СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

Изобретение относится к способу определения концентрации флуоресцирующего вещества в среде, причем среду с флуоресцирующим веществом просвечивают возбуждающим излучением с длиной волны возбуждения, так что происходит возбуждение флуоресцирующего вещества с испусканием флуоресцентного излучения с длиной волны флуоресценции, причем производят измерение интенсивности флуоресцентного излучения, на основании которой определяют концентрацию флуоресцирующего вещества в среде.

Далее, изобретение относится к устройству для определения концентрации флуоресцирующего вещества среде по меньшей мере с первым источником излучения для испускания возбуждающего излучения с одной длиной волны возбуждения, с первым датчиком для измерения интенсивности флуоресцентного излучения, возбужденного возбуждающим излучением, имеющего одну длину волны флуоресценции, и с вычислительным блоком для определения концентрации флуоресцирующего вещества в зависимости от интенсивности флуоресцентного излучения.

Из уровня техники известен способ для определения наличия флуоресцирующего вещества в среде, при котором флюоресцирующее вещество целенаправленно возбуждают возбуждающим излучением для флуоресцентного излучения. Интенсивность флуоресцентного излучения измеряют, чтобы в зависимости от результата измерения сделать заключение о наличии флуоресцирующего вещества. Измерение флуоресценции как таковое не рассматривается, однако, в целом в качестве надежного количественного способа измерения, так как сделать вывод о концентрации флуоресцирующего вещества на основании интенсивности флуоресцентного излучения можно лишь в исключительных случаях. В иммунологии, например, антитела оснащают флуоресцирующей химической группой, так что места, в которых антитела связываются, можно распознать на основании флуоресценции. Таким образом можно также частично количественно определять концентрацию антигенов.

В практических условиях каждый раз наблюдалось, что желаемая точность определения концентрации обычно не достигается путем измерения флуоресценции. С одной стороны, наблюдалось влияние геометрии измерительной камеры на точность измерения. Удовлетворительные результаты не были достигнуты также при изменяющихся во времени условиях. Эту проблему еще не удавалось решить ранее.

В соответствии с этим задача настоящего изобретения заключается в создании способа и устройства указанного выше типа, с помощью которого или которых обеспечивается возможность высокоточного определения концентрации флуоресцирующего вещества. В частности, стремятся к уменьшению или исключению влияния геометрии измерительной камеры на точность измерения. К тому же определение концентрации должно производиться с высокой точностью также при изменяющихся во времени условиях.

В соответствии с изобретением для решения этой задачи в дополнение к этому измеряют интенсивность прошедшей составляющей возбуждающего излучения, причем концентрацию флуоресцирующего вещества определяют на основании интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения и интенсивности флуоресцентного излучения.

Предпочтительным образом по этой причине не только, как прежде, измеряют флуоресценцию, но и учитывают в дополнение к этому, что поглощение возбуждающего света в пробе с флуоресцирующим веществом также может влиять на интенсивность измеренного флуоресцентного излучения. Степень влияния поглощения на определение концентрации может зависеть, в частности, от длин пути прохождении света в пробе. В соответствии с этим влияние поглощения зависит, в частности, от геометрии измерительной камеры. Так как эти эффекты не учитывались при использовавшихся ранее измерениях флуоресценции, из измеренной интенсивности флуоресценции как таковой нельзя сделать вывод о концентрации флуоресцирующего материала в пробе. В отличие от этого соответствующий изобретению способ можно использовать в качестве высокоточного количественного способа для определения концентрации флуоресцирующего вещества. С одной стороны, было установлено, что при осуществлении способа для определения концентрации флуоресцирующего вещества поглощение возрастает пропорционально флуоресценции. Это означает, что необходимый для измерения флуоресценции возбуждающий свет ослабляется с возрастанием глубины проникновения в среду пробы, что ведет к уменьшению вытекающего сигнала флуоресценции. В соответствии с этим на практике при неизвестных пробах часто возникает поглощение возбуждающего света в пробе, которая причинно не связана с флуоресценцией или с концентрацией вызывающего флуоресценцию веществом. Поэтому в общем в случае выполнения чисто измерения флуоресценции возникает внутренне присущая системная ошибка, которую невозможно откорректировать с помощью информации из флуоресцентного излучения. В соответствии с изобретением эта ошибка исключается за счет того, что измеряют прошедшую составляющую возбуждающего излучения, которая поясняет поглощение возбуждающего излучения при прохождении через измерительный объем. Затем определение концентрации флуоресцирующего вещества производят на основе как флуоресценции, так и пропускания возбуждающего излучения. Этот способ имеет, в частности, преимущество в случае, если мутность пробы или увеличенное по другим причинам поглощение возбуждающего излучения, например, в результате добавки химических реактивов, ведет к ослаблению проходящего через среду возбуждающего излучения и в результате этого также к ослабленному сигналу флуоресценции. При измерении только флуоресценции изменение в сигнале было бы неотличимо от малой флуоресценции, в результате чего при определении концентрации был бы получен неточный или ошибочный результат. В отличие от этого одновременное измерение поглощения и флуоресценции, с одной стороны, создает то преимущество, что прошедшая составляющая возбуждающего излучения может быть привлечена для корректировки нелинейности и ошибочных измерений на основании поглощения возбуждающего излучения в пробе. Это является предпочтительным, например, в случае необходимости учета различных геометрий измерительных камер, принимающих пробы. Далее, например, из отношения между поглощением и флуоресценцией после дозированного ввода химических реактивов, в частности субстрата, может быть сделан вывод о качественном состоянии добавленного химического реактива. Следующее преимущество изобретения заключается в том, что при длительном протекании процесса измерения изменения концентрации могут быть с высокой точностью отличены от вариаций прозрачности пробы. При этом особо предпочтительно измерение интенсивности флуоресценции и интенсивности пропускания возбуждающего излучения одновременно на одном и том же элементе объема среды с флуоресцирующим веществом. Это создает преимущество прежде всего в том случае, если проба является неоднородной или ее состояние быстро изменяется с течением времени. При стабильных и однородных пробах, которые в дополнение к этому присутствуют в достаточном количестве, флуоресценцию и пропускание возбуждающего излучения можно измерять, однако, альтернативно в том же устройстве поочередно во временном отношении или (также синхронно) в отдельных измерительных устройствах.

В соответствии с одной особо предпочтительной формой исполнения среду с флуоресцирующим веществом просвечивают затем имеющим длину волны флуоресценции излучением поглощения флуоресценции излучением, измеряют интенсивность прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции и на основании интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучении, интенсивности флуоресцентного излучения и интенсивности прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции определяют концентрацию флуоресцирующего вещества. По этой причине при таком исполнении пропускание или поглощение пробы при просвечивании излучением с длиной волны флуоресценции используют в качестве следующей входной величины для определения концентрации флуоресцирующего вещества. Измерение прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции производят при этом при отключенном возбуждающем излучении, так что пропускание пробы при просвечивании излучением с длиной волны флуоресценции может быть определено независимо от флуоресценции, возбужденной возбуждающим излучением. В соответствии с этим при таком исполнении концентрацию флуоресцирующего вещества определяют из тройки величин измерения, которая составлена, с одной стороны, из флуоресцентного излучения и, с другой стороны, пропускания возбуждающего излучения и излучения поглощения флуоресценции. Пропускание возбуждающего излучения или излучения поглощения флуоресценции при прохождении через среду с флуоресцирующим веществом добавляют при этом к сигналу флуоресценции в качестве корректировочных величин.

Для получения еще более точных результатов измерения предпочтительно предусмотрено, что в дополнение к этому производят измерение интенсивности имеющего длину волны возбуждения рассеянного света и на основании интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения, интенсивности флуоресцентного излучения и интенсивности рассеянного света и в случае необходимости (то есть если она была измерена) на основании интенсивности прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции также определяют концентрацию флуоресцирующего вещества. Измерение рассеянного излучения производят, в частности, с помощью третьего датчика излучения, который предпочтительно чувствителен к длине волны возбуждения или перед которым включен соответствующий полосовой фильтр с центральной длиной λех волны.

Для измерения с высокой точностью концентрации предпочтительно предусмотрено, что концентрацию флуоресцирующего вещества определяют из семейства характеристических кривых, которое указывает концентрацию флуоресцирующего вещества в зависимости от интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения, интенсивности флуоресцентного излучения и, если применимо (то есть, если она измерена), от интенсивности прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции и/или от интенсивности рассеянного света. Семейство характеристических кривых может быть получено эмпирическим путем. Альтернативно возможно использование модели вычисления, которая устанавливает входные величины для определения концентрации флуоресцирующего вещества относительно друг друга.

В соответствии с этим для определенных случаев использования благоприятно, если семейство характеристических кривых указывает концентрацию флуоресцирующего вещества дополнительно в зависимости от водородного показателя pH и/или температуры среды, в результате чего получают семейство характеристических кривых с соответственно более высокой размерностью.

При этом благоприятно, в частности, если семейство характеристических кривых определяют предшествующим определению концентрации флуоресцирующего вещества способом измерения, в котором для заранее заданных эталонных концентраций флуоресцирующего вещества соответственно измеряют интенсивность флуоресцентного излучения, интенсивность прошедшей составляющей возбуждающего излучения и, если применимо, интенсивность прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции и/или интенсивность рассеянного света. Предпочтительным образом за счет этого можно определить специфическое для композиции измерения, однозначное отношение между концентрацией флуоресцирующего вещества и входными величинами, которое привлекают при определении неизвестной концентрации флуоресцирующего вещества. Для повышения разрешающей способности благоприятно, если точки измерения семейства характеристических кривых известным по себе образом интерполированы с помощью одной аппроксимирующей кривой. В случае учета рассеянного света могут выполняться несколько этапов измерения для одинакового поглощения и изменяющегося рассеяния. Альтернативно к такому способу измерения или калибровки отношение между концентрацией и отдельными величинами измерения тоже может быть получено с помощью математической взаимосвязи.

Для улучшения точности измерения благоприятно, если прошедшая составляющая возбуждающего излучения после прохождения через среду с флуоресцирующим веществом отклоняется, прежде чем будет произведено измерение интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения. Тем самым можно предпочтительным образом избежать мешающих эффектов, которые могли бы возникнуть при измерении пропускания возбуждающего излучения в направлении просвечивания среды с флуоресцирующим веществом.

Устройство указанного выше типа отличается тем, что второй датчик предусмотрен для измерения интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения, причем вычислительный блок настроен для определения концентрации флуоресцирующего вещества в зависимости от интенсивности прошедшей составляющей возбуждающего излучения и интенсивности флуоресцентного излучения.

Таким образом, могут быть достигнуты те же преимущества и технические эффекты, что и при поясненном выше способе, так что дается ссылка на указанные выше исполнения. Вычислительный блок содержит при этом предпочтительно одно запоминающее устройство, в котором записано семейство характеристических кривых, которое содержит отношение между концентрацией флуоресцирующего вещества и интенсивностью прошедшей составляющей возбуждающего излучения, интенсивностью флуоресцентного излучения, предпочтительно также интенсивностью прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции.

Для дальнейшего повышения точности определения концентрации благоприятно предусмотрение второго источника излучения для просвечивания среды с флуоресцирующим веществом с излучением поглощения флуоресценции, имеющим длину волны флуоресценции. Второй источник излучения может включать или выключать независимо от первого источника излучения, так что может быть определено поглощение излучения, имеющего длину волны флуоресценции, при прохождении через среду при включенном состоянии второго источника излучения и при выключенном состоянии первого источника излучения.

Предпочтительно первый датчик предназначен для измерения интенсивности прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции. Альтернативно для измерения прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции может быть предусмотрен собственный, третий датчик. Первый датчик соединен с вычислительным блоком, который содержит интенсивность флуоресценции и интенсивность излучения поглощения флуоресценции в качестве следующих входных величин (наряду с пропусканием возбуждающего излучения) для определения концентрации флуоресцирующего вещества.

В соответствии с этим предпочтительно использование третьего датчика интенсивности рассеянного света. Третий датчик соединен с вычислительным блоком, который содержит интенсивность рассеянного света в качестве следующей входной величины для определения концентрации флуоресцирующего вещества.

В соответствии с одним предпочтительным исполнения с первым источником излучения и/или вторым источником излучения соответственно связан один эталонный датчик для калибровки первого или второго источников излучения. В одном предпочтительном исполнении, например, в то время как постоянное процентное число возбуждающего света с помощью частично прозрачного зеркала отделяют от траектории лучей и подводят к эталонному датчику, эталонный датчик постоянно измеряет интенсивность возбуждающего излучения. Этот эталонный сигнал в каждый момент времени сравнивают с измеренными сигналами (пропускания и флуоресценции). По этой причине сигналы измерения постоянно относятся к измеренной в тот же момент времени интенсивности возбуждающего света. Тем самым, предпочтительным образом обеспечивается, что возможные колебания интенсивности возбуждающего света не оказывают никакого влияния на результат измерения.

При одном предпочтительном использовании предусмотрена измерительная камера, в частности кювета, для приема среды с флуоресцирующим веществом. Предпочтительно среда с флуоресцирующим веществом присутствует в виде жидкой пробы. Альтернативно концентрацию флуоресцирующего вещества можно определяют в газообразной среде. В некоторых исполнения благоприятное предусмотрение нескольких измерительных камер, которые соответственно настроены на различные длины волн флуоресценции и/или возбуждения, так что возможно определения концентраций различных флуоресцирующих веществ с помощью одного и того же устройства. При этом благоприятно использование согласованных с соответствующими длинами волн семейств характеристических кривых, например, с помощью описанного выше способа измерения.

В соответствии с одним следующим предпочтительным исполнением предусмотрено, что первый источник излучения предназначен для испускания возбуждающего излучения, содержащего несколько длин волн возбуждения, в частности по существу с непрерывным спектром возбуждения. Для этого предпочтительно используют семейства характеристических кривых концентрации для одного, по меньшей мере по существу непрерывного диапазона длин волн возбуждения или флуоресценции, за счет чего способ может быть расширен до определения концентрации флуоресцирующего вещества в одном по меньшей мере по существу непрерывном диапазоне длин волн. Для этого может быть осуществлен описанный выше способ измерения в узких частотных разнесениях для большого количества длин волн возбуждения или флуоресценции, в результате чего получают семейства характеристических кривых для интересующего диапазона длин волн. В этом случае нет необходимости в том, чтобы первый источник излучения был настроен для испускания монохроматического возбуждающего излучения (или второй источник излучения был настроен для испускания монохроматического излучения поглощения флуоресценции), как это предпочтительно предусмотрено при исследовании одной отдельной, по существу дискретной длины волны флуоресценции и/или возбуждения. Вместо этого первый источник излучения настраивают для испускания возбуждающего излучения, содержащего несколько длин волн возбуждения, в частности, по существу с непрерывным спектром возбуждения. В качестве первого или второго датчика, по мере надобности в качестве эталонного датчика, при этом исполнении предпочтительно предусмотрен спектрометр. В соответствии с этим при этом исполнении благоприятно отсутствие второго источника излучения для испускания излучения поглощения флуоресценции и в дополнение к этому датчика для интенсивности рассеянного света, так как информация, которая может быть отображена ими, уже содержатся в спектре поглощения или флуоресценции.

Во избежание ухудшающих точность измерения мешающих эффектов благоприятно расположение между измерительной камерой и вторым датчиком одного отклоняющего зеркала для отклонения прошедшей составляющей возбуждающего излучения.

Предпочтительно отклоняющее зеркало обеспечивает отклонение прошедшей составляющей возбуждающего излучения под углом по существу 90о. За счет этого можно предпочтительным образом существенно улучшить точность при измерении пропускания возбуждающего излучения.

Для устранения связи возбуждающего излучения особо благоприятно, если в качестве отклоняющего зеркала предусмотрен светоделитель, в частности избирательный по частоте светоделитель. Предпочтительно избирательный по частоте светоделитель выполнен в качестве длинноволнового пропускающего фильтра (то есть в частотном диапазоне в качестве фильтра нижних частот), которые не отражает, а пропускает излучения с длиной волны флуоресценции. С помощью такого исполнения можно добиться, в частности, того, что отраженное от второго датчика излучения с длиной волны флуоресценции не возвращается назад через измерительную камеру и, следовательно, к первому датчику. Одновременно с помощью этого можно предотвратить прохождение излучения с длиной волны флуоресценции из измерительной камеры ко второму датчику. Это имеет значение, в частности, по той причине, что интенсивности прошедшего излучения и флуоресцентного излучения могут быть на порядки различными. Первый датчик (флуоресцентный датчик) может быть по этой причине более чувствительным по сравнению со вторым датчиком (датчиком пропускания). Предпочтительно с отклоняющим зеркалом также связан второй источник излучения для испускания излучения поглощения флуоресценции. При этом к тому же благоприятно, если светоделитель является избирательным по частоте. Предпочтительно граничная длина волны селективного по частоте светоделителя лежит между длиной волны возбуждения и длиной волны флуоресценции. За счет этого можно, в частности, добиться того, что прошедшая составляющая возбуждающего излучения по существу целиком поступает во второй датчик.

Изобретение поясняется ниже еще более подробно на основании изображенных на чертежах предпочтительных примеров исполнения, которыми оно, однако, не должно быть ограничено. Чертежи показывают по отдельности:

Фиг. 1 показывает вид соответствующего изобретению устройства для определения концентрации флуоресцирующего вещества в среде;

Фиг. 2 показывает вид альтернативного исполнения устройства для определения концентрации флуоресцирующего вещества;

Фиг. 3 показывает вид следующего исполнения устройства для определения концентрации флуоресцирующего вещества;

Фиг. 4 показывает вид следующего исполнения устройства для определения концентрации флуоресцирующего вещества;

Фиг. 5 схематически показывает вычислительный блок для определения концентрации флуоресцирующего вещества;

Фиг. 6 показывает диаграмму для пояснения взаимосвязи между возбужденной флуоресценцией или пропусканием возбуждающего излучения и проницаемостью среды, причем различные кривые измерения изображены для постоянной эталонной концентрации;

Фиг. 7 показывает диаграмму с семейством характеристических кривых для определения концентрации флуоресцирующим веществом в зависимости от флуоресценции и пропускания возбуждающего излучения; и

Фиг. 8 показывает диаграмму для пояснения увеличения сигнала флуоресценции, которое следует отнести не к повышению концентрации флуоресцирующего вещества, а к увеличению пропускания возбуждающего излучения.

Фиг. 1 показывает устройство 1 для определения концентрации с флуоресцирующего вещества в среде, которая размещена в измерительной камере 2. В показанном исполнении в качестве измерительной камеры 2 предусмотрена кювета, в которую помещена жидкая проба с флуоресцирующим веществом. Устройство 1 содержит один первый источник 3 излучения для испускания возбуждающего излучения с длиной λех волны возбуждения. К тому же один первый датчик 4 предусмотрен для измерения интенсивности возбужденного возбуждающим излучением флуоресцентного излучения (коротко: флуоресценция), которая имеет большую по сравнению с длиной λem волны возбуждения длину λem волны флуоресценции. Общеизвестным образом свет флуоресценции имеет всегда большую длину волны, то есть более низкую частоту (или энергию), нежели ее свет возбуждения.

Как видно, далее, из фиг. 1, в дополнение к этому предусмотрен один второй датчик 5, с помощью которого измеряют интенсивность Itrans,ex (коротко: пропускания возбуждающего излучения). Пропускание возбуждающего излучения, которое является косвенно пропорциональным поглощению возбуждающего излучения при прохождении через пробу, измеряют одновременно с измерением интенсивности Ifluor флуоресцентного излучения.

В соответствии с этим предусмотрен вычислительный блок 6 (ср. фиг. 5), с помощью которого определяют концентрацию с флуоресцирующим веществом. В показанном исполнении концентрацию с определяют не только в зависимости от флуоресценции, но и к тому же в зависимости от пропускания возбуждающего излучения. Тем самым, можно существенно повысить точность измерения концентрации по сравнению с обычными способами, при которых привлекался исключительно сигнал флуоресценции, если измерение флуоресценции как таковое вообще могло обеспечить возможность количественного определения концентрации.

Как видно, далее, из фиг. 1, в дополнение к этому предусмотрен второй источник 7 излучения для просвечивания пробы излучением с длиной волны флуоресценции, который называют в последующем излучением поглощения флуоресценции. Интенсивность Itrans, em прошедшей составляющей (коротко: пропускание) излучения поглощения флуоресценции измеряют с помощью первого датчика 3, в то время как первый источник 3 излучения выключен.

Как видно, далее, из фиг. 1, с первым источником 3 излучения связан эталонный датчик 9, а со вторым источником 7 излучения связан эталонный датчик 10, с помощью которого может быть произведена калибровка первого источника 3 излучения или второго источника 7 излучения. Для этого постоянное, сравнительное малое процентное число возбуждающего света выводят с помощью частично прозрачного зеркала 25 из траектории лучей возбуждающего света и подводят к эталонному датчику 9 для непрерывного определения интенсивности возбуждающего излучения. Пропускание возбуждающего излучения и флуоресценцию (если применимо, также интенсивность рассеянного света, ср. фиг. 3) в каждый момент времени приводят к эталонному сигналу, что произвести таким образом калибровку сигнала измерения. Соответствующим образом предусмотрен второй источник 7 излучения и следующее частично прозрачное зеркало 26, с помощью которого (сравнительно малая) составляющая излучения поглощения флуоресценции отводится в эталонный датчик 10. Таким образом может быть произведена калибровка относительно излучения поглощения флуоресценции.

Как видно, далее, из фиг. 1, устройство 1 в показанном исполнении содержит к тому одно отклоняющее зеркало 11, которое расположено между измерительной камерой 2 и вторым датчиком 5. Тем самым прошедшая составляющая возбуждающего излучения после покидания измерительной камеры 2 отклоняется относительно направления просвечивания. При этом отклоняющее зеркало 11 обуславливает отклонение прошедшей составляющей возбуждающего излучения на угол по существу под углом 90о относительно направления возбуждающего излучения при прохождении через измерительную камеру 2. В показанном исполнении в качестве отклоняющего зеркала 11 предусмотрен светоделитель, который избирательно по частоте выполнен с граничной длиной волны между длиной волны возбуждения и длиной волны флуоресценции, так что происходит не отражение, а пропускание излучения с длиной волны флуоресценции. За счет этого, с одной стороны, предотвращается попадание отраженного от второго датчика 5 излучения с длиной волны флуоресценции через измерительную камеру к первому датчику 4 и излучения с длиной волны флуоресценции из измерительной камеры 2 ко второму датчику 5.

В показанном исполнении перед эталонным датчиком 10 включен второй источник 7 излучения и перед вторым датчиком 5 включен соответственно один (опциональный) полосовой фильтр 12. На эталонном датчике 10 получают эталонную величину для интенсивности излучения поглощения флуоресценции для обеспечения возможности учета возможных колебаний интенсивности излучения поглощения флуоресценции.

Как видно, далее, из фиг. 1, между первым источником 3 излучения и измерительной камерой 2 предусмотрено следующее отклоняющее зеркало 13, с помощью которого производят ввод возбуждающего излучения с отклонением под углом по существу 90о в измерительную камеру 2. Отклоняющее зеркало 13 выполнено в соответствии с отклоняющим зеркалом 11 в качестве избирательного по частоте светоделителя, граничная длина волны которого лежит между длиной λех волны возбуждения и длиной λem волны флуоресценции. Первый датчик 4 расположен параллельно направлению просвечивания измерительной камеры 2 на обращенной от измерительной камеры 2 стороне отклоняющего зеркала 13. В дополнение к этому перед первым датчиком 4, равно как и перед эталонным датчиком 9 и первым источником 3 излучения опционально соответственно включен полосовой фильтр 14. Опциональное использование полосовых фильтров 12, 14 может зависеть, в частности, от характеристических кривых датчиков или источников излучения.

Фиг. 2 показывает альтернативное исполнение устройства 1 для определения концентрации с флуоресцирующим веществом, причем в последующем рассматривают исключительно отличия от фиг. 1.

В соответствии с фиг. 2 между первым источником 3 излучения и измерительной камерой 2 расположено частично прозрачное зеркало 15, с помощью которого составляющая возбуждающего излучения вводится в измерительную камеру 2 или может подводиться к эталонному датчику 9. На эталонном датчике 9 производится текущее определение эталонного сигнала для интенсивности возбуждающего излучения. Опционально перед первым источником 3 излучения может быть включен настроенный на длину волны возбуждения фильтр 16. Следующий фильтр 16 для длины λех возбуждения включен перед вторым датчиком 5 для определения пропускания возбуждающего излучения. Соответствующие, однако, настроенные на длину λem волны флуоресценции фильтры 17 связаны со вторым источником 7 излучения для испускания излучения поглощения флуоресценции и первому датчику 4 для определения пропускания излучения поглощения флуоресценции или флуоресценции.

В соответствии с фиг. 2 между вторым источником 7 излучения и измерительной камерой 2 расположено одно следующее частично прозрачное зеркало 18, с помощью которого соответственно одну составляющую излучения поглощения флуоресценции передают в измерительную камеру или подводят к эталонному датчику 10. На эталонном датчике 10 производят текущее определение эталонного сигнала для интенсивности излучения поглощения флуоресценции, который обеспечивает возможность точного определения пропускания излучения поглощения флуоресценции (и на основании этого поглощение флуоресцентного излучения в пробе).

В соответствии с фиг. 2 флуоресценцию измеряют под углом, в частности 90о, к направлению облучения возбуждающим излучением. В отличие от фиг. 1 при этом не предусмотрен светоделитель на пути прохождения лучей между измерительной камерой 2 и первым датчиком 4 или на пути прохождения лучей между измерительной камерой 2 и вторым датчиком 5.

Как видно из фиг. 3, при том исполнении в дополнение к этому с помощью одного третьего датчика 27 измеряют интенсивность Istreu,ex имеющего длину λех волны возбуждения рассеянного излучения и используют ее для определения концентрации флуоресцирующего вещества. В остальном конструкция по фиг. 3 соответствует показанной на фиг 1 форме исполнения, причем, само собой разумеется, также и при исполнении в соответствии с фиг. 2 может присутствовать третий датчик 27для определения рассеянного света.

В соответствии с фиг. 4 используют первый источник 3 излучения с более широким, непрерывным спектром возбуждения. При этом первый датчик 4, второй датчик 5 и эталонный датчик 9 выполнены в качестве спектрометра 28, 28' 28''. При этом исполнении можно отказаться от второго источника 7 излучения для испускания излучения поглощения флуоресценции и третьего датчика 27 для интенсивности рассеянного света.

Как видно из фиг. 5, вычислительный блок 6 принимает в качестве входных величин флуоресценцию, пропускания возбуждающего напряжения и соответственно опционально пропускание излучения поглощения флуоресценции и интенсивность рассеянного света. Вычислительный блок 6 содержит запоминающее устройство 8, в которое записано семейство характеристических кривых для определения концентрации с флуоресцирующего вещества из входных величин. В качестве исходной величины вычислительного блока 6 вычислительный блок 6 выдает искомую концентрацию с флуоресцирующим веществом.

Как уже упоминалось, концентрацию флуоресцирующего вещества определяют с помощью вычислительного блока 6 из величин измерения, которые сопряжены между собой с помощью записанного в запоминающее устройство 8 семейства характеристических кривых. Семейство характеристических кривых может быть определено посредством предшествующего определению концентрации способа измерения, который пояснен ниже.

В соответствии с фиг. 6 на первом этапе способа измерения или калибровки для определенных концентраций c1, с2 флуоресцирующего вещества применяют отдельные графики 19 измерения, причем и флуоресценцию (график 19' измерения) и пропускание возбуждающего излучения (график 19'' измерения) определяют в зависимости от D проницаемости пробы. Проницаемость D пробы можно поэтапно варьировать, например, за счет добавления мутного вещества. В результате этого возникают графики 19 измерения для флуоресценции (график 19' измерения) или для пропускания (график 19'' измерения) в зависимости от прозрачности или мутности пробы при соответственно неизменной концентрации флуоресцирующего вещества.

Как видно из фиг. 7, на следующем этапе поверх графика пропускания возбуждающего излучения наносят график флуоресценции (график 20 измерения), причем каждый график 20 измерения соответствует одной определенной эталонной концентрации с c1 по с3. Так возникает семейство кривых в двухмерном пространстве. В зависимости от исполнения можно дополнительно измерять также пропускание излучения поглощения флуоресценции или интенсивность рассеянного сета в зависимости от проницаемости пробы. В этом случае вместо двухмерной диаграммы по фиг. 7 получают семейство характеристических кривых в трехмерном пространстве (не показано). Каждая точка в (двух- или трехмерной в зависимости от исполнения) диаграмме соответствует при этом определенной концентрации флуоресцирующего вещества, так что получают однозначное отношение между величинами измерения и концентрацией с.

Альтернативно возможны также учет как рассеянного света, так и излучения поглощения флуоресценции, в результате чего получают четырехмерную матрицу состояния, при которой с каждой комбинацией из четырех параметров (например, флуоресценции, пропускания возбуждающего излучения, пропускания излучения поглощения флуоресценции и рассеянного излучения) однозначно связана одна концентрация с флуоресцирующим веществом.

В зависимости от количества графиков 20 измерения можно повысить точность определения концентрации. В соответствии с этим может быть также произведена математическая или числовая интерполяция для обеспечения возможности прямого пересчета дуплета величин измерения (или в зависимости от исполнения также триплета величин измерения или квартета величин измерения) в искомую концентрацию с.

Преимущества этого способа видны, например, из фиг. 8, где схематически изображена временная характеристика флуоресценции (сигнал 21) во время процесса измерения. Исследуется жидкая проба, к которой к моменту 22 времени добавляется буферный раствор. Позже добавляют субстрат, который обеспечивает возникновение флуоресцирующего вещества (стрелка 23). После дозированного введения субстрата сигнал флуоресценции сначала скачкообразно возрастает вследствие собственной флуоресценции субстрата. После этого наблюдается дальнейшее возрастание флуоресценции во времени, что производит видимость возрастающей концентрации флуоресцирующего вещества. За счет измерения пропускания возбуждающего излучения (сигнал 24) можно установить, однако, что пропускание при введении буферного раствора сначала скачкообразно снижается, так как буферный раствор в пробе ведет к тому, что свет не попадает более во второй датчик 5. В завершение с течением времени проницаемость пробы вновь возрастает, так что происходит возрастание пропускания возбуждающего излучения. Таким образом, также возрастает интенсивность возбуждающего сигнала для флуоресценции и, следовательно, сигнал флуоресценции. В соответствии с этим мнимое увеличение флуоресценции основано не на приблизительно изменении концентрации флуоресцирующего вещества, а на увеличении пропускания возбуждающего излучения.

Описанный выше способ может быть использован для определения концентрации флуоресцирующих веществ различного типа.

Интенсивность флуоресценции материала может при этом зависеть как от водородного показателя рН, так и от температуры в момент времени измерения. Описанное изобретение позволяет также добиться улучшения точности измерения флуоресценции также без определенного водородного показателя рН или без определенной температуры. Для обеспечения возможности определения концентрации вещества в пробе измеренная проба должна иметь, однако, тот же водородный показатель рН и ту же температуру, что и при калибровке. Этого достигают за счет добавления определенного количества буферного раствора и точного регулирования температуры измерительного устройства. Альтернативно семейство характеристических кривых может быть расширено параметрами водородного показателя рН и/или температурой, в результате чего получают семейство характеристических кривых с соответственно более высокой размерностью. Такое семейство характеристических кривых содержит четыре измерения (при учете исключительно интенсивности Itrans,ex прошедшей составляющей возбуждающего излучения и интенсивности Ifluor флуоресцентного излучения или пять или шесть измерений (при дополнительном учете интенсивности Itrans,em прошедшей составляющей излучения поглощения флуоресценции и/или интенсивности Istreu,ex рассеянного света.

В последующем в качестве примера описанного выше способа производят определение концентрации флуоресцеина натрия в водной среде.

Флуоресцеин натрия используют в качестве индикатора для исследования потоков грунтовых вод. Оптимальная длина волны возбуждения для флуоресцина натрия составляет 491 нм, максимум флуоресцентного излучения составляет 516 нм. Для определения концентрации флуоресцина в пробе сначала производят калибровку измерительного устройства, в то время как в соответствии с описанным выше составляют семейство характеристических кривых. Для этого поочередно измеряют эталонные растворы, которые имеют определенную концентрацию флуоресцина и отрегулированный с помощью буферного раствора постоянный водородный показатель рН, например, рН7. Измерение этих эталонных растворов производят при постоянной температуре, например, при 25оС. В ходе калибровки каждый эталонный раствор повторно измеряют при последовательном добавлении возрастающей концентрации непрозрачного вещества, например, формазина. При неизменной концентрации флуоресцеина и одновременном увеличении концентрации формазина производят запись соответствующих комбинаций величин измерения интенсивности флуоресценции, интенсивности пропускания, если применимо, также для интенсивности рассеянного света и интенсивности излучения поглощения флуоресценции. Этот процесс повторяют для различных концентраций флуоресцеина, так что возникает достаточно плотное семейство характеристических кривых, которое позволяет в достаточной степени отобразить общий подлежащий покрытию диапазон концентрации с помощью интерполяции или математического расчета.

После завершения калибровки измерительное устройство готово к использованию. Теперь к измерительному устройство подводят любую пробу, содержащую определенное количество буферного раствора для регулировки водородного показателя рН, причем определяют величины интенсивности для флуоресценции, пропускания, если применимо, также для рассеянного света и излучения поглощения флуоресценции. С помощью этого набора данных из семейства характеристических кривых определяют фактическую концентрацию флуоресцина.