибрюшинном пути поступления. У самок установленная LD₅₀ при внутрижелудочном способе введения соответствует 610 мг/кг и при внутрибрюшинном пути поступления - 86 мг/кг (таблица 1).

Исследование острой токсичности и клинической картины интоксикации показало, что заявленная комбинация относится к группе соединений 3-го класса опасности по ГОСТу 12.1.007-76.

2. Изучение антиаритмической активности заявляемой комбинации и лаппаконитин гидробромида проводили на модели аконитиновой аритмии.

Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 160-180 г, Животные были рандомизированы на 7 групп: 1-я (n-13) - контроль, 2-я (n-6) - получала лаппаконитин гидробромид (0,5 мг/кг, в/в), 3-я (n-6) - получала лаппаконитин гидробромид (0,25 мг/кг, в/в), 4-я (n-6) - получала лаппаконитин гидробромид (0,125 мг/кг, в/в), 5-я (n-6) - заявляемая комбинация (0,5 мг/кг, в/в), 6-я (n-6) - заявляемая комбинация (0,25 мг/кг, в/в), а 7-я (n-6) - заявляемая комбинация (0,125 мг/кг, в/в).

Изучаемые соединения вводили в/в (в 0,2-0,3 мл апирогенной воды для инъекций) за 2 минуты до введения аконитина (30 мкг/кг). Непрерывную регистрацию ЭКГ начинали за 2 минуты до начала введения аконитина или исследуемых соединений и продолжали в течение 20 минут от момента окончания в/в введения аконитина.

В каждой экспериментальной группе подсчитывали количество животных, у которых возникала политопная экстрасистолия (ПЭС), и количество крыс с нарушениями ритма сердца (ПЭС+бигемения). Оценивали время возникновения нарушений ритма и на основе этого показателя проводили балльное шкалирование антиаритмической активности веществ: аритмии возникали в первые 5 минут после введения аконитина гидрохлорида в подобранной дозе - 0 баллов; нарушения ритма появлялись с 6-й по 10-ю минуту - 1 балл; аритмии возникали с 11-й по 15-ю минуту - 2 балла; нарушения ритма возникали с 16-й по 20-ю минуту наблюдения - 3 балла; аритмии не возникали в течение всего периода наблюдения (20 мин) - 4 балла.

Статистическую обработку данных, измеренных в бинарной шкале, проводили с помощью метода точной вероятности Фишера с учетом множественности сравнений. Результаты, полученные с использованием балльного шкалирования, обрабатывали с помощью непараметрического аналога дисперсионного анализа по Крускалу-Уоллесу с дальнейшим анализом методом множественных сравнений по Данну.

Результаты представлены в виде медиан и нижнего и верхнего квартилей. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Результаты оценки антиаритмической активности заявляемой комбинации и прототипа - лаппаконитин гидробромида на модели аконитиновой аритмии приведены в таблице 2. Здесь и далее дозы заявляемой комбинации указаны в пересчете на содержание лаппаконитина.

Данные таблицы 2 по сравнительному изучению антиаритмической активности лаппаконитин гидробромида и заявляемой комбинации на модели аконитиновой аритмии, патогномоничной для антиаритмических средств 1 класса по классификации Vaughan Williams свидетельствуют о том, заявляемая комбинация реализует свое антиаритмическое действие в существенно меньшей дозе.

Примечание: р указано по отношению к контролю

3. Изучение противофибрилляторной активности заявляемой комбинации и прототипа - лаппаконитина гидробромида проводили на модели реперфузионной фибрилляции сердца у крыс.

Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 350-450 г, Наркотизированных (уретан 1300 мг/кг, в/б) животных переводили на искусственное дыхание при помощи аппарата искусственной вентиляции легких для мелких животных (Ugo Basele, Италия), после чего производили тороко- и перикардотомию и под левую нисходящую коронарную артерию сразу же после ее выхода из-под ушка подводили лавсановую лигатуру. Ишемию миокарда вызывали одномоментной перевязкой коронарной артерии. Через 8 минут лигатуру снимали. Оценивали наличие/отсутствие фибрилляции желудочков сердца в течение 3-х минут от момента начала реперфузии. Исследуемые соединения (в/в, в 0,2-0,3 мл апирогенной воды для инъекций), а в контрольной серии - апирогеннню воду для инъекций вводили за 5 минут до начала реперфузии. Регистрацию ЭКГ (II стандартное отведение) начинали за минуту до перевязки коронарного сосуда и продолжали в течение всего эксперимента. В работе использовали цифровой электрокардиограф Поли-Спектр-8В (Нейрософт, Россия).

Для оценки противофибрилляторного и антиаритмического действия в каждой группе подсчитывали количество животных, у которых возникала: необратимая фибрилляция желудочков сердца (ФЖ), опасные для жизни аритмии - обратимая фибрилляция желудочков сердца (ОФЖ) или желудочковая тахикардия, экстрасистолия. С помощью балльного шкалирования оценивали тяжесть аритмогенеза: отсутствие аритмий - 0 баллов; экстрасистолия - 1 балл; желудочковая тахикардия - 2 балла; ФЖ с последующим восстановлением ритма - 3 балла; ФЖ, приводящая к остановке сердца, - 4 балла.

Статистическую обработку данных, измеренных в бинарной шкале, проводили с помощью метода точной вероятности Фишера с учетом множественности сравнений. Результаты, полученные с использованием балльного шкалирования, обрабатывали с помощью непараметрического аналога дисперсионного анализа по Крускалу-Уоллесу с дальнейшим анализом методом множественных сравнений по Данну.

Результаты представлены в виде медиан и нижнего и верхнего квартилей. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Результаты оценки антифибрилляторной активности заявляемой комбинации и лаппаконитин гидробромида на модели реперфузионных аритмий приведены в таблице 3.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что в контрольной серии экспериментов (n=16) в условиях окклюзии и последующей реперфузии коронарной артерии нарушения ритма сердца наблюдались во всех случаях, в том числе обратимая фибрилляция желудочков сердца или желудочковая тахикардия возникали у 13 животных, у 12 из которых желудочковая тахикардия переходила в необратимую фибрилляцию желудочков сердца. Следует отметить, что во всех случаях необратимая фибрилляция желудочков сердца возникала в условиях реперфузии. Заявляемая комбинация в дозах 1,0; 0,5 и 0,25 мг/кг статистически значимо уменьшала частоту возникновения различных нарушений ритма сердца (табл. 3). Так, например, в группе крыс (n=15), получавших заявляемую комбинацию в дозе 0,5 мг/кг, аритмии возникли только в 7 случаях (р=0,004), в том числе обратимая фибрилляция желудочков сердца или желудочковая тахикардия наблюдались лишь у 2 животных (р=0,001), из которых только у одного тахикардия перешла в необратимую фибрилляцию желудочков сердца (р=0,001). Лаппаконитин гидробромид, в отличие от заявляемой комбинации, был эффективен лишь в дозе 0,5 мг/кг.

Примечание: р указано по отношению к контролю.

Таким образом, как следует из полученных данных, на модели реперфузионных аритмий у крыс лаппаконитин гидробромид и заявляемая комбинация проявляют антиаритмическую и противофибрилляторную активность, однако последняя реализует свои эффекты в значительно меньших дозах.

4. Изучение продолжительности противоаритмического действия заявляемой комбинации и лаппаконитин гидробромида при введении внутривенно и per os проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 160-180 г, Животные были рандомизированы на 6 групп: 1-я (n=6) получала лаппаконитин гидробромид (0,5 мг/кг, в/в), 2-я (n=6) получала лаппаконитин гидробромид (1,5 мг/кг, per os), 3-я (n=6) - заявляемая комбинация (0,5 мг/кг, в/в), 4-я (n=6) - заявляемая комбинация (1,5 мг/кг, per os), 5-я (n=8) - контроль, в/в, 6-я (n=18) - контроль, per os.

Величина подобранной дозы аконитина 30 мкг/кг (n=27, в/в, болюсом), которая во всех экспериментах в пределах 1-2 минут после окончания его введения вызывает политопную предсердно-желудочковую экстрасистолию; 1-й и 3-й группам животных изучаемые соединения вводили в/в (в 0,2-0,3 мл апирогенной воды для инъекций). Подобранную дозу аконитина вводили в/в через 2 часа после введения изучаемых соединений - 1а (n=6) и 3а (n=6) подгруппы; через 3 часа после введения изучаемых соединений - 1б (n=6) и 3б (n=6) подгруппы и т.д. Непрерывную регистрацию ЭКГ начинали за 2 минуты до начала введения аконитина и продолжали в течение 20 минут от момента окончания в/в введения аконитина. Аналогичным образом эксперимент был построен и в 2-й и 4-й группах, за исключением того, что изучаемые соединения вводили не в/в, a per os. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью метода точной вероятности Фишера с учетом множественности сравнений. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Как следует из результатов исследования, заявляемая комбинация по своей продолжительности действия не уступает эталонному препарату лаппаконитин гидробромиду.

5. Изучение механизма действия заявляемой комбинации проводили, используя смешанную нейроглиальную культуру клеток гиппокампа, выделенную из мозга новорожденных (Р1-3) крыс линии Вистар.

Электрическую активность нейронов регистрировали методом patch-clamp в конфигурации whole cell, с помощью усилителя Axopatch 200 В (Axon Instruments), ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1440А и пакета лицензионных программ pClamp 10.2 (Axon Instruments). Все эксперименты выполнялись при 24-27°С. В качестве внеклеточного раствора использовали среду Хенкса (мМ): NaCl - 139, NaНСО₃ - 4.17, NaH₂PO₄ - 0.4, KСl - 2.1, KН₂РO₄, СаСl₂ - 1.25, MgSO₄ - 1.25, HEPES - 8, D-глюкоза - 8, рН=7.4 (для доведения рН использовался раствор NaOH). Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектродов имел следующий состав в мМ: метансульфонат калия - 145, KСl - 20, Hepes - 10 EGTA - 0.5, MgCl₂ - 1, рН=7.2 (для доведения рН использовался раствор KОН). Сопротивление кончика пипетки 4.5-6 МОм. Рассматривались лишь клетки со значением сопротивления доступа не более 25 МОм.

Для исследования натриевых токов использовалась культура нейронов гиппокампа возрастом 1-3 дня. Для записи натриевых токов использовался внутриклеточный раствор, в котором все соли калия были заменены на соли цезия с целью ингибирования калиевых токов (для доведения рН использовался раствор CsOH). Записи производились в режиме фиксации потенциала. После добавки вещества на клетку подавались ступеньки напряжения -30 mV (ток достигал максимальных значений у большинства клеток при этом стимуле) продолжительностью 50 мс, с интервалом 5 с на протяжении 5 минут. Для стандартизации значений токов результаты записи с каждой клетки делились на емкость данной клетки.

Для исследования влияния веществ на вызванные потенциалы действия и интервалы между ними были использованы культуры возрастом 9-10 дней. Записи производились в режиме фиксации тока. На клетки подавались токовые стимулы различных значений (от 10 до 200 рА с шагом 5 рА), продолжительность стимуляции составляла 500 мс, интервалы между стимулами 5с. Регистрацию напряжения производили до и после 5-минутной стимуляции, аналогично опытам по регистрации тока. Эксперименты с каждой концентрацией веществ были повторены не менее чем на 3 культурах. Растворы исследуемых веществ каждый раз готовились непосредственно перед экспериментом.

Изучение механизма действия заявляемой комбинации показало, что

- заявляемая комбинации эффективно ингибирует быстрый входящий натриевый ток, протекающий через клеточную мембрану;

- обнаруженный эффект постепенного ингибирования Na⁺канала характерен для обоих соединений (лаппаконитин гидробромида и заявляемой комбинации) и указывает на то, что их ингибирующий эффект реализуется на уровне открытого натриевого канала;

- выявленные концентрационные зависимости действия (доза-эффект) лаппаконитин гидробромида и заявляемой комбинации на натриевый ток свидетельствуют о том, что эффективная доза заявляемой комбинации во всех случаях в 3-4 раза ниже, чем у лаппаконитин гидробромида;

- заявляемая комбинация более эффективно, чем лаппаконитин гидробромид, ингибирует медленную фазу деполяризации клеток, что приводит к уменьшению частоты потенциалов действия в пачке;

- в отличие от лаппаконитин гидробромида, заявляемая комбинация блокирует не только натриевые каналы, но частично и калиевые каналы, в силу чего ее можно отнести к антиаритмическим лекарственным средствам, потенциально обладающим свойствами антиаритмиков IA класса по классификации Vaughan Williams.

Таким образом, инновационными свойствами заявляемой в качестве антиаритмического лекарственного средства фармацевтической комбинации являются:

снижение эффективной антиаритмической дозы (по сравнению с лаппаконитин гидробромидом), при сохраненной длительности действия, как при энтеральном, так и парентеральном способе введения, что позволит расширить область клинического применения препарата и повысить комплайнс (приверженность) пациентов к лечению;

появление нового, не свойственного лаппаконитин гидробромиду, механизма антиаритмического действия - в отличие от прототипа заявляемая комбинация блокирует не только натриевые каналы, но и калиевые каналы, в силу чего ее можно отнести к антиаритмическим лекарственным средствам, потенциально обладающим свойствами антиаритмиков IA класса по классификации Vaughan Williams.