МИКРООРГАНИЗМЫ - СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА РАСТЕНИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №61/570237, поданной 13 декабря 2011 г. Полное содержание вышеуказанной заявки включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к области устойчивого земледелия, а именно, к композициям ростостимулирующих микроорганизмов и способам, используемым для получения высокопродуктивных растений. В частности, изобретением предусмотрены композиции и способы, используемые для улучшения роста растений и/или подавления развития растительных патогенов и вызываемых ими болезней.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Эта заявка дополнительно содержит сопроводительный файл со списком последовательностей: "SGI1540_1WO_CRF_OF_SL_ST25.txt" размером 20 Кб, созданный 13 декабря 2012 г. Файлы могут быть открыты с использованием редактора Microsoft Word на компьютере, который использует операционную систему Windows OS.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Микрофлора окружающих растений очень разнообразна и включает бактерии, грибы, дрожжи, водоросли. Некоторые из этих микроорганизмов вредоносны для растений и часто ведут себя как патогены, тогда как другие являются полезными для растений и выступают стимуляторами роста растений и продуктивности их урожая. Недавние успехи в области почвенной микробиологии и биотехнологии растений привели к увеличенному интересу в отношении использования микробных агентов в сельском хозяйстве, садоводстве, лесоводстве и экологическом менеджменте. В частности, ряд микроорганизмов, которые, как известно, присутствуют в почвенной экологической нише, более известные как ризосфера и ризоплан, получили значительное внимание касательно их способности стимулировать рост растения. Действительно, ризосфера почвы представляет собой хороший резервуар для целей потенциальной изоляции полезных микроорганизмов. Ризосфера растения может содержать миллиарды микроорганизмов в одном грамме почвы. Согласно имеющимся теоретическим представлениям, микробные инокулянты без вмешательства человека обычно характеризуются низким уровнем жизнеспособности и эффективности в их естественном почвенном окружении из-за недостаточной активности колониеобразования, т.е. способности к формированию определенного количества единиц на один грамм почвы. Поэтому, начиная с 1960-х годов, был разработан и поставлен на промышленную основу ряд биоудобрений, отличающихся повышенной потенциальной концентрацией инокулюма колоний, с целью сократить потребность в химических удобрениях.

[0004] Кроме того, исследования, проведенные в последние годы показали, что микроорганизмы могут использоваться в качестве биологических агентов защиты в целях увеличения сельскохозяйственной производительности и эффективности. Обнаружено, что различные микроорганизмы могут оказывать угнетающее действие на растительные патогены и/или стимулировать рост растения, предоставляя тем самым привлекательную альтернативу химическим пестицидам, которые все менее одобряются из-за их потенциально отрицательного воздействия на здоровье человека и качество окружающей среды.

[0005] Микроорганизмы, способные колонизировать корни растений и стимулировать рост растений, общеизвестны как микроорганизмы-стимуляторы роста растений (МСРР). За прошедшие два десятилетия исследованы много разновидностей МСРР, оказывающих положительное влияние на рост большого разнообразия высокопродуктивных растений. МСРР часто являются универсальными симбионтами высших растений; они могут увеличивать адаптивный потенциал своих хозяев через ряд механизмов, таких, как: фиксация молекулярного азота, мобилизация труднодоступных почвенных питательных веществ (например, железа, фосфора, серы, и т.п.), синтез фитогормонов и витаминов, а также почвенное разложение растительного материала, ведущее к накоплению органического вещества почвы. Кроме того, установлено, что некоторые микроорганизмы могут способствовать росту и развитию растений, защищая от видов микроорганизмов, являющихся болезнетворными по отношению к растению (т.е. фитопатогенов). Например, некоторые полезные микроорганизмы могут защищать от корневой гнили растений, конкурируя с грибами-патогенами за пространство на поверхности корня растения. Также возможна конкуренция среди различных штаммов микроорганизмов природной растительной микрофлоры, что может стимулировать рост и развитие корневой системы растения, увеличивать поглощение минеральных питательных веществ и воды и тем самым способствовать увеличению продуктивности растения. Таким образом, может развиваться промышленность биоудобрений на основе производства естественно живущих почвенных микроорганизмов. При увеличении популяции полезных микроорганизмов в почвах, благодаря приемам искусственной инокуляции, такие почвенные микроорганизмы могут усиливать свою биологическую активность, таким образом, улучшая обеспечение растений важными питательными веществами и полезными факторами, которые способствуют росту и развитию растения.

[0006] Инокуляция культурных растений с помощью МСРР видится в общем как довольно многообещающий сельскохозяйственный подход, реализующий возможность борьбы с вредителями без использования пестицидов в больших количествах. Экологические заботы о качестве грунтовой воды на фоне интенсивного применения удобрений и пестицидов при производстве продуктов питания способствуют рассмотрению необходимости биологических альтернатив. Поэтому технологии, развивающие биологические методы обработки, сравнимые с удобрениями и пестицидами или даже сокращающие количество таких химических веществ, могут быть существенным продвижением в сельскохозяйственной промышленности. Установлено, что стимулирование роста растений с помощью МСРР часто связано со способностью МСРР колонизировать корневую систему растений. Однако вопросам разработки эффективных процедур выделения для получения микроорганизменных штаммов с высокой способностью к колонизации корней уделяется пока еще недостаточно внимания. В то же время отсутствие таких процедур выделения замедляет изучение бактериальных растительных симбиозов, а также широкое развертывание применений МСРР в сельском хозяйстве.

[0007] В связи с этим есть постоянная потребность в идентификации новых МСРР и/или проверке их совместимости с существующими промышленными технологиями получения агропродукции. Более того, требуются также дополнительные исследования, направленные на сравнение чистых культур штаммов и смешанных культур штаммов у микроорганизмов, способных формировать синергетические консорциумы. Такие смешанные консорциумы, возможно, имели бы более высокий потенциал для последовательного улучшения конкурентоспособности на фоне различных факторов окружающей среды и условий выращивания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] В настоящем изобретении предусмотрены штаммы и культуры микроорганизмов, их композиции и способы использования таковых с целью улучшения роста и/или продуктивности растений. Изобретением также предусмотрены: способы обработки семян, использующие композиции указанных микроорганизмов; способы предотвращения, ингибирования или подавления развития растительных патогенов или вызываемых фитопатогенных болезней; формы растительного разнообразия, полученные искусственным путем и искусственно инокулированные с использованием эндофитных микроорганизмов; полученные искусственным путем семена, репродуктивные и вегетативные ткани, регенерируемые ткани, части растения или потомство; способ подготовки композиций сельскохозяйственного назначения

[0009] Одна особенность настоящего изобретения предусматривает изолированные микроорганизменные штаммы, их изолированные культуры, биологически чистые культуры и обогащенные культуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения с этой особенностью в качестве микроорганизменных штаммов, например, могут быть использованы: SGI-003-H11 (депонирован как NRRL В-50483); SGI-020-A01 (депонирован как NRRL В-50484); SGI-026-G06 (депонирован как NRRL В-50485); SGI-026-G07 (депонирован как NRRL В-50486), или штаммы, происходящие от любого одного из указанных штаммов. В некоторых предпочтительных вариантах микроорганизменный штамм может включать нуклеотид или аминокислотную последовательность, демонстрирующие по меньшей мере 85% %, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности к любой из заданных последовательностей, таких как рибосомальная 16S-PHK- и/или recA-нуклеотидная и/или аминокислотная последовательность (см. также прилагаемый список последовательностей). При этом штаммы микроорганизмов могут также обладать свойствами, стимулирующими рост растений.

[0010] Эта особенность настоящего изобретения также предусматривает микроорганизменные композиции, которые включают штаммы микроорганизмов или их культуры. Такие микроорганизменные композиции могут содержать агро-эффективные количества дополнительных веществ или составов, в которых дополнительное вещество или состав, может быть удобрением, акарицидом, бактерицидом, фунгицидом, инсектицидом, микробицидом, нематицидом, или пестицидом. При этом микроорганизменные композиции, могут включать носитель, представленный например, семенем растения. Согласно изобретению, микроорганизменные композиции могут быть приготовлены в виде эмульсии, коллоида, мелкодисперсной пыли, гранул, таблеток, порошков, аэрозоля, суспензии или раствора, при этом указанные композиции могут представлять собой растительные семена с нанесенным на них покрытием. В несколько другом варианте семена растений, покрытые микробной композицией, также предусмотрены настоящим изобретением.

[0011] Другая особенность настоящего изобретения предусматривает способы обработки растительных семян. Такие способы включают экспонирование или контактирование семян растения со штаммом микроорганизма или его культурой.

[0012] Другая особенность настоящего изобретения предусматривает способы увеличения роста и/или урожайности растения. Такие способы предусматривают применение эффективных количеств штамма или культуры микроорганизма в зоне растения или в зоне его окружения. Другой аспект изобретения предусматривает выращивание штамма или культуры микроорганизма в растительном субстрате или почве растения-хозяина до выращивания или одновременно с выращиванием растения-хозяина в указанном растительном субстрате или почве. В качестве указанного растения может быть использовано растение кукурузы или пшеницы. Штамм или культура микроорганизма могут быть представлены в виде эндофита, располагающегося на растении.

[0013] Другая особенность настоящего изобретения предусматривает способы, предназначенные для предотвращения, ингибирования или подавления развития растительных патогенов. Такие способы включают выращивание микроорганизменного штамма или культуры в растительном субстрате или почве растения-хозяина до выращивания или одновременно с выращиванием растения-хозяина в указанном растительном субстрате или почве. В некоторых вариантах указанного способа растительный патоген, может быть микроорганизмом вида Colletotrichum, Fusarium, Gibberella, Monographella, Penicillium или Stagnospora. Например, в качестве растительного патогена предпочтительно могут быть использованы Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis, Penicillium sp., или Stagnospora nodurum.

[0014] Другая дополнительная особенность настоящего изобретения предусматривает способы для предотвращения, ингибирования или подавления развития инфекционных болезней растения, включающие вовлечение в зону растения или зону окружения растения, эффективного количество штамма или культуры микроорганизма. Указанный штамм или культура микроорганизма могут быть применены к почве, семенам, корню, цветку, листу, части растения или к целому растению.

[0015] Другая дополнительная особенность настоящего изобретения предусматривает искусственное происхождение растений, при этом растения искусственного происхождения искусственно заражают штаммом или культурой микроорганизма. Другими особенностями этого аспекта изобретения является его применение для семян, репродуктивной ткани, вегетативной ткани, регенеративных тканей, частей растений и потомства растений, полученных искусственным путем.

[0016] Другая особенность настоящего изобретения предусматривает способы подготовки композиций сельскохозяйственного назначения. Такие способы предусматривают инокуляцию штамма или культуры микроорганизма внутрь или на поверхность субстрата и инициирование их роста и развития.

[0017] Другая особенность настоящего изобретения предусматривает изолированные штаммы, изолированные культуры, биологически чистые культуры и обогащенные культуры микроорганизма рода Pantoea. Указанный микроорганизм содержит последовательность ДНК или аминокислоты, кодирующую локусы 16S-рРНК- или recA-протеина и демонстрирующую по меньшей мере 85%, по меньшей мере, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности к последовательности, кодирующей локусы 16S-pPHK- и/или recA-протеина (см. прилагаемый список последовательностей). В другом аспекте изобретение предусматривает вид микроорганизмов, содержащий любую из описанных выше последовательностей ДНК или последовательностей аминокислот, способствующих улучшению роста и развития и/или увеличению урожая растений.

[0018] Эти и другие цели и особенности предлагаемого изобретения раскрыты ниже в подробном описании и формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0019] Если не указано иначе, все термины, обозначения, другие научные термины и терминология обладают значениями обычно понимаемые опытными в этой области техники специалистами, которым относится и касается настоящее изобретение. В некоторых случаях обычно понимаемые значения определены в этой заявке для пояснения и/или для готовой справки и включение таких определений не требует интерпретаций, что представляют существенные отличия от того, что обычно понимается в этой сфере знаний. Многие методы и процедуры хорошо понятны и обычно используются с применением общепринятой методологии теми, кто обладает опытом в этой сфере знаний.

[0020] Форма единственного числа, если в контексте прямо не указано иное, включает употребление форм множественного числа. Например, написано и читается «растительная клетка, ед.ч.», подразумевается - «растительные клетки, мн.ч.», прежде всего, если описываемый объект содержит одну или более растительных клеток, в том числе их комбинации и совокупности таковых.

[0021] Бактерицидный. Используемый здесь термин «бактерицидный» означает способность композиции или субстанции увеличивать гибель бактерий или ингибировать их скорость роста.

[0022] Биологическая защита. Используемый здесь термин «биологическая защита», сокращенная форма - «биозащита», означает защиту от патогенов, насекомых или любых других нежелательных организмов с помощью использования по меньшей мере другого организма, за исключением человека. Примерами известных механизмов биологической защиты являются использование грибов-конкурентов, например, в борьбе за пространство на поверхности корня, против возбудителей корневой гнили, либо использование микроорганизмов, которые или ингибируют рост, или убивают патогена. Термин «растение-хозяин» в контексте биологической защиты означает растение, восприимчивое к поражению, вызванному патогеном. В контексте изоляции организма, например бактерии или гриба, из его естественной среды, «растение-хозяин» - это растение, которое поддерживает рост бактерии или гриба, в частности, растение, на котором бактерия или гриб развиваются эндофитно.

[0023] Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для получения полезных или желательных эффектов. При этом эффективное количество может иметь одно или несколько назначений. Относительно целей обработки, ингибирования или защиты, эффективное количество - это количество, достаточное для улучшения, стабилизации, обращения, замедления или приостановки прогрессирования целевой инфекции или состояния болезни. Выражение «эффективный микроорганизм» означает, что рассматриваемый штамм демонстрирует степень стимулирования роста растения и/или стимулирования его урожайности или сдерживания инфекционной болезни, и что такой эффект наблюдается на статистически значимом уровне по сравнению с необработанным контролем. В некоторых случаях выражение «эффективное количество» может означать количество микроорганизма, используемого для обработки, которое необходимо, чтобы получить полезный или желательный результат относительно такового в необработанном контроле при сопоставимых условиях обработки. Согласно изобретению, фактическая норма применения жидких препаратов может варьировать от 1×10³ до 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток на 1 мл, предпочтительно от 1×10⁶ до 1×10⁹ жизнеспособных клеток на 1 мл. Для почти 50% испытанных образцов тканевых культур в большинстве условий оптимальное количество жидкого препарата, обеспечивающее одинаковый уровень контакта, составляло от 1×10⁶ до 1×10⁹ в зависимости от способа применения. Если микроорганизмы применяются в виде твердого препарата, то норму внесения нужно откорректировать, чтобы получить сопоставимое количество жизнеспособных клеток на единицу поверхности растительной ткани, в сравнении с таковым для жидких препаратов. Микроорганизменные композиции настоящего изобретения, как правило, биологически эффективны в избыточной концентрации не менее 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на 1 грамм), предпочтительно 10⁷ КОЕ/г, более предпочтительно 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно 10⁹ КОЕ/г.

[0024] Композиция: Используемый здесь термин "композиция" означает комбинацию активного агента и по меньшей мере другого ингредиента, носителя, или композиции, которые могут быть инертны (например, обнаруживаемый агент или метка или жидкий носитель) либо активны, как например удобрение.

[0025] Термин «контролируемое растение», согласно настоящему изобретению, обозначает использование контролируемого ориентира для измерения изменений в фенотипе рассматриваемого растения, причем последнее может являться любой подходящей растительной клеткой, семенем, компонентом, тканью или органом растения либо целым растением. Контролируемое растение, может также охватывать, например, такие объекты: (a) растение или клетка дикого типа, т.е. того же генотипа, что и исходный материал для генетического изменения, в результате которого были получены обрабатываемые растение или клетка; (b) растение или клетка с генотипом исходного материала, но преобразованные с помощью нулевой конструкции (т.е. конструкции, не обладающей известными целевыми эффектами, такими, например, как включение гена-репортера); (c) растение или клетка, являющиеся не преобразованным сегрегантом в потомстве рассматриваемого растения или клетки; (d) растение или клетка, генетически идентичные рассматриваемому растению или клетке, но не подвергнуты тому же типу обработки (например, обработка удобрением), что и обрабатываемые растение или клетка; (e) обрабатываемые растение или клетка, помещенные в условия, при которых ген целевого эффекта не экспрессируется; или (f) обрабатываемые растение или клетка, помещенные в условия, при которых они не подвергаются особому режиму, такому как, например, применение удобрения или комбинации удобрений и/или других химикатов.

[0026] Культура; изолированная культура, биологически чистая культура, обогащенная культура. Согласно настоящему изобретению, изолированный штамм микроорганизма - это штамм, который был изъят из его естественного местонахождения. То есть, термин "изолированный" не обязательно отражает степень очистки микроорганизма. Тем не менее, в различных ситуациях "изолированная" культура неоднократно очищается по меньшей мере в 2х, 5х, 10х, 50х или 100х раз от начальной степени чистоты сырого материала, из которого она изолирована. Не ограничиваясь этим примером, если культура изолируется из почвы, организм может быть изолирован в степени, при которой его концентрация в данном количестве очищенного субстрата или частично очищенного субстрата (например, почвы) по меньшей мере в 2х, 5х, 10х, 50х или 100х раз больше, чем в исходном сыром материале. Определение "практически чистая культура" штамма микроорганизма подразумевает культуру, которая практически не содержит никаких других микроорганизмов, кроме желательных штамма или штаммов микроорганизма. Другими словами, практически чистая культура штамма микроорганизма практически свободна от других загрязнителей, которые могут включать как микроорганизменные контаминанты, так и нежелательные химические загрязнители. Далее, используемый здесь термин "биологически чистый" штамм подразумевает штамм, отделенный от материалов, с которыми он обычно связывается в природе. Однако следует отметить, что штамм, связанный с другими штаммами, или со смесями или материалами, которые обычно не встречаются в его естественном местонахождении, должен также определяться, как "биологически чистый". Монокультура специфического штамма, безусловно, является "биологически чистой". В различных случаях "биологически чистая" культура очищается, по меньшей мере, в 2х, 5х, 10х, 50х или 100х раз от степени чистоты исходного материала, с которым штамм обычно ассоциирован в природе. Не ограничиваясь этим примером, если культура обычно ассоциируется в природе с почвой, то микроорганизм может быть биологически чистым в степени, при которой ее концентрация в данном количестве очищенного субстрата или частично очищенного субстрата, в котором она обычно ассоциируется в природе (например, почва), по меньшей мере, в 2х, 5х, 10х, 50х или 100х раз больше, чем в исходном неочищенном материале Используемый здесь термин "обогащенная культура" изолированного штамма микроорганизма означает культуру, в которой общая численность популяции составляет более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% от таковой у собственно изолированного штамма.

[0027] Культивирование. Используемый согласно настоящему изобретению термин «культивирование» означает размножение организмов на поверхности или внутри сред (субстратов) различных типов.

[0028] Термином «эндофитный» обозначается организм-эндосимбионт, который живет с растением по меньшей мере часть его собственной жизни, не вызывая при этом проявления болезни. Эндофиты могут передаваться или вертикально (непосредственно от родителя к потомку), или горизонтально (от одного растения к другому). Вертикально передаваемые грибные эндофиты обычно бесполые и передаются от материнского растения к потомку через проникающие в гифы грибницы; бактериальные эндофиты также могут вертикально передаваться из семян к рассаде (Ferreira et al., FEMS Microbiol. Lett. 287:8-14, 2008). С другой стороны, горизонтально передаваемые эндофиты обычно имеют половое размножение и передаются через споры, распространяемые ветром и/или насекомыми-переносчиками. Эндофитные микроорганизмы все больше привлекают к себе внимание, благодаря возможности их использования для защиты от болезней и насекомых-вредителей, а также в связи с их способностью к стимулированию роста и развития культурных растений.

[0029] Грибной патоген. Применение этого определения для целей настоящего изобретения означает, что использование терминов «грибной патоген» или «гриб» должно подразумевать обе стадии, или типы размножения: половой (телеоморфный) и бесполый (анаморфный), известные также как совершенная и несовершенная стадии развития гриба, соответственно. Исходя из этого, следует иметь в виду, что, например, гриб Gibberella zeae является анаморфной стадией гриба Fusarium graminearum.

[0030] Термин «фунгицидный» означает способность композиции или субстанции, уменьшать рост грибов или увеличивать их гибель.

[0031] Термин «мутантный» или «вариантный» по отношению к микроорганизму означает модификацию материнского штамма, в которой желательная биологическая активность аналогична той, которая выражается в материнском штамме. Например, в случае микроорганизма Burkholderia "материнский штамм" определяется здесь как оригинальный штамм Burkholderia перед осуществлением его мутагенеза. Мутанты или варианты могут появляться в природе без вмешательства человека. Они также могут быть получены путем применения средств и методов, известных соответствующим специалистам. Например, материнский штамм может быть обработан с помощью химических препаратов, таких как N-метил-N-нитро-N-нирозогуанидин (МННГ), этилметансульфонат (ЭМС), либо путем облучения с использованием гамма-, рентгеновского или ультрафиолетового облучения, или другими известными средствами в этой сфере.

[0032] Нематицидный. Термин "нематицидный" означает способность субстанции или композиции увеличивать гибель нематод или препятствовать скорости их роста.

[0033] Патоген. Термин «патоген» используется в отношении организмов, таких как водоросли, паукообразные, бактерии, грибы, насекомые, нематоды, растения-паразиты, простейшие, дрожжи или вирусы, способных вызывать болезнь у растения или животного. Термин "фитопатоген" означает здесь болезнетворный организм, заражающий растение.

[0034] Процент идентичности последовательности. Используемый здесь термин «процент идентичности последовательности» означает сравнивание двух локально выровненных последовательностей в окне сравнения путем определения длины локального выравнивания между двумя последовательностями. Аминокислотная последовательность в окне сравнения может содержать также вставки или делеции (т.е. пропуски и излишки) по сравнению с эталонной последовательностью, не содержащей подобные дополнения или исключения, с целью оптимального выравнивания двух последовательностей. Локальное выравнивание между двумя последовательностями включает только те сегменты каждой из них, которые считаются достаточно подобными и удовлетворяющими критерию сравнения, который, в свою очередь, зависит от алгоритма, используемого при выравнивании (например, алгоритм BLAST - «Базовый Инструмент Поиска Локальных Выравниваний»). Процент идентичности последовательности вычисляется через определение числа позиций, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или идентичные остатки аминокислот появляются в обеих последовательностях; получить число соответствующих позиций, разделив количество упомянутых идентичных позиций на общее количество позиций в окне сравнения и умножив результат на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться согласно алгоритму локальных гомологии (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981), алгоритму глобального гомологичного выравнивания Needleman and Wunsch, (J Mol. Biol. 48:443, 1970), методу поиска подобий (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристическими имплементациями этих алгоритмов (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) либо путем инспектирования. Данные идентификации для сравнения двух последовательностей показали, что более предпочтительными являются инструменты GAP и BESTFIT, которые при выравнивании дают высокие показатели идентичности. Обычно, используются значения по умолчанию 5,00 для весового значения промежутка и 0,30 для весового значения длины промежутка. Термин "существенная идентичность последовательности» между полинуклеотидными или полипептидными последовательностями определяет полинуклеотид или полипептид, содержащий последовательность, имеющую не менее 50% идентичной последовательности, предпочтительно не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, более предпочтительно не менее 90%, и еще более предпочтительно не менее 95% и наиболее предпочтительно не менее 96%, 97%, 98% или 99%идентичности последовательности, сравниваемой с эталонной последовательностью с использованием упомянутых программ. Кроме того, попарная гомология последовательности или сходство последовательности, используемые в настоящем изобретении, означают процентное количество остатков, отличающихся подобием между двумя выравниваемыми последовательностями, как определено в этой сфере знаний. Семейства остатков аминокислот, имеющих подобные боковые цепи, включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

[0035] Результат запроса на поиск последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот может быть найден против соответствующего обозначения последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислоты, находящихся в публичных базах или базах запатентованных данных. Такие поиски можно осуществить с помощью инструментария Национального центра биотехнологической информации - Basic Local Alignment Search Tool (программа NCBI BLAST версия 2.18). Указанное программное обеспечение доступно в Интернете на сайте Национального центра биотехнологической информации (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Обычно можно использовать следующие параметры для NCBI BLAST: фильтр установлен на значение «По умолчанию»; «Матрица Сравнения» - в положение "BLOSUM62"; «Gap-выходы»: - «Наличие»: 11, «Расширение»: 1; «Размер Слова» - установить значение 3; «Порог ожидания» (E) - 1e-3; «Минимальная длина локального выравнивания» - 50% от длины запрашиваемой последовательности. Идентичность и подобие последовательности могут быть также определены с использованием программного обеспечения типа GenomeQuest™ (Gene-IT, Вустер Массачусетс США).

[0036] Термин «вредитель», используемый в настоящем изобретении обозначает нежелательный организм, охватывающий, но не ограничивающийся, такие: бактерии, грибы, растения (например, сорняки), нематоды, насекомые, а также другие вредные животные. Соответственно, используемый здесь термин "пестицидный" указывает на способность субстанции или композиции уменьшать скорость роста вредителя, т.е., нежелательного организма, или увеличивать скорость гибели последнего

[0037] Потомство. Термин "потомство" обозначает потомков конкретного специфического растения или линии растения. Потомство указанного растения может включать семена, сформированные из: F₁, F₂, F₃, F₄, F₅, F₆ и последующих поколений; BC₁, BC₂, BC₃ и последующих поколений; F₁BC₁, F₁BC₂, F₁BC₃ и последующих поколений и последующие генерации растений. Обозначение F₁ указывает на потомство от скрещивания между двумя генетически отличающимися родителями. Обозначения F₂, F₃, F₄, F₅ и F₆ обозначают последующие поколения потомства от самоопыления или потомства, опыленного родственными ему растениями F₁.

[0038] Термин «вариант» в отношении указаний на нуклеиновую кислоту и полипептид, означает молекулу полипептида, протеина или полинуклеотида, обладающую некоторыми получаемыми искусственно или естественно отличиями в аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностях, по сравнению с эталонными полипептидом или полинуклеотидом соответственно. Например, эти отличия могут включать замены, вставки, делеции или любые желательные комбинации таких изменений в полипептидах или в эталонных молекулах полипептидов. Полипептид- и протеин- варианты могут дополнительно иметь изменения в заряде и/или посттрансляционных модификациях (таких, как например, гликозилирование, метилирование, фосфорилирование и т.п.).

[0039] Термин «вариант» в отношении указания на микроорганизм обозначает штамм, имеющий идентифицируемые характеристики той разновидности, к которой он принадлежит, но также имеет по меньшей мере одну вариацию нуклеотидной последовательности или опознаваемое отличное свойство по сравнению с материнским штаммом, где это свойство имеет генетическое основание (т.е. является наследственным). Например, для штамма Bacillus thuringiensis 020_А01, отличающегося активностью стимулировать рост растения, опознаваемые свойства: 1) способность подавлять развитие грибных фитопатогенов, в том числе Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum graminicola; 2) способность увеличить урожай семян пшеницы; и 3) присутствие 16S рРНК гена с нуклеотидной последовательностью, имеющей более 95%, более 96%, более 97%, более 98%, более 99% идентичности последовательности гена 16S рРНК Bacillus thuringiensis 020_А01, что может служить подтверждением варианта штамма Bacillus thuringiensis 020_А01.

[0040] Урожайность. Термин «урожайность, используемый в настоящем изобретении, означает количество пригодного для уборки материала растения или растительной продукции, и обычно определяется как измеримая продуктивность культуры с точки зрения ее экономической оценки. Для культурных растений, "урожайность" также подразумевает количество убираемого материала с 1 акра или единицу производительности. Урожайность может быть определена в терминах количества или качества. Материал, урожай которого собран, может отличаться от культуры к культуре; например, он может представлять собой семена, надземную часть биомассы, а также материал корней, плодов, волокон и любой другой части растения, или любого полученного растительного продукта, который является экономически выгодным. Термин «урожайность» также охватывает и потенциальную урожайность, которая является максимальной возможной продуктивностью. Урожайность может зависеть от ряда компонентов урожая, контролируемых определенными параметрами, которые могут определяться по разным параметрам. Эти параметры также хорошо известны опытным лицам в этой сфере практики и отличаются у разных культур. Термин "урожайность" включает в себя и уборочный индекс, являющийся соотношением между биомассой, урожай которой собран, и суммарным количеством всей полученной биомассы.

[0041] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, приведены в виде соответствующих ссылок, как если бы каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специально и отдельно указана для включения как ссылка.

[0042] Нет разрешения на то, что любая ссылка признается приоритетной в сфере техники. Указывая и обсуждая соответствующие ссылки на материалы из предыдущего уровня техники, авторы и заявители настоящего изобретения оставляют за собой право оспаривать точность и актуальность приведенных документов. Ясно понятно, что хотя здесь приведены как ссылки приоритетные в этой сфере техники публикации, эти ссылки не утверждают обращение за тем, что эти документы являются частью обычного общего знания в этой сфере техники.

[0043] Обсуждение общепринятых методов, описанных здесь, предназначено только в целях их иллюстрации. Другие, альтернативные методы и варианты могут быть понятны специалистам в данной области при рассмотрении настоящего изобретения.

Микроорганизмы - стимуляторы роста растений

[0044] Многие связанные с растениями микроорганизмы могут различными способами положительно влиять на здоровье растений и их физиологию различными путями. Такие полезные микроорганизмы называют стимуляторами роста растений (МСРР). Термин «стимулирование роста растений», как он использован в настоящем изобретении, охватывает широкий спектр улучшения свойств растений, в том числе и, не ограничивая: улучшение фиксации азота, улучшение развития корней, увеличение площади листьев, повышение урожайности растений, повышение всхожести семян, увеличение фотосинтеза или увеличение накопления биомассы растения. В различных вариантах изобретения достигается, по меньшей мере, 10% улучшение или по меньшей мере 25% улучшение или по меньшей мере 50% улучшение или по меньшей мере 75% улучшение или по меньшей мере 100% улучшение по сравнению с начальными параметрами. Таким образом, с помощью рассматриваемых здесь полезных микроорганизмов могут быть получены: процентное увеличение фиксации азота, увеличение общего веса корневой системы; увеличение площади листовой поверхности; увеличение выхода растительного продукта (например, увеличение его веса); повышенный процент семян, прорастающих в течение 10 или 14 или 30 суток; повышенная интенсивность фотосинтеза (например, потребления CO₂); или увеличение накапливаемой биомассы растений (например, определяется по весу растения). Растительный продукт в этом примере обычно не обязательно представляет собой пищевой продукт, производимый растением. Выход продукта может быть определен любым удобным способом, например, в бушелях, или фунтах соответствующей растительной продукции, произведенной на 1 акре посадки. На сегодняшний день установлено более двух десятков родов микроорганизмов, изолированные штаммы которых имеют активность, стимулирующую рост растений, и/или имеют активность биозащиты; причем до сих пор открываются новые роды и виды с аналогичными свойствами. Кроме того, у некоторых родов бактерий были определены несколько видов и подвидов агентов биозащиты; они могут встречаться в различных ареалах, практически везде, на уровне фермерских хозяйств, и даже на отдельных растениях. Более того, имеются сообщения о том, что некоторые отдельные микробные штаммы могут проявлять активность биозащиты и/или стимуляцию роста растений не только в отношении растений или культур, из которых они были получены, но и относительно других культур. Это указывает на универсальную природу некоторых генотипов, особенно тех из них, которые имеют широкое географическое распространение. Как обсуждалось выше, одна отдельно взятая популяция микроорганизма способна оказать значительное воздействие на здоровье растений, если она будет вовлеченной в достаточном количестве и быть активной в течение необходимого срока.

[0045] Рассматривают несколько механизмов с целью предоставить объяснение положительного влияния МСРР на улучшение роста растений. При этом благотворное влияние микроорганизмов на рост растений может быть прямым или косвенным.

[0046] Термин «микроорганизм с прямым ростстимулирующим эффектом» относится к микроорганизмам, которые могут повышать рост растений в отсутствие патогенов. Примерами таких эффектов у растений могут быть: (a) биоудобрение, (b) стимулирование роста корней, (c) ризоремедиация, и (d) стресс-контроль. Кроме того, некоторые МСРР могут способствовать росту растений косвенно - через механизмы биологической защиты, т.е. за счет снижения уровня заболеваний, например путем антибиоза, индукции системной устойчивости и конкуренции с патогенами за питательные вещества и местообитание.

[0047] Биоудобрения. Микробиологические удобрения доставляют растению питательные вещества и тем самым могут способствовать росту растений при отсутствии давления патогена. Примером получения биоудобрений являются, например, азотсодержащие бактерии видов Rhizobium и Bradyrhizobium, которые, ввиду симбиотической фиксации ими атмосферного азота, могут образовывать клубеньки на корнях бобовых растений; в этих клубеньках они превращают молекулярный N₂ азот атмосферы в аммиак, который, в отличие от атмосферного N₂, может использоваться растением в качестве источника азота. Другие примеры включают виды Azospirillum, которые являются свободно живущими N₂-фиксаторами, способными к удобрению и повышению урожайности зерновых культур, таких как пшеница, сорго и кукуруза. Несмотря на присущую азотфиксирующую способность Azospirillum, повышение урожайности, обусловливаемое при инокуляции этой бактерии, часто связывают с повышенным развитием корневой системы и, таким образом, с увеличением темпов поглощения воды и минеральных веществ. В этом отношении также выделяются несколько ризобактерий, таких как Azotobacter spp., известных своей способностью производить широкий спектр фитогормонов (например, ауксины, цитокинины) и ферментов (например, пектиназа). Многие из этих фитогормонов и ферментов, как оказалось, тесно вовлечены в инфекционный процесс симбиотических ассоциаций фитобактерий, создающих регулирующее воздействие на клубеньки бактерий Rhizobium.

[0048] Во многих случаях МСРР также могут оказывать влияние на рост и развитие растений, изменяя поглощение питательных веществ. Они могут изменять скорость впитывания питательных веществ, например, путем прямого воздействия на корни, посредством воздействия на окружающую среду, которая, в свою очередь, может изменить состояние корневой системы, а также конкурируя с растением напрямую за ресурсы питательных веществ (Gaskin et al., Agricult. Ecosyst. Environ. 12: 99-116, 1985). Некоторые факторы, с помощью которых МСРР могут играть роль в изменении эффективности использования питательных веществ в почвах, включают, например, геометрическую форму корня, растворимость питательных веществ и их наличие, преобразование веществ в доступную ионную форму, распределение питательных веществ по растению и эффективность утилизации. Так, низкий уровень растворимого фосфата может ограничивать рост растений; при этом некоторые стимулирующие рост растений микроорганизмы способны солюбилизировать фосфат из органических или неорганических связанных фосфатов, облегчая тем самым рост растений. Некоторые ферменты микробного происхождения, такие как неспецифические фосфатазы, фитазы, фофонатазы и углерод-фосфорные лиазы высвобождают растворимый фосфор из органических соединений в почве. Например, использование бактерии Pseudomonas putida в исследованиях с рассадой канолы обусловливало повышение солюбилизации неорганического фосфора в почве; вследствие чего наблюдалось повышение уровня поглощения фосфора, а также повышение уровня окисления серы и ее поглощения (Grayston and Germida, Can. J. Microbiol. 37: 521-529, 1991; Banerjee, Phytochemicals and Health, vol. 15, May 18, 1995).

[0049] Фитостимуляторы. Некоторые микроорганизмы способны производить вещества, которые стимулируют рост растений в отсутствие патогенов. Например, продуцирование фитогормонов является характеристикой многих микроорганизмов, ассоциированных с растениями. Для всех пяти классов фитогормонов, т.е. ауксина, этилена, абсцизовой кислоты, цитокининов и гиббереллина, синтез таковых в качестве вторичных метаболитов является свойством не менее одного вида бактерий и/или грибов (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 77, 5:1548-1555, 2011). Есть также некоторые микроорганизмы-продуценты таких вторичных метаболитов, которые влияют на производство фитогормонов самими растениями. Наверное, самым известным в этом отношении примером могут служить фитогормоны класса ауксинов, способствующие росту корней. Другим примером являются представители псевдомонад, которые инициируют процессы производства индолил-уксусной кислоты (ИУК) и повышение ее уровня накопления в растениях, оказывая, таким образом, значительное влияние на производство биомассы растений (Brown, Annual Rev. Phytopathology, 68: 181-197, 1974). Например автор Tien et al. (Applied Environmental Microbiol, 37:1016-1024, 1979) сообщил, что инокуляция питательных растворов с Azospirillum brasiliense в корневую зону растений проса приводит к увеличению массы побега и корневой системы, увеличению числа боковых корней, причем все боковые корни густо покрываются корневыми волосками. Растения, поддерживаемые на средах с содержанием ИУК, гиббереллинов и кинетина, показали увеличение производства боковых корней, аналогично тому, что вызвано бактерией Azospirilla. Хотя биологическое значение этих фитогормонов и фитогормоноподобных материалов, окончательно не ясно, ростостимулирующая активность этих микроорганизмов обычно приписывается именно в связи с продуцированием этих материалов.

[0050] Кроме того, другие гормоны, а также некоторые летучие органические соединения (ЛОС) и кофактор пироллхинолинхинон (ПХХ) также стимулируют рост растений. Например, некоторые ризобактерии, такие как штаммы видов В.subtilis, В.amyloliquefaciens и Enterobacter cloacae, способствуют росту растений, путем выделения ЛОС. При этом наиболее высокий уровень стимуляции роста наблюдается с выделением 2,3-бутандиола и 3-гидрокси-2-бутанона (также упоминается как ацетоин) в качестве факторов, способствующих индуцированной системной устойчивости. Кофактор ПХХ известен в качестве стимулятора роста растений, действующего в растениях как антиоксидант в растениях. При этом имеются сообщения, что антиокислительный эффект может быть и косвенным, ввиду того, что кофактор ПХХ является кофактором ряда других ферментов, в т.ч. участвующих в механизмах противогрибной активности и индукции системной устойчивости.

[0051] Стресс-контроллеры - это стимулирующие рост растений микроорганизмы, которые содержат фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК-) дезаминазы, способствующий облегчению роста и развития растений путем снижения уровня этилена. Такие микроорганизмы отбирают АЦК, являющийся предшественником этилена, и преобразуют его в 2-оксобутаноат и NH₃. Известны несколько типов стресса, которые связаны с продуцентами АЦК-дезаминазы, в т.ч. стресс от воздействия фитопатогенных бактерий, стресс от полиароматических углеводородов, стресс от полиароматических углеводородов, стресс от тяжелых металлов, таких как Са²⁺ и Ni²⁺, а также стресс от засоления и засухи.

[0052] Кроме того несколько штаммов МСРР, способных индуцировать повышение урожайности картофеля, были зарегистрированы с целью получения внеклеточных сидерофоров, связывающих Fe³⁺, что делает этот катион менее доступным для определенных представителей естественной микрофлоры (Kloepper et al., Nature 286: 885-886, 1980). Такие виды ризобактерий выделяют низкомолекулярные, высокоаффинные железо-хелатирующие микробные кофакторы, которые способны специфически повышать усвоение железа путем связывания его с мембранными сидерофорными рецепторами. Один из таких сидерофоров, производимых некоторыми МСРР-псевдомонадами, известен как псевдобактин, способный ингибировать рост Erwinia cartovora (возбудителя мягкой гнили картофеля) (см., например, Kloepper et al, Current Microbiol. 4: 317-320, 1980). Добавление псевдобактина к растительной среде ингибирует инфекцию мягкой гнили, а также уменьшает количество патогенных грибов на картофеле наряду с существенным увеличением урожайности последнего. Большинство доказательств в поддержку теории сидерофорного биологической защиты с помощью МСРР-псевдомонад может быть связано с пиовердинами, одним из классов сидерофоров, представители которого содержат флуоресцентные пигменты флуоресцирующих псевдомонад [Demange et al., in Iron Transport in Microbes, Plants and Animals (Winkleman et al., eds.), pp 167-187, 1987]. Согласно этой теории, пиовердины демонстрируют некоторую функциональную специфичность штаммов, связанную с селективным распознаванием внешних мембранных рецепторов сидерофора (Bakker et al., Soil Biology and Biochemistry 19: 443-450, 1989).

Изолированные культуры

[0053] Как описано более подробно в разделе примеров осуществления настоящего изобретения, заявители обнаружили несколько новых микроорганизмов, которые являются эффективными стимуляторами роста и урожайности растений. Во многих случаях, выделенные микроорганизмы также эффективны в подавлении развития некоторых фитопатогенных болезней. Микробные изоляты были отобраны из пула примерно 5000 штаммов микроорганизмов, полученных из проб окружающей среды, собранных в разных местах по всей территории США. Первоначальный отбор микроорганизмов был основан на их способности колонизировать корни растений, а также на пригодности для получения химических соединений и ферментов, которые считаются важными для взаимодействия с растениями. Микроорганизмы были также биологически испытаны in vitro на предмет их способности подавлять развитие различных грибных фитопатогенов в тесте на антагонизм. Отобранные микроорганизмы затем подвергали биологическим испытаниям в тепличных условиях на промышленных сортах пшеницы и кукурузы с целью определения способности штаммов микроорганизмов способствовать росту растений и сохранять потенциальную урожайность семян.

[0054] Последующим таксономическим анализом дополнительно установлено, что репрезентативные бактериальные микроорганизмы, упомянутые в настоящем описании, принадлежат к представителям родов Bacillus, Burkholderia, Herbaspirillum, Pantoea и Pcdobacter.

Депонирование биологического материала

[0055] Чистые культуры штаммов микроорганизмов, упомянутые в настоящем описании, были депонированы в Коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований, расположенной по адресу 1815 N. University Street, Пеория, штат Иллинойс 61604, США (NRRL) в соответствии с Будапештским договором о порядке и процедуре патентования. Номера доступа для депонированных культур являются следующими:

[0056]

[0057] Штаммы микроорганизмов были депонированы в условиях, которые обеспечивают доступ к культурам в период рассмотрения этой заявки на патент любому лицу, указанному Комиссионером по патентам и товарным знакам, в соответствии с п. 37 CFR § 1.14 и п. 35 U.S.С. § 122. Депозиты представляют собой практически чистые культуры депонированных штаммов. В соответствии с требованиями зарубежного патентного законодательства, депозиты могут быть доступны по требованию в странах, где поданы аналоги настоящей заявки либо заявки, происходящие от нее. Тем не менее, следует понимать, что доступность депозита не является разрешением на использование предмета изобретения в отступление от патентных прав, предоставляемых законодательством.

[0058] Предпочтительные микроорганизмы по данному изобретению имеют все отличительные признаки депонированных штаммов, в т.ч. идентифицируемые характеристики способности способствовать росту растений и/или повышению урожайности, а также идентифицируемые характеристики свойств подавлять развитие грибных фитопатогенов, как указано в настоящем описании. В частности, предпочтительные микроорганизмы по данному изобретению относятся к депонированным микроорганизмам, как описано выше, и штаммам, полученных из них.

Микробиологические композиции

[0059] Микробиологические композиции настоящего изобретения, которые содержат выделенные штаммы или культуры микроорганизмов могут быть в различных формах, в том числе, но не ограничиваясь, такими, как устойчивые культуры, целые культуры, хранящиеся запасы клеток, мицелий и/или гифы (в частности хранящиеся в глицерине), агаровые полоски, кусочки агара, хранимые в фазе глицерин / вода, замороженные и высушенные культуры, сухие культуры и высушенные изоляты, в виде лиофилизата, или мицелии, высушенные на фильтровальной бумаге или на семенах зерновых культур. Как определено в настоящем описании, под термином "изолированная культура" или в его грамматических эквивалентах, используемых в данном описании и в этой области техники, следует понимать, что культурой может являться культуральная жидкость, гранулы, очищенный, высушенный образец, лиофилизат или фрагмент (например, гифы или мицелий); или же подложка, контейнер, среда, такие как чашка, бумага, фильтр, матрицы, солома, пипетки или их наконечники, волокна, иглы, гель, тампон, трубки, флакон, частицы и т.д., содержащие один тип организма. В настоящем изобретении изолированной культурой также считается культура микроорганизма-анатагониста, представляющая собой культуральную жидкость или соскоб, гранулы, высушенный препарат, лиофилизат, либо часть микроорганизма или подложка, контейнер, или среда, которые содержат данный микроорганизм, в отсутствие других организмов.

[0060] Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие по меньшей мере один изолированный штамм или культуру микроорганизма и носитель. Носителей может быть один или более из числа придающих различные свойства, такие как повышенная стабильность, смачиваемость, диспергируемость и т.д. Смачивающие агенты, такие как природные или синтетические не ионные или ионные поверхностно-активные вещества, или их комбинации могут быть включены в композиции согласно изобретению. Водно-масляные эмульсии также могут быть использованы в разработке композиции, включающей по меньшей мере один изолированный микроорганизм согласно настоящему изобретению (см. например, патент США №7485451, включенный посредством ссылки). Подходящие препараты, которые могут быть приготовлены, включают смачиваемые порошки, гранулы, гели, агаровые полоски или таблетки, загустители и т.п., микрокапсулированные частицы, и т.п., жидкости, такие, как водные текучие, водные суспензии, водно-масляные эмульсии и т.д. Композиция может включать также зерновые или бобовые продукты (например, зерно, бобы, бульон или муку, полученные из зерна или бобов), крахмал, сахар или масло. Носитель может быть сельскохозяйственным продуктом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения носитель может представлять собой семена, а композиция при этом может быть либо нанесена на поверхность семян, либо пропитывать семена.

[0061] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, носитель может представлять собой иной сельскохозяйственно значимый объект, который может быть, например, почвой или средой для выращивания растений. Другие сельскохозяйственные носители, которые также могут быть использованы, включают воду, удобрения, растительные масла, увлажнители или их комбинации. В качестве альтернативы, сельскохозяйственный носитель может быть твердым, таким как диатомовая земля, суглинок, кремнезем, альгинат, глина, бентонит, вермикулит, семенная кожура, другие растительные и животные продукты, или их комбинации, в том числе гранулы, таблетки или суспензии. Смеси любых из вышеуказанных ингредиентов также рассматриваются в качестве носителей, таких как, но не ограничиваясь, например, песта (смесь муки и каолиновой глины), агар или мучные таблетки в суглинке, песке или глине и т.п.. Препараты могут также включать в себя продукты продовольствия, приемлемые для культивирования организмов, например, такие как ячмень, рис, или другие биологические материалы, например, такие как семена, части растений, жом сахарного тростника, оболочки или стебли от переработки зерна, материалы растительных почвенных остатков (огородные отходы), древесные отходы строительства, опилки или небольшие волокна из вторичной переработки бумаги, ткани, или дерева. Специалистам в данной области могут быть известны и другие подходящие носители.

[0062] В жидкой форме, например, в виде растворов или суспензий, микроорганизмы согласно данному изобретению могут быть смешаны или суспендированы в воде или водных растворах. Подходящие жидкие разбавители или носители включают воду, водные растворы, бензиновые дистилляты или другие жидкие носители.

[0063] Твердые композиции могут быть получены, например, диспергированием микроорганизмов согласно настоящему изобретению на измельченном твердом носителе, гаком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, диатомовая земля, фуллерова земля, пастеризованная почва и т.п. Когда такие композиции используются в виде смачиваемых порошков, для их приготовления могут применяться различные биологически совместимые диспергирующие агенты: неионогенные, анионные, амфотерные, катионные и эмульгирующие агенты.

[0064] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемые здесь композиции, при использовании их в достаточном количестве, улучшают роет и урожайность культурных растений, таких как пшеница, ячмень, овес, кукуруза, действуя в качестве микробного удобрения. Эти композиции, подобно другим биоудобрениям, могут иметь высокий потенциал применения, потому что они, как правило, не горючие и не травмируют растений.

[0065] Как описано подробно в настоящем описании, ускорение роста растений и улучшение урожайности растений может быть достигнуто путем применения одной или более микробиологических композиций настоящего изобретения к растению-хозяину или его частям. Композиции могут быть применены в количестве, эффективном для усиления роста растений или для увеличения выхода урожая по сравнению с необработанным контролем. Активные компоненты используются в концентрации, достаточной для усиления роста целевого растения при нанесении их на растение. Специалисту в данной области ясно, что эффективные концентрации могут изменяться в зависимости от различных факторов, таких как, например, (а) тип растения пли сельскохозяйственной продукции; (b) физиологическое состояние растения или сельскохозяйственной продукции; (с) концентрация патогенов на растении или сельскохозяйственной продукции; (d) тип симптомов заболевания на растении или сельскохозяйственной продукции; (е) погодные условия (например, температура, влажность); и (f) стадия болезни растений. Согласно настоящему изобретению, используются типичные концентрации носителя выше, чем 1×10² КОЕ/мл. При этом предпочитаемые концентрации располагаются в диапазоне от 1×10⁴ до 1×10⁹; КОЕ/мл, оптимально - от 1×10⁶ до 1×10⁸ КОЕ/мл. Еще более предпочтительными следует считать концентрации, содержащие от 37,5 до 150 мг сухой бактериальной массы на 1 мл носителя (жидкий препарат) или на 1 г носителя (сухой препарат).

[0066] В некоторых вариантах осуществления изобретения количество одного или нескольких микроорганизмов в композициях согласно настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от конечного препарата, а также в зависимости от размера или типа растения или используемых семян. Предпочтительно, когда один или несколько микроорганизмов в композиции присутствуют в количестве примерно от 2 до 80% мас./мас. Всего препарата. Оптимально, если один или более микроорганизмов, используемых в композициях, составляет от 5 до 65% мас./мас, и предпочтительнее всего - при соотношении от 10 до 60% мас./мас всего препарата.

[0067] Специалистам в данной области понятно, что микробиологические композиции согласно изобретению могут быть применены к целевому растению с использованием различных традиционных методов, таких как распыление, покрытие, инъекция, растирание, прокат, окунание, распыление, нанесение кистью или любым другим подходящим методом, который существенно не повреждает целевое растение, подлежащее обработке. Особенно предпочтительные способы включают в себя инокулирование субстратов для выращивания или почвы суспензией из микробных клеток, а также покрытие семян растений клетками и/или спорами микроорганизмов.

[0068] Как правило, композиции согласно изобретению являются химически инертными; следовательно, они совместимы практически с любым другим из компонентов, предусмотренных расписанием работ. Они также могут быть использованы в комбинации с веществами, влияющими на рост растений, такими как удобрения, регуляторы роста растений и т.п., при условии, что такие соединения или вещества являются биологически совместимыми. Они также могут быть использованы в комбинации с биологически совместимыми активными в пестицидном отношении агентами, такими как гербициды, нематициды, фунгициды, инсектициды и т.п.

[0069] Если в качестве биоудобрений используются удобрения и составы, содержащихся в коммерческих препаратах и в формах применения, приготовленных из указанных коммерческих препаратов, то активные микробные штаммы и композиции согласно настоящему изобретению могут также присутствовать в них в виде смесей-синергистов. Такие смеси-синергисты являются соединениями, у которых активность композиции значительно увеличивается без необходимости увеличения активности каждого из отдельно взятых ее компонентов.

[0070] В случае использования в качестве биоудобрений удобрений и составов, содержащихся в коммерческих препаратах и в формах применения, приготовленных из указанных коммерческих препаратов, активные микробные штаммы и композиции согласно настоящему изобретению могут, кроме того, присутствовать в них в виде смеси с ингибиторами, которые уменьшают деградацию активной композиции после применения ее в среде обитания растения, на поверхности частей растений или в растительных тканях.

[0071] Активные микробные штаммы и композиции согласно изобретению, как таковые, или же их препараты, могут быть также использованы в смеси с известными удобрениями, акарицидами, бактерицидами, фунгицидами, инсектицидами, бактерицидными средствами, нематицидами, пестицидами или комбинациями любых из них, в частности, в целях расширения спектра действия или предотвращения, таким образом, развития резистентности к пестицидам. При этом во многих случаях возникают синергетические эффекты, т.е. активность смеси может превышать активность отдельных ее компонентов. Также предполагается смесь с другими известными активными веществами, такими как регуляторы роста, защитные вещества и/или химические сигнальные вещества.

[0072] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиции могут дополнительно включать, по меньшей мере, одно химическое или биологическое удобрение. Количество, по меньшей мере, одного химического или биологического удобрения, используемого в композиции, может варьировать в зависимости от конечного состава, а также от размера растений и семян, подлежащих обработке. Предпочтительно, если, по меньшей мере, одно химическое или биологическое удобрение составляет от 0,1 до 80% мас./мас. всего состава. Более предпочтительно, если, по меньшей мере, одно химическое или биологическое удобрение присутствует в композиции в количестве от 1 до 60% мас./мас., и наиболее предпочтительно - от 10 до 50% мас./мас.

[0073] Микробиологические композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно включают, по меньшей мере, одно биологическое удобрение. Примеры биологических удобрений, которые являются подходящими для использования здесь и могут быть включены в состав микробиологической композиции в соответствии с настоящим изобретением для стимулирования роста и/или урожайности растений, включают микроорганизмы, животных, бактерии, грибы, генетический материал, растения и природные продукты живых организмов. В этих композициях микроорганизмы согласно настоящему изобретению выделяют до того, как получить препарат с добавляемым организмом. Например, такие микроорганизмы, как представители родов Achromobacter, Ampelomyces, Aureobasidium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beauveria, Bradyrhizobium, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Delftia, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Herbaspirillum, Lactobacillus, Mariannaea, Microccocus, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Rhizobium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Stenotrophomonas, Streptomyces, Talaromyces и Trichoderma могут быть представлены в композиции с микроорганизмами согласно настоящему изобретению. Также предпочтительно использование микробиологических композиций согласно настоящему изобретению в сочетании с микроорганизмами, как указано в соответствующих патентах (U.S. Patent Appl. Nos. US 20030172588 A1, US 20030211119 A1; U.S. Pat. Nos. 7,084,331; 7,097,830; 7,842,494; PCT Appl. No. WO 2010109436 A1).

[0074] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиции могут дополнительно включать, по меньшей мере, один химический или биологический пестицид. Количество, по меньшей мере, одного химического или биологического пестицида, используемого в композиции, может варьировать в зависимости от конечного состава, а также от размера растений и семян, подлежащих обработке. Предпочтительно, чтобы количество, по меньшей мере, одного химического или биологического пестицида составляло от 0,1 мас./мас до 80% мас./мас всего препарата. Более предпочтительно, если количество, по меньшей мере, одного химического или биологического пестицида составляет количество от 1 до 60% мас./мас, и наиболее предпочтительно - от 10 до 50% мас./мас.

[0075] Различные химические пестициды являются очевидными для специалиста и могут быть использованы в данной области. Примерные химические пестициды включают классы представителей карбаматных соединений, фосфорорганические пестициды, хлорорганические пестициды и пиретроиды. Также сюда могут быть включены такие защитные химические агенты, как беномил, бура, каптафол, каптан, хлороталонил, медьсодержащие препараты; препараты, содержащие дихлон, диклоран, йод, цинк; фунгициды-ингибиторы биосинтеза эргостерола, такие как, но не ограничиваясь, бластицдидин, цимоксанил, фенаримол, флусилазол, фольпет, имазалил, ипордион, манеб, манкоцеб, металаксил, оксикарбоксин, миклобутанил, оксигетрациклин, пентахлорнитробензол (ПХНБ), пентахлорфенол, прохлораз, пропиконазол, квинометионат, арсенит натрия, натрия динитроортокрезол (ДНОК), гипохлорит натрия, фенилфенат натрия, стрептомицин, сера, тебуконазол, тербутразол, тиабендазол, тиофанатметил, триадимефон, трициклазол, трифорин, валидимицин, винклозолин, цинеб и цирам.

[0076] Микробиологические композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно включают, по меньшей мере, один биологический пестицид. Примеры биологических пестицидов, подходящих для использования в микробиологических композициях в соответствии с настоящим изобретением для предотвращения патогенных болезней растений, могут включать микроорганизмы, животных, бактерии, грибы, генетический материал, растения и природные продукты живых организмов. В этих композициях микроорганизмы согласно настоящему изобретению предварительно выделяют перед приготовлением препаратов с дополнительным организмом. Например, особенно предпочтительными являются варианты изобретения, в которых микроорганизмы, такие как представители видов, но не ограничиваясь: Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces и Trichoderma могут быть представлены в композициях со штаммами и микроорганизмами согласно настоящему изобретению, принадлежащими к представителям грибов рода Muscodor. При этом также предпочтительным подходом является использование микробиологических композиций согласно настоящему изобретению 15 сочетании с микроорганизмами-антагонистами, такими как, например, описанные в патентах США №№7518040, 7601346 или 6312940.

[0077] Примеры грибов, которых возможно комбинировать с микробными штаммами с получением композиций согласно настоящему изобретению, включают, без ограничений виды Muscodor species, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana ("белый мускарин"), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps claviilala, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps facis, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanihae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutellae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae ("зеленый мускарин"), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, а также виды микоризных грибов, такие как Laccaria bicolor. Другие микопестицидные виды будут очевидны специалистам в данной области.

[0078] Настоящее изобретение также относится к способам обработки растений путем использования любых методов и приемов, приемлемых для применения указанных здесь композиций в количествах, эффективных для почв (т.е. заделкой в борозде), частей растений (например, путем смачивания таковых) или нанесением на семена перед посадкой (т.е. покрытием семян или дражированием). Применяемые в настоящем изобретении традиционные препаративные формы могут включать растворы, эмульгируемые концентраты, смачиваемые порошки, суспензионные концентраты, растворимые порошки, гранулы, суспензии, концентраты эмульсии, природные и синтетические материалы, пропитанные активным соединением и очень мелкие полимерные капсулы с регулируемым высвобождением необходимых веществ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, микробные композиции получают в порошках, которые либо доступны в готовой к употреблению композиции либо же смешаны вместе в момент использования. В любом варианте порошок можно смешивать с почвой до или во время посева. В альтернативном варианте осуществления, один или оба агента из числа способствующих росту или биологической защите растений могут представлять собой жидкие препараты, которые смешивают вместе во время обработки. Специалисту в данной области техники понятно, что эффективное количество композиции согласно изобретению зависит от конечного состава композиции, а также от размера растений или семян, подлежащих обработке.

[0079] В зависимости от конечной композиции и способа ее применения, в композицию согласно настоящему изобретению также могут быть введены одна или несколько подходящих добавок, в т.ч. клеящие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), природные и синтетические полимеры в виде порошков, гранул или латексов, таких как гуммиарабик, хитин, поливиниловый спирт, поливинилацетат, а также природные фосфолипиды, такие как цефалины, лецитины и синтетические фосфолипиды.

[0080] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, микробиологические композиции готовят в отдельном стабильном растворе, эмульсии или суспензии. Для растворов, активные химические соединения, используемые для приготовления композиций, предварительно растворяют в соответствующих растворителях, как правило, до того, как будет добавлен биологический агент. Подходящие жидкие растворители могут содержать: ароматические соединения на нефтяной основе, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины; алифатические углеводороды, такие как циклогексан или парафины; а также нефтяные фракции; минеральные и растительные масла; спирты, такие как бутанол или гликоль; их простые и сложные эфиры; кетоны, такие как метилэтилкетон, метилизобутилкетон или циклогексанон; сильно поляризованные растворители, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид. При приготовлении эмульсии или суспензии в качестве жидкой фазы используют воду. В некоторых случаях химический и биологический агенты подвергаются дифференцированному суспендированию, например каждый по отдельности или каждый в отдельной жидкости и т.п., и затем подвергаются смешиванию их друг с другом в момент применения. В предпочтительном варианте настоящего изобретения суспензию, химический агент и биологический агент объединяют в готовую к употреблению композицию, имеющую достаточно длительный срок хранения. При использовании такая жидкость может быть, например, разбрызгана по обрабатываемой поверхности, применена путем мелкодисперсного опрыскивания листьев в виде распыляемого аэрозоля, либо внесена в борозды в момент посадки культуры. Жидкая композиция в ее эффективном количестве также может быть нанесена на семена (т.е. путем покрытия семян или дражирования) или в почву (т.е. в борозде) до прорастания семян или непосредственно в почву 15 зоне контакта с корневой системой путем использования различных приемов, известных в данной области, включая, но не ограничивая, капельное орошение, спринклеры, инъекции почвы или орошение почвы.

[0081] По желанию, могут быть также добавлены стабилизаторы и буферные вещества, в том числе соли щелочных и щелочноземельных металлов; органические соли; органические кислоты, такие как лимонная и аскорбиновая; неорганические кислоты, такие как соляная или серная. Кроме того, могут быть добавлены биоциды, формальдегиды или формальдегид-освобождающие агенты, производные бензойной кислоты, такие как п-гидроксибензойная кислота и др.

Патогены

[0082] Специалисту в данной области понятно, что способы и композиции согласно настоящему изобретению, в принципе, могут быть применимы для подавления развития любых фитопатогенов или любых вызываемых ими болезней. Т.е. это означает, что изобретение не ограничивается только конкретными, указанными в настоящем описании типами культур или клеток. Например, микробные клетки, которые подвергаются сложным формам дифференциации, филаментации, споруляции и т.д. также могут быть использованы в способах и композициях согласно настоящему изобретению.

[0083] Примеры фитопатогенных болезней, которые подходят для применения способов и материалов настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваться, заболеваниями вызванными широким спектром патогенных грибов. Способы согласно настоящему изобретению предпочтительно применять в отношении патогенных грибов, которые важны или представляют интерес для сельского хозяйства, садоводства, биомассы растений для производства молекул биотоплива и других химических веществ и/или лесного хозяйства. Особый интерес представляют патогенные виды Pseudomonas (например, Pseudomonas solanacearum), Xylella fastidiosa:, Ralslonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, виды Fusarium, виды Phytophlhora (например, P.infestans), виды Botrytis, виды Leptosphaeria, возбудители мучнистой росы (Ascomycota) и ржавчины (Basidiomycota), и т.д.

[0084] Не ограничивающие примеры патогенов растений, представляющих интерес, включают, например, Acremonium strictum, Agrobacterium tumefaciens, Alternaria alternata, Alternaria solani, Aphanomyces euteiches, Aspergillus fumigatus, Athelia rolfsii, Aureobasidhim pullulans, Bipolaris zeicola, Botrytis cinerea, Calonectria kyotensis, Cephalosporhim maydis, Cercospora medicaginis, Cercospora sojina, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum graminicola, Coniella diplodiella, Coprinopsis psychromorbida, Corynespora cassiicola, Curvularia pallescens, Cylindrocladium crotalariae, Diplocarpon earlianum, Diplodia gossyina, Diplodia spp., Eplcocciun nigrum, Erysiphe dehoracearum, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum f.sp. tuberosi, Fusarium proliferatum var. proliferatum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Glomerella tucumanensis, Guignardia bidwellii, Kabatiella zeae, Leptosphaerulina briosiana, Leptolrochila medicaginis, Macrophomina, Macrophomina phaseolina, Magnaporthe grisea, Magnaporthe oryzae, Microsphaera manshurica, Monilinia fructicola, Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella fragariae, Nigrospora oryzae, Ophiostoma ulmi, Pectobacterium carotovorum, Pellicularia sasakii (Rhizoctonia solani), Peronospora manshurica, Phakopsora pachyrhizi, Phoma foveata, Phoma medicaginis, Phomopsis longicolla, Phytophlhora cinnamomi, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora fragariae, Phytophlhora infestans, Phytophthora medicaginis, Phytophthora megasperma, Phytophthora palmivora, Podosphaera leucotricha, Pseudopeziza medicaginis, Puccinia graminis suhsp. Tritici (UG99), Puccinia sorghi, Pyricularia grisea, Pyricularia oryzae, Pylhium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae, Rosellinia sp., Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinina trifoliorum, Sclerotium rolfsii, Septoria glycines, Septoria lycopersici, Setomelanomma turcica, Sphaerotheca macularis, Spongospora subterranea, Stemphylium sp, Synchyirium endobioticum, Thecaphora (Angiosorus), Thielaviopsis, Tilletia indica, Trichoderma viride, Ustilago maydis, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Vertieillum dahliae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

[0085] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способы и материалы согласно изобретению применимы для подавления развития патогенов Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Cerpospora betae, Colletotrichum sp., Curvnlaria spp., Fusaruim sp., Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Gibberella sp., Monographella sp., Mycosphaerella fijiensis, Phytophthora palmivora, Phytophthora ramorum, Penicillivm sp., Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus spp., Scliizophylhtm spp., Sclerotinia sclerotiorum, Stagnospora sp., Verticillium dahliae или Xanthomonas axonopodis. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения способы и материалы могут быть использованы для подавления развития нескольких патогенов растений, имеющих коммерческое значение, в том числе Fusarium graminearum NIIRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC-16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotrichum graminicola ATCC-34167 или Penicillium sp. патогены.

Препараты для обработки семян

[0086] В особенно предпочтительном варианте микробные композиции согласно настоящему изобретению готовят в виде препаратов для обработки семян. Предполагается, что семена могут быть в основном равномерно покрываемы одним или несколькими слоями микробных композиций, из числа рассмотренных здесь, с использованием обычных методов смешения, распылением или их комбинацией посредством использования оборудования для прикладной обработки, которое специально разработано и изготовлено с целью точного, безопасного и эффективного применения препаратов для обработки семян. Такое оборудование может использовать различные типы рабочих устройств, узлов и технологий покрытия, такие как поворотные и барабанные устройства для нанесения покрытий, различные методы обработки в псевдоожиженном слоем (так называемое «полусухое протравливание»); установки с локальным типом фонтанирования, роторные устройства-туманообразователи или их комбинации. Жидкие обработки семян, такие как предусмотрены вариантами реализации настоящего изобретения, могут быть осуществлены с помощью вращающихся дисковых распылительных устройств или распылительных сопел, которые, находясь в движении, равномерно распределяют обрабатываемый препарат на неподвижные семена. Предпочтительно, если обработанные семена затем дополнительно перемешивают или переворачивают в течение определенного периода, с целью лучшего их распределения и сушки. Семена также могут быть подвержены дополнительной грунтовке или снятию покрытий перед нанесением композиции согласно изобретению, чтобы увеличить равномерность прорастания и появления всходов. В альтернативном варианте, сухой порошковый препарат можно дозировано вносить на поток движущихся семян и перемешивать до полного его распределения.

[0087] Другой аспект изобретения предусматривает семена, обработанные предлагаемыми микробными композициями. Например, один из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривает семена, имеющие, по меньшей мере, часть площади поверхности, покрытой микробиологической композицией в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления, семена, обработанные микроорганизмом, могут содержать концентрации от 10⁶ до 10⁹ и более спор или микробных клеток на 1 обработанное семя. Семена также могут содержать больше спор или микробных клеток на 1 обработанное семя, например 10¹⁰, 10¹¹, 10¹² спор на семя. Микробные споры и/или клетки могут находиться на обработанных семенах в свободном состоянии или, что более предпочтительно, перед нанесением на семена могут быть предварительно приготовлены в виде жидкой или твердой композиции. Например, твердая композиция, содержащая микроорганизмы, может быть получена путем смешивания твердого носителя с суспензией спор до тех пор, пока твердые носители не будут пропитаны указанными спорами или клеточной суспензией. После этого полученная смесь может быть подвергнута высушиванию с целью получения желаемых частиц.

[0088] В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения предполагается, что твердые или жидкие микробные композиции могут дополнительно содержать функциональные агенты, например, такие как активированный уголь, которые способны защитить семена от вредного воздействия селективных гербицидов, а также питательные вещества (удобрения) и им подобные субстанции, способные улучшать всхожесть растений и качество продукции,- или же содержать комбинацию указанных агентов.

[0089] Способы покрытия семян и композиции, которые уже известны в данной области, могли бы быть особенно полезны тогда, когда они изменены путем добавления одного из вариантов осуществления настоящего изобретения. В частности, такие способы нанесения покрытия и аппаратура для их применения раскрыты, например, в патентах США. №№5918413, 5554445, 5389399, 4759945 и 4465017. Композиции покрытия семян, раскрыты, например среди прочих, в патентах США №№20100154299, 5939356, 5876739, 5849320, 5791084, 5661103, 5580544, 5328942, 4735015, 4634587, 4372080, 4339456, и 4245432.

[0090] К композициям, содержащим препараты для обработки семян согласно изобретению, могут быть добавлены различные добавки, например, связующие, которые содержат преимущественно природный или синтетический адгезивный полимер и не оказывают при этом фитотоксичного воздействия на обрабатываемые семена. Связующее может быть выбрано из множества: поливинилацетаты; поливиниловые сополимеры; сополимеры этиленвинилацетата (ЭВА); поливиниловые спирты; сополимеры поливинилового спирта; целлюлозы, в том числе этилцеллюлозы, метил целлюлозы, гидроксиметилццеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлоза; поливинилпирролидон; полисахариды, в том числе крахмал, модифицированный крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинаты и хитозаны; жиры; масла; белки, в том числе желатин и зеины; гуммиарабик; шеллаки; випилиденхлорид и его сополимеры; лигносульфонаты кальция; акриловые сополимеры; поливинилакрилаты; полиэтиленоксид; полимеры и сополимеры акриламида; полю идроксиэтилакрилат, мономеры метилакриламида; полихлоропреповые соединения.

[0091] Могут быть использованы любые из различных красителей, в том числе органических хромофоров, классифицированных как нитрозо-; нитро-; азо-, например моноазо-, бис-азо- и полиазокрасители; акридин, антрахинон, азин, дифенилметан, индамин, индофенол, метин, оксазин, фталоцианин, тиазин, тиазол, триарилметан, ксантен. Другие добавки, которые могут быть добавлены, включают следовые количества питательных веществ, таких как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка. Чтобы обеспечить прочность и надежность нанесения порошкового препарата на обрабатываемые семена, может быть применен полимер или ограничивающий пылеобразование агент.

[0092] В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, в дополнение к микробным клеткам или спорам, покрытие может дополнительно содержать слой прилипающего вещества. При этом адгезивный агент должен быть нетоксичным, биоразлагаемым, и способным к прилипанию. Примеры таких материалов могут включать без ограничения, поливинилацетаты; поливиниловые сополимеры; поливиниловые спирты; сополимеры поливинилового спирта; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, и гидроксиметилпропилцеллюлоза; декстрины; альгинаты; сахара; мелассу; поливинилпирролидон; полисахариды; белки; жиры; масла; гуммиарабик; желатин; сиропы и крахмалы. Дополнительные примеры агентов можно найти, например, в патентах США. №№7213367 и 20100189693.

[0093] В содержимое композиций для обработки семян в соответствии с настоящим изобретением также могут быть включены различные добавки, такие как адгезивные агенты, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, питательные вещества и буферные ингредиенты. Другие обычные добавки для обработки семян включают без ограничения: покрывающие агенты, смачивающие агенты, буферные агенты и полисахариды. К композиции для обработки семян также может быть добавлен, по меньшей мере, один сельскохозяйственно приемлемый носитель, такой как вода, твердые или сухие порошки. Сухие порошки могут быть получены из различных материалов, таких как карбонат кальция, гипс, вермикулит, тальк, гумус, активированный уголь и различные фосфорные соединения.

[0094] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция для покрытия семян может содержать, по меньшей мере, один органический или неорганический наполнитель, являющийся натуральным или синтетическим компонентом, с которым активные компоненты объединяются для облегчения его применения на семенах. Предпочтительно наполнитель представляет собой инертное твердое вещество, такое как, например: глины; природные или синтетические силикаты, диоксид кремния; смолы, воски; твердые удобрения (например, аммониевые соли); природные почвенные минералы, такие как каолины, глинозем, тальк, известь, кварц, аттапульгит, монтмориллонит, бентонит; диатомовая земля; синтетические минералы, такие как диоксид кремния, оксид алюминия; силикаты, в частности силикаты алюминия или магния.

[0095] Препарат для обработки семян может дополнительно включать один или более из следующих ингредиентов: другие пестициды, в том числе соединения, действующие только под землей; фунгициды, такие как каптан, тирам, металаксил, оксадиксил, флудиоксонил, а также изомеры каждого из этих материалов и т.п.; гербициды, в том числе соединения, выбранных из множества: глифосат, карбаматы, тиокарбаматы, ацетамид, триазины, динитроанилины, простые эфиры глицерина, пиридазинон, урацил, феноксил, мочевина и бензойная кислота; гербицидные антидоты, такие как бензоксазин, производные бензгидрил-N-,N-диаллилднхлорацетамида; различные дигалоцил-, оксазолидинил- и тиазолидинил-соединения, этанон, ангидридные соединения нафтеновой кислоты и производные оксима; химические удобрения; биологические удобрения; а также представители агентов биозащиты, такие как другие природные микроорганизмы или рекомбинаптные бактерии и грибы из родов Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia Trichoderma, Glomus, Gliocladium и микоризные грибы. Эти ингредиенты могут быть добавлены в виде отдельного слоя на семена или, альтернативно, могут быть добавлены в качестве части композиции для покрытия семян согласно этому изобретению.

[0096] Количества новосозданной композиции или других ингредиентов, используемых в обработке семян, не должны ингибировать прорастание семени, а также не должны вызывать их фитотоксическое повреждение семян.

[0097] Препаративные формы, используемые для обработки семян в настоящем изобретении, могут быть представлены в виде суспензии; эмульсии; взвеси частиц в водной среде (например, в воде); смачиваемого порошка; смачиваемых гранул (сухая текучая паста); и сухих гранул. Если препарат для обработки семян приготовлен в виде суспензии или взвеси, то концентрация активного ингредиента в такой композиции может составлять от 0,5 до 99% по массе (мас./мас.), предпочтительно 5-40%, или как приготовлено иначе специалистом в этой сфере.

[0098] Как упоминалось выше, в композицию согласно настоящему изобретению могут быть дополнительно включены неактивные, или инертные, ингредиенты. Такие инертные ингредиенты могут включать без ограничения: обычные агенты для прилипания: диспергирующие агенты, такие как, например, метилцеллюлоза, - агенты, предназначенные для использования в обработке семян действующие как агенты для диспергирования / прилипания; поливиниловый спирт; лецитин, полимерные диспергаторы (например, смесь поливинилпирролидон-винилацетат); загустители (например, глинистые загустители для улучшения вязкости и снижения оседания частиц суспензии); стабилизаторы эмульсии; поверхностно-активные вещества; антифризные соединения (например, мочевина), красители и т.п.. Дополнительные сведения относительно использования инертных ингредиентов могут быть найдены, например, в источниках (MeCutcheon's, vol. 1, "Emulsifiers and Detergents," MC Publishing Company, Glen Roek, N.J., U.S.A., 1996) и (MeCtcheon's, vol. 2, "Functional Materials," MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., U.S.A., 1996).

[0099] Покрытие семян композицией согласно настоящему изобретению может быть осуществлено с помощью различных приемов, включая такие, как перемешивание в контейнере (например, в бутылке или пакете), механическое нанесение, покрытие с помощью барабанного устройства, распыление, погружение и т.п. для обеспечения лучшего контактирования микробных композиций с семенами в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано разнообразие имеющихся активных пли инертных материалов, например, обычных материалов пленочного покрытия, включая без ограничения, пленки на водной основе, такие как SEPIRET™ (Scppic, Inc., N.J.) и OPACOAT™ (Berwind Pharm. Services, P.A.).

[00100] Количество композиции согласно настоящему изобретению, используемой для обработки семян, несомненно, будет варьировать в зависимости от типа семян и типа активных ингредиентов, но в любом случае обработка должна включать контактирование семян с сельскохозяйственно (агротехнически) эффективным количеством композиции. Как обсуждалось выше, эффективное количество - означает количество композиции согласно изобретению, которое является достаточным для благотворного влияния или достижения желаемых результатов. Эффективное количество может быть введено в один или несколько приемов.

[00101] Помимо слоя покрытия, семена могут быть обработаны одним или более из следующих ингредиентов: другие пестициды, включая фунгициды и гербициды; гербицидные антидоты; удобрения и/или агенты биозащиты. Эти ингредиенты могут быть добавлены в качестве отдельного слоя или, альтернативно, могут быть добавлены в тот же слой покрытия.

[00102] Композиции покрытий для семян по настоящему изобретению могут быть нанесены на семена с помощью различных приемов и машин, таких как способ с использованием псевдоожиженного слоя, методика с использованием вальцовой мельницы, ротостатические устройства для обработки семян и барабанные устройства для нанесения покрытий. Могут быть использованы другие способы, такие как способ с использованием фонтанирующего слоя. До нанесения покрытия семена можно подвергнуть сортировке. После нанесения покрытия семена обычно сушат, а затем направляют в сортировочную машину для сортировки. Такие приемы известны в данной области техники.

[00103] Семена, обработанные микроорганизмами, могут быть заключены в пленочное защитное покрытие для защиты указанного покрытия. Такие защитные покрытия известны в данной области техники и могут быть нанесены с помощью приемов псевдоожиженного слоя и барабанных устройств для нанесения покрытий.

[00104] В другом варианте реализации настоящего изобретения композиции в соответствии с настоящем изобретением могут быть нанесены на семена с помощью грунтования твердой матрицы. Например, определенное количество композиции по настоящему изобретению может быть смешано с материалом твердой матрицы, а затем семена могут быть приведены в контакт с указанным материалом твердой матрицы на достаточный период для внедрения композиции в семена. Затем семена необязательно отделяют от материала твердой матрицы и хранят или используют, или можно хранить или сажать непосредственно смесь материала твердой матрицы плюс семена. Материалы твердой матрицы, которые применимы в настоящем изобретении, включают полиакриламид, крахмал, глину, диоксид кремния, оксид алюминия, грунт, песок, полимочевину, полиакрилат или любой другой материал, способный к абсорбции или абсорбирующий композицию настоящего изобретения в течение определенного времени и выделяющий эту композицию в или на семена. Необходимо убедиться, что композиция настоящего изобретения и материал твердой матрицы совместимы друг с другом. Например, материал твердой матрицы следует выбирать так, чтобы он мог высвобождать композицию с приемлемой скоростью, например, в течение периода нескольких минут, часов или дней.

[00105] В принципе, в соответствии с настоящим изобретением можно обрабатывать семена любых растений, способных прорастать с образованием растения. Подходящие семена включают семена злаков, кофе, семена капусты, семена прядильных культур, цветов, фруктов, бобовых, семена масличных культур, деревьев, семена клубнеплодов, овощей, а также других растений однодольных и двудольных видов. Предпочтительно, покрываемые семена злаков включают, но, не ограничиваясь этим, семена бобов, моркови, кукурузы, хлопка, злаковых, салата, арахиса, перца, картофеля, рапса, риса, ржи, сорго, фасоли, сахарной свеклы, подсолнечника, табака и томатов. Наиболее предпочтительно, композициями настоящего изобретения покрывают семена ячменя или пшеницы (яровом пшеницы или озимой пшеницы).

Получение микробных композиций в соответствии с настоящим изобретением

[00106] Для применения в микробных композициях настоящего изобретения культуры микроорганизмов могут быть получены с помощью стандартных приемов статического высушивания и жидкостной ферментации, известных в данной области техники. Выращивание, как правило, выполняют в биореакторе.

[00107] Биореактор относится к устройству или системе, которая поддерживает биологически активную среду. Как описано в настоящем документе, биореактор представляет собой емкость, в которой могут быть выращены микроорганизмы, включая микроорганизмы настоящего изобретения. Биореактор может быть любой подходящей формы или размера для выращивания микроорганизмов. Размер и масштаб биореактора может варьироваться от 10 мл до литров и до кубических метров, и может быть выполнен из нержавеющей стали или любого другого подходящего материала, известного и используемого в данной области техники. Биореактор может быть биореактором периодического действия, биореактором с подпиткой или биореактором непрерывного действия (например, реактор с непрерывным перемешиванием). Например, биореактор может быть хемостатом, известным и используемым в области микробиологии для выращивания и сбора микроорганизмов. Биореактор может быть закуплен у любого коммерческого поставщика (см. также Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995).

[00108] Для операции в малом масштабе может быть использован биореактор периодического действия, например, для испытания и разработки новых процессов, а также для процессов, которые не могут быть переведены на непрерывную эксплуатацию.

[00109] Микроорганизмы, выращенные в биореакторе, могут быть суспендированы или иммобилизованы. Выращивание в биореакторе, как правило, выполняют в аэробных условиях при подходящих температурах и pH для выращивания. Для организмов настоящего изобретения рост клеток может быть достигнут при температурах от 5 до 37°C, с предпочтительной температурой в диапазоне от 15 до 30°C, от 15 до 28°C, от 20 до 30°C или от 15 до 25°C. pH питательной среды может варьироваться от 4,0 до 9,0, но предпочтительный рабочий диапазон, как правило, составляет от слабокислого до нейтрального при pH от 4,0 до 7,0 или от 4,5 до 6,5, или от pH 5,0 до 6,0. Как правило, максимальный выход клеток получают через 20-72 часа после инокуляции.

[00110] Оптимальные условия для выращивания микроорганизмов настоящего изобретения, конечно, зависят от конкретного штамма. Однако на основании условий, используемых в выбранном процессе, и общих требований для большинства микроорганизмов специалисты в данной области могут определить незаменимые питательные вещества и условия. Микроорганизмы, как правило, выращивают в аэробных жидких культурах на среде, которая содержит источники углерода, азота и неорганических солей, которые могут быть ассимилированы микроорганизмом и поддерживают эффективный клеточный рост. Предпочтительные источники углерода представляют собой гексозы, такие как глюкоза, но они могут быть заменены на другие легко ассимилируемые источники, такие как аминокислоты. В качестве источников азота в процессе роста могут быть использованы многие неорганические и белковоподобные материалы. Предпочтительные источники азота представляют собой аминокислоты и мочевину, а другие включают газообразный аммиак, неорганические соли нитрата и аммония, витамины, пурины, пиримидины, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, протеозопентон, соевый шрот, гидролизаты казеина, фильтрат барды и тому подобные. Среди неорганических минералов, которые могут быть введены в питательную среду, - обычные соли, которые могут давать ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния, меди, кобальта, калия, натрия, молибдат, фосфат, сульфат, хлорид, борат и тому подобные. Не ограничиваясь этим, предпочтительным является применение жидкой среды с картофельной декстрозой для грибковых штаммов и питательного премикса R2A - для бактериальных штаммов.

Новые разновидности растений

[00111] В другом аспекте настоящего изобретения представлено также новое растение, созданное искусственным внедрением микробного эндофита настоящего изобретения в растение, не содержащее эндофитных микроорганизмов. В некоторых вариантах реализации этого аспекта микробный эндофит, внедренный в растение, может представлять собой эндофитный микроорганизм, обладающий активностью в отношении ускорения роста растения, активностью биологического контроля или комбинацией обеих активностей. В данной области техники известны различные способы, ранее обнаруженные как эффективные для внедрения микробного эндофита в виды зерновых культур. Примеры таких способов включают способы, описанные в заявке на патент США №20030195117 A1, заявке на патент США №20010032343 A1 и в патенте США №7084331, среди прочих. Специалистам в данной области понятно, что многие из вышеупомянутых способов могут быть пригодны для создания нового растения настоящего изобретения.

[00112] После искусственного инфицирования предпочтительно, чтобы последовательность ДНК изолированного эндофитного микроорганизма была амплифицирована с помощью ПЦР, и этот эндофит подтверждают выполнением поиска гомологии для амплифицированной последовательности ДНК. Дополнительно, предпочтительно, чтобы чужеродный ген, который экспрессирует легко идентифицируемые средства, был внедрен в вышеупомянутый эндофитный микроорганизм, а наличие колонизации вышеупомянутого эндофитного микроорганизма, инфицирующего растение, подтверждают по вышеуказанным легко идентифицируемым признакам с помощью чужеродного гена.

Растения, подходящие для способов настоящего изобретения

[00113] В принципе, способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены для любых видов растений. Особенно пригодны однодольные, а также двудольные виды растений. Способы и композиции предпочтительно используют с растениями, которые являются важными или перспективными для сельского хозяйства, садоводства, для производства биомассы, используемой в производстве молекул жидкого топлива и других химических веществ, и/или для лесоводства.

[00114] Так, настоящее изобретение имеет применение в широком ряде растений, предпочтительно, высших растений, относящихся к классам Angiospermae и Gymnospermae. Особенно подходят растения подклассов Dicotylodenae и Monocotyledonae. Двудольные растения принадлежат к порядкам Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Copparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Illiciales, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumbaginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales и Violales. Однодольные растения принадлежат к порядкам Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales и Zingiberales. Растения, принадлежащие к классу Gymnospermae, представляют собой Cycadales, Ginkgoales, Gnetales и Pinales,

[00115] Подходящие виды могут включать члены рода Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.

[00116] Способы и композиции настоящего изобретения предпочтительно используют в растениях, которые являются важными или перспективными для сельского хозяйства, садоводства, получения биомассы для производства молекул жидкого топлива и других химических веществ и/или для лесоводства. Не ограничивающие примеры включают, например, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискант), Saccharum sp. (энергетический тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Cossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago saliva (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла), Pennisetum glaucum (пеннисетум рогозовидныи), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (бородач), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (канареечник трубковидный), Cynodon dactylon (бермудская трапа), Festuca arundinacea (овсяница тростниковая), Spartina pectinata (спартина гребенчатая), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale spp. (пшенично-пырейная X рожь), Bamboo, Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина обыкновенная), Elaeis guineensis (масличная пальма), Phoenix dactylifera (финиковая пальма), Archontophoenix cunninghamiana (королевская пальма), Syagrus romanzoffiana (арекаструм), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Manihot esculenta (кассава), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca saliva (салат), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (клубника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium сера (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква), Cucurbita moschata (тыква), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), Papaver somniferum (опиумный мак), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serralum (баранец пильчатый), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parilienium, Coleits forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argenlatum (гванола), Hevea spp. (латекс), Mentha spicata (мята), Mentha piperita (мята), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), Petunia spp. (петуния), Poinsettia puleherrima (пуансеттия), Nicotiana tabacum (табак), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевица (Agrostis spp.), Populus tremuloides (тополь осинообразный), Pinus spp. (сосна), Abies spp. (ель), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик луговой), Lolium spp. (плевел), Phleum pratense (тимофеевка луговая) и хвойные. Представляют собой интерес растения, выращиваемые для производства энергии, так называемые энергетические культуры, такие как целлюлозные энергетические культуры типа Panicum virgatum (просо прутьевидное), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискант), Saccharum sp. (энергетический тростник), Populus balsamifera (тополь), Andropogon gerardii (бородач), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (катареечник трубковидный), Cynodon dactylon (бермудская трава), Festuca arundinacea (овсяница тростниковая), Spartina pectinata (спартина гребенчатая), Medicago saliva (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale spp. (пшенично-пырейная X рожь) и Bamboo; и крахмальные энергетические культуры типа Zea mays (кукуруза) and Manihot esculenta (кассава); а также сахарные энергетические культуры типа Saccharum sp. (сахарный тростник), Beta vulgaris (сахарная свекла) и Sorghum bicolor (L.) Moench (сладкий сорго); а также энергетические культуры для производства биотоплива типа Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinclorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина обыкновенная), Elaeis guineensis (африканская масличная пальма), Elaeis oleifera (американская масличная пальма), Cocos nucifera (кокосовые орехи), Camelina sativa (льнянка обыкновенная), Pongamia pinnata (понгамия), Olea europaea (маслина), Linum usitatissimum (лен), Crambe abyssinica (абиссинская капуста) и Brassica juncea.

[00117] Обзор общих способов, представленных в настоящем документе, предназначен лишь для иллюстративных целей. Другие альтернативные способы и варианты реализации понятны специалистам в данной области при рассмотрении настоящего описания, и они входят в общую идею и область настоящей заявки.

[00118] Следует также понимать, что следующие примеры представлены для иллюстрации, но не ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Выделение микроорганизмов из образцов окружающей среды

[00119] Идентификация спорообразующих ризобактерий с использованием обработанных ультразвуком корней и способа серийных разбавлений. Следующие микроорганизмы были выделены по способу «обработанных ультразвуком корней, серийных разбавлений», описанному ниже: изоляты SGI-026-G06 и SGI-026-G07, которые выделили из образца иглоподобной травы; изолят SGI-041-B03, который выделили из образца дикой ржи; и изолят SGI-020-A01, который выделили из ткани корневища пшеницы, выращенной в образце почвы со сложным профилем.

[00120] Разработали процедуру обогащения для специального определения спорообразующих ризобактерий. Вкратце, экстракты обработанных ультразвуком корней подвергли тепловой обработке для уничтожения растительных клеток, а затем поместили на обогащенную среду. Микроорганизмы, выжившие после тепловой обработки и образовавшие колонии, считали спорообразующими. Было обнаружено, что этот способ особенно эффективен для отбора грамположительных бактерий. Для этих обогащений использовали свежие образцы корней в качестве исходного материала. Тонкие сегменты, находящиеся на кончиках корней, являются самыми молодыми, они могут иметь высокую плотность корневых волосков и обычно имеют высокую плотность ризобактерий. Использовали стерильное лезвие для разрезания этих участков корней па сегменты по 5-10 см, которые затем промывали стерильной водой milliQ для удаления крупных частиц почвы. При необходимости выполняли более тщательное промывание, помещая корни в 50 мл пробирку фирмы Falcon с 25 мл 1× стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и перемешивали на вортексе в течение 1 минуты. Затем каждый образец корней суспендировали в 20 мл стерильном буфере PBS и обрабатывали ультразвуком на льду в течение двух 1-минутных интервалов при 8 ваттах, используя ультразвуковой дисмембратор Fisher Scientific. Для тепловой обработки, как правило, 1 мл обработанной ультразвуком суспензии корневых клеток перенесли в стерильную пробирку фирмы Eppendorf и инкубировали на водяной бане при 80°C в течение 20 минут. После тепловой обработки клеточные суспензии оставили остывать до комнатной температуры, затем серийно разбавили до концентраций 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 и 10^-7. 100 мкл каждого 10-кратного разбавления нанесли на культуральные планшеты, содержащие микробиологическую среду, отвержденную агаром, и 100 мг/л циклогексимида для инициирования роста грибков. В некоторых случаях было необходимо выполнить разбавление 1/10 или 1/100 перед нанесением на планшет, чтобы получить надлежащую плотность колониеобразующих единиц (КОЕ) для выделения колоний. Выделенные колонии собрали наконечниками стерильных пипеток, разместили в 96-луночных микротитровальных планшетах, каждый из которых содержал 150 мкл 2× жидкой среды YT на лунку. Микротитровальные планшеты инкубировали в течение 1-2 дней при 30°C для получения высокой плотности клеток для дальнейшей характеристики и архивирования.

[00121] Выделение бактерий, образующих биопленки. Следующие микробные изоляты были выделены с помощью способа «биопленкообразователя», описанного ниже: изолят SGI-003-H11, который выделили из образна корней растения юкка; изолят SGI-034-C09, который выделили из образца корней травы; и изолят SGI-034-Е10, который выделили из образца растения «кружево королевы Анны».

[00122] Способ биопленкообразователя: В этом способе бактерии, образующие биопленки, выделили из сегментов обработанных ультразвуком корней, как описано учеными Fall et al (Sysf. Appl. Microbiol. 27, 372-379, 2004). Как описано выше, бактерии, которые образуют биопленки на поверхности корней, как правило, представляют собой очень хороню колонизирующие корни бактерии. В целом, если такие бактерии содержатся в высокой плотности, они могут оказывать значительное воздействие на здоровье растения и могут полностью исключать инвазивные патогенны. Вкратце, для удаления бактериальных и грибковых клеток, слабо прикрепленных к корням, использовали обработку ультразвуком, в результате чего остались только тс микробы, которые прочно держатся на поверхности корня. С помощью этого способа отобрали грамположительные и грамотрицательные бактерии, образующие биопленки.

[00123] Для этих обогащений использовали свежие образцы корней в качестве исходного материала. Тонкие сегменты, находящиеся на кончиках корней, являются самыми молодыми тканями, они имеют высокую плотность корневых волосков и обычно имеют высокую плотность ризобактерий. Использовали стерильное лезвие для разрезания этих участков корней па сегменты по 5-10 см, которые затем промывали, помещая их в 50 мл пробирки фирмы Falcon с 25 мл 1 × PBS и перемешивали на вортексе в течение 1 минуты. Дебрис после промывания оставили оседать, а затем использовали стерильный пинцет, чтобы перенести промытые сегменты корней в 50 мл пробирки фирмы Falcon, наполненные 25 мл 1 × PBS, и обрабатывали ультразвуком на льду, используя ультразвуковой дисмемабратор Fisher Scientific в течение двух 30-секуидных интервалов с паузой между импульсами в 30 секунд. Обработанные ультразвуком образцы корней перенесли в стерильные пластиковые чашки Петри и оставили до полного высыхания, не закрывая бокс биологической безопасности. Затем каждый сегмент корней поместили на отдельный планшет СМА, содержащий 1% агара (10 г/л казеинового перевара, 10 г/л маннита, 10 г г/л агара). Иногда использовали стерильный пинцет, чтобы погрузить сегмент корня в агаровую среду. Затем планшеты инкубировали при 37°C и контролировали микробный рост. Как правило, через 1-2 дня из корней появлялись многочисленные микробные культуры на среде СМА. Использовали наконечник стерильной пипетки для сбора культур с одинаковой морфологией вместе с сегментом, и каждую из этих культур перенесли в центр СМА планшета, содержащего 0,3% агарозы. Затем планшеты СМА инкубировали в течение 1-2 дней при 37°C и контролировали рост. Как правило, на этой среде биопленкообразующие изоляты демонстрировали дендритный рост.

[00124] Использовали стерильную петлю для переноса биомассы и штриховой очистки каждого изолята с планшетов СМА на планшеты СМКА (2% агара, 1,2 г/л K2HPO4). Среда СМКА ограничивает рост биопленки и обеспечивает возможность сбора отдельных колоний для архивирования.

ПРИМЕР 2: Выращивание и хранение микробных изолятов

[00125] Выделенные бактерии хранили как чистую культуру. Бактериальную колонию перенесли в пробирку, содержащую жидкую среду питательного премикса R2A (Tecknova) и оставили расти при 30°C при встряхивании при 250 об./мин. в течение двух дней. Затем культуру перенесли в пробирки, содержащие 15% глицерина, и хранили при -80°C.

ПРИМЕР 3: Экстракция ДНК, секвестрование и таксономия

[00126] Аликвоту 20 мкл суспензии бактериальных клеток перенесли в 96-луночный планшет для ПЦР, содержащий 20 мкл 2х лизисного буфера (100 мМ Tris HCL, pH 8,0, 2 мМ ЭДТК, pH 8,0, 1% ДСН. 400 мкг/мл протеиназы Κ). Условия лизиса были следующими: инкубация при 55°C в течение 30 минут, затем инкубация при 94°C в течение 4 минут. Аликвоту продукта лизиса использовали в качестве источника матричной ДНК, для ПЦР амплификации.

[00127] Для амплификации участка 16S рРНК каждую ПЦР смесь приготовили в конечном объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащей 4 мкл реакционной смеси бактериального лизиса, 2 мкМ каждого ПЦР праймера, 6% Tween-20 и 10 мкл 2х ImmoMix (Biolinc USA Inc, Тонтон, штат Массачусетс). Праймерами, использованными для ПЦР амплификации, были M13-27F (5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' SEQ ID NO: 8) и 1492R M13-концевой (5'-CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3'; SEQ ID NO: 9). ПЦР выполнили в персональном термоциклере РТС-200 (MJ-Research, штат Массачусетс, США) следующим образом: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд на протяжении 30 циклов; 72°C в течение 10 минут.2 мкл аликвоту каждого продукта ПЦР пропустили через 1,0% агарозный гель, чтобы подтвердить единственную полосу ожидаемого размера. Положительные полосы выделили, очистили и подвергли ПЦР секвенированию. Секвестрование было выполнено в прямом и обратном прайминг-направлениях институтом Дж. Крейга Вентера в Сан-Диего, штат Калифорния, с использованием 454 технологий.

[00128] Поиск гомологии для определенной нуклеотидной последовательности выполнили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. Затем анализировали филогенетическую взаимосвязь нуклеотидной последовательности 16 генов рРНК в выделенных бактериальных штаммах, описанных в настоящем документе, бактерий родов и видов, которые демонстрируют высокие гомологии последовательностей с выделенными бактериальными штаммами, а также с многочисленными другими бактериальными родами и видами, используя программу построения филогенетического дерева ClnstalW. Идентичность и подобие последовательностей определили также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Вустер, штат Массачусетс, США). Результаты анализа последовательностей выявили, что бактериальные изоляты SGI-003_Р11, SGI-020_A01, SG1-026_G06, SGI-026_G07, SGI-034_C09, SG1-034_K 1 0, SGI-041_B03 могут считаться родственными для видов Pantoea agglomerams, Bacillus thuringiensis, Burkholderia melallica, Burkholderia vietnamiensis, Bacillus pumilus, Herbaspirillum sp., Peclobacter sp., соответственно, на основании гомологии последовательностей >98% для каждой из 16 последовательностей рРНК с соответствующими микроорганизмами.

[00129] Изолированные бактерии были дополнительно изучены относительно свойств, важных для взаимодействия с растениями. Эти исследованные свойства включали фиксацию азота, секрецию сидерофора, солюбилизацию неорганического фосфора, синтез дезаминазы 1-амипопиклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК), синтез 2,3 бутандиола и синтез гормона роста растений ауксина. Результаты биохимических анализов в условиях in vitro показаны в табл. 2.

[00130] Фиксация азота:

[00131] Суспензию бактериальных клеток высевали штрихами на плотной питательной среде следующего состава, не содержавшего источников азота: КОН 4,0 г/л; K₂HPO₄, 0.5 г/л; MgS₄⋅7H₂O 0.2 г/л; NaCl 0,1 г/л; CaCl₂ 0,02 г/л; FeSO₄⋅7H₂O 0,005 г/л; NaMoO4⋅2H₂O 0.002 г/л: MnSO₄⋅7H₂O 0.01 г/л; яблочной кислоты 5,0 г/л; Геллановой камеди 0,1-1,0 г/л и, в некоторых случаях, 0,5% об./об. бромтимолового синего, pH 7,0. Концентрации гелларовой камеди и агара могли при необходимости варьировать для достижения желаемой плотности среды; обычно использовалась концентрация 0,5 г/л. Штриховые культуры инкубировали при температуре 30°C в течение 2-5 суток. Чашки с культурами ежедневно проверялись и отбирались колонии при их появлении. В некоторых вариантах, использовали продленные периоды роста (до двух недель или дольше), позволявшие выделять медленно растущие изоляты. Обычно из этих чашек с штриховыми культурами отбирали колонии с помощью наконечников для пипеток на 20 или 200 мкл с аэрозольными фильтрами в 96-луночныс планшеты для культуры клеток, наполненные средой 2YT по 150 мкл в лунке. В другом варианте, изоляты, отобранные из колоний на чашках, переносились непосредственно на не содержащую азот среду для подтверждения их способности расти без источника азота. Эти результаты, собранные в табл. 2, указывают, что только изолят SGT-026-G07 показал активность по связыванию азота на уровне доступном для обнаружения.

[00132] Выделения сидерофора:

[00133] Это количественное определение было использовано для идентификации бактериальных изолятов, которые синтезировали сидерофоры, которые являются высокоаффинными веществами, хелатирующими ионы Fe³⁺ в условиях in vitro. Как правило, микробные изоляты культивировали на минимальной среде практически не содержащей Fe. Вся стеклянная лабораторная посуда, использованная при этом анализе, для удаления остаточного Fe, которое могло изменить результаты, была тщательно вымыта кислотой и три раза ополаскивалась с помощью воды установки milliQ. Состав среды ММ9 был такой: K₂HPO₄ 0,5 г/л; NH₄Cl 1,0 г/л; MgSO₄⋅H₂O 0,2 г/л; NaCl 0,5 г/л; буферного раствора 7,55 г/л; глюкозы 10,0 г/л; глюконовой кислоты 2,5 г/л; яблочной кислоты 2,5 г/л; казаминовых кислот 0,5 г/л. pH среды было скорректировано до 7,0 с помощью 5N раствора КОН, и среду стерилизовали с использованием фильтра с порами 0,2 мкм (Corning).

[00134] Этот анализ обычно проводился в режиме высокой производительности с использованием станции для распределения жидкостей Beckman FX и 96-луночных планшетов для культуры клеток, наполненных ростовой средой ММ9 по 150 мкл в лупке. Культуры микроорганизмов и среду распределяли и переносили в асептических условиях с использованием автоклавируемых устройств отбора в условиях вытяжного ламинарного потока. После переноса культуры инкубировали при 30°C в течение 5 суток. После инкубации супернатанты культур отбирали при центрифугировании с использованием 96-луночного планшета для фильтрования с размерами пор 0,22 мкм. Десять микролитров отфильтрованных супернатантов перенесли в отдельные лунки планшета для анализа Falcon. Калибровочный график строился с использованием дезферриоксамина (DFO), разбавленного в среде MM9. Двести микролитров анализируемого раствора с CAS (10 мМ IJDTMA, раствор Fe(III): 1 мМ FeCl₃⋅6H₂O, 10 мМ HCl, 2 мМ CAS) добавили к каждой лунке с супернатантом и стандартом с последующим проведением инкубации при комнатной температуре в течение 20-30 минут. Оптическая плотность синего раствора для количественного определения, измеряемая при 630 нм (SpectroMax M2), являлась обратно пропорциональной концентрации сидерофора в каждой лунке (т.е. анализируемый раствор должен изменяться с повышение интенсивности оранжевого цвета при более высоком содержании сидерофоров).

[00135] Солюбилизация неорганического фосфора:

[00136] Свойства микробных изолятов к солюбилизации минеральных фосфатов в условиях in vitro оценивалась согласно следующему методу. Испытуемые бактерии высевали штрихом на агарированную фосфатную ростовую среду (гидроксиапатит - Ca₁₀(PO₄)₅(OH)₂ 5,0 г/л; NH₄Cl 1,0 г/л; MgSO₄⋅H₂O 0,2 г/л; NaCl 0,5 г/л; FeSO₄⋅7H₂O 0,01 г/л; Na₂Mo₄⋅7H₂O 0,01 г/л; MnSO₄⋅7H₂O 0,01 г/л; глюкозы 5,0 г/л; глюконовой кислоты 2,5 г/л; яблочной кислоты 2,5 г/л; казаминовых кислот 0,5 г/л; гелларовой камеди 20,0 г/л; pH 7,2) и их рост проверяли ежедневно. Культуральная среда была мутной из-за присутствия фосфата кальция. Бактериальный рост и потеря молочного цвета должны были наблюдаться, если бактерии обладали свойствами растворять фосфат кальция. Изоляты, обладающие свойствами солюбилизировать минеральную фазу фосфатов должны создавать прозрачное гало в мутной среде, окружающей колонию. Как представлено в табл.2, свойства солюбилизировать минеральные фосфаты не были обнаружены ни для одного из испытуемых микроорганизмов при определении методом in vitro, как описано в этом документе.

[00137] Синтез АЦК-дезаминазы::

[00138] Один из основных механизмов используемых ризобактериями-стимулирующими рост растений (МСРР) при ускорении роста и развития растений является снижение содержания этилена путем дезаминирования 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК), промежуточное вещество-предшественник этилена в растениях АЦК-дезаминаза катализирует гидролиз 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК) в α-кетобутират и аммиак. Присутствие вещества α-кетобутирата может быть определено непосредственно с помощью реакции с 2,4-динитрофенилгидразнном в HCl с образованием производного фенилгидразона. После добавления NaOH, количество фенилгидразона в растворе может быть определено спектрофотометрически, измерением его оптической плотности при 540 нм (Penrose and Cliek, Physiol Plant. May; 118:10-1, 2003). Этот анализ обычно проводился в режиме высокой производительности с использованием 96-луночных планшетов для культуры клеток. Каждая лунка содержала 150 мкл ростовой среды с солями DF с добавлением 2,0 г/л (NH₄)₂SO₄. Культуры микроорганизмов и среду распределяли и переносили в асептических условиях с использованием автоклавируемых устройств отбора в условиях вытяжного ламинарного потока. После переноса культуры инкубировали при 30°C в течение 2 суток. После помутнения культуры переносили второй раз, используя стерильное устройство отбора под вытяжным ламинарным потоком, в 96-луночные планшеты, содержащие 150 мкл в лунке ростовой среды с солями DF с добавлением 5 мМ АЦК в качестве единственного источника азота с последующей инкубацией в течение 4 суток при 30°C. Оптическую плотность (ОП) каждой культуры измеряли с использованием спектрофотометра при 600 им. Изоляты, которые продемонстрировали в таких условиях устойчивый рост (ОП>0,2) были отобраны для дополнительного анализа на активность АЦК-дезаминазы, как описано выше в публикации Penrose and Click, 2003.

[00139] Результаты испытаний, собранные в табл.2, показали, что следующие изоляты синтезировали значительные количества АЦК-дезаминазы: SGI-003-H11, SGI-026-G06, SGI-026-G07 и SGI-041-1303.

[00140] Синтез 2,3-бутандпола:

[00141] Свойства бактериальных изолятов синтезировать 2,3-бутандиол в условиях in vitro оценивали следующим методом с использованием капиллярной газовой хроматографии с масс-спектроскопией, описанной автором Ryu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 4927-4932, 2003). Этот анализ обычно проводился в режиме высокой производительности с использованием 96-луночных планшетов для культуры клеток с содержанием 150 мкл ростовой среды с солями DF в лунке. Устройство titer-tek также использовалось при приготовлении большого количества планшетов для первичного скрининга больших коллекций изолятов. Культуры микроорганизмов и среду распределяли и переносили в асептических условиях с использованием автоклавируемых устройств отбора под вытяжным ламинарным потоком воздуха. После переноса культуры инкубировали при 30°C в течение 5 суток. После инкубации супернатанты культур отбирали при центрифугировании с использованием 96-луночного планшета для фильтрования с размерами пор 0,22 мкм. Пятьдесят микролитров отфильтрованного супернатанта из каждой лунки переносили в соответствующие лунки 96-луночного планшета повышенного объема, содержащего 450 мкл 50% метанола в лунке с использованием микроканальной пипетки L200 и планшет запечатывали клейкой лентой для планшетов с последующим количественным определением 2,3-бутандиола, используя протокол описанный автором Ryu et al. (2003, см. выше). Результаты испытаний, собранные в табл.2, показали, что следующие изоляты синтезировали значительные количества 2,3-бутандиола: SGI-003-Н11, SGI-034-C09 и SGI-041-B03.

[00142] Синтез ауксина:

[00143] Ауксины - это гормоны, которые непосредственно влияют на рост растений. Этот анализ выполнялся для определения того, могут ли бактериальные изоляты синтезировать ауксины, поскольку известно, что бактериальные изоляты из ризосферы или эпифитные изоляты обладают биохимическими механизмами для синтеза ауксина - индолил-3-уксуспой кислоты (ИУК) и ее производных. Триптофан часто является предшественником для этого синтеза, поэтому это количественный анализ использовался для определения синтеза ИУК (ауксина) бактериальными изолятами, выращенными на среде с добавлением низкой концентрации аминокислоты триптофана.

[00144] Этот анализ обычно проводился в режиме высокой производительности с использованием 96-луночных планшетов для культуры клеток с содержанием 150 мкл ростовой среды YT в лунке. При приготовлении большого количества планшетов для первичного скрининга больших коллекций изолятов использовалось устройство titer-tek. Культуры микроорганизмов и среду распределяли и переносили в асептических условиях с использованием автоклавируемых устройств отбора под вытяжным ламинарным потоком воздуха. После переноса культуры инкубировали при 30°C в течение 5 суток. После инкубации супернатанты культур отбирали при центрифугировании с использованием 96-луночного планшета для фильтрования с размерами пор 0,22 мкм. Десять микролитров отфильтрованных супериатантов из каждой лунки перенесли в планшет для анализа Falcon. Двести микролитров анализируемого раствора Сальковского (Salkovvsky) (Gordon and Weber, Plant Physiol. 26: 192-195, 1951) добавили к каждой лунке с супернатантом и стандартный раствором с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 15-20 минут. Прохождение реакции определяли по оптической плотности планшета на приборе SpectroMax М2 при 535 им при изменении цвета анализируемого раствора Сальковского с желтого в фиолетовый/розовый, интенсивность которого была пропорциональной концентрации ауксина (ИУК) в каждой лунке. Результаты испытаний, собранные в табл. 2, показали, что следующие изоляты синтезировали значительные количества фитогормона ауксина: SG1-003-H11, SGI-020-A01, SGI-034-С09, SG1-034-C09 и SGI-041-B03.

[00145]

[00146]

ПРИМЕР 5: Биозащитная активность бактериальных изолятов против грибковых фитопатогенов.

[00147] Исследование антагонизма in vitro было использовано для оценки способности штаммов бактериальных изолятов подавлять развитие некоторых грибковых патогенов растении, включая Fusarium graminearum NRRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC-16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotrichum graminicola ATCC-34167 и патогены Penicillium sp. Анализ проведен на среде картофельного агара с декстрозой (PDA). Изолированные штаммы бактерий были выращены перед использованием на триптическом соевом бульоне с агаром в концентрации 1:5 (TSBA/5) в течение 24 часов.

[00148] Для каждого грибкового патогена был получен конидиальный инокулят отбором гиф активнорастущей колонии грибов и переносом нитей гиф на среду PDA с агаром. После инкубирования чашек в течение 7 суток при 25°C с использованием фотопериода 12 часов/сутки, грибные конидии смывали с чашек с PDA слабым фосфатным буферным раствором (0,004% фосфатный буферный раствор, pH 7,2, с 0,019% MgCl₂). После чего суспензию грибных конидий в слабом фосфатном буферном растворе (приблизительно 1×10⁵ конидий/мл) незамедлительно распыляли над поверхностью агара и чашки после распыления далее инкубировали при 25°C в течение 48-72 часов перед их использованием для исследований антагонизма.

[00149] В начале исследований антагонизма клетки изолированных бактериальных штаммов были точечно инокулированы на равных расстояниях внутри периметра чашки. Через пять суток бактериальные штаммы учитывались как обладающие антибиотической при появлении видимой прозрачной области (т.е., зоны ингибирования роста) по периметру микробных колоний, вокруг которых проявился недостаточный мицелиальный рост. Результаты исследований антагонизма, собранные в табл. 3, показали, что каждый из представленных в этом изобретении микроорганизмов ингибировал развитие нескольких грибковых фитопатогенов, включая Fusarium graminearum, Monographella nivalis, Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum graminicola, Penicillium sp.

[00150]

ПРИМЕР 6: Улучшение потенциала урожайности: пшеницы

[00151] Влияние бактериальной инокуляции на рост и урожайность растений изучали в теплице па изоляте SGT-020-A01. Суспензии микробных клеток готовили следующим, способом. Среду 2YT или подобную ростовую среду, бульонные среды инокулировали с маточных культур изолятов в глицерине или из чашек с штрих-культурами. Обычно перед использованием в ростовой камере, теплице или поле бактериальные культуры предварительно выращивали 48-72 часов для обеспечения достижения поздней экспоненциальной фазы. Изоляты с длительным периодом делений заблаговременно предварительно выращивали дополнительное время. Культуры инкубировали при 30°C на вращающейся мешалке при 200 об./мин. После роста клетки осаждали при 10000× g в течение 15 минут при 4°C и ресуспендировали в 10 мМ MgSO₄ буферном растворе (pH 7,0). Плотность клеточной суспензии каждого изолята нормализовали на основе показателя КОЕ/мл. Обычно для каждого изолята готовили суспензии ~10⁹ КОЕ/мл и транспортировали их на место проведения инокуляции на льду. Инокуляции выполняли путем разведения этих клеточных суспензий 1/20 в воде для полива до получения конечной плотности 5×10⁷ КОЕ/мл. Из 1 л для вегетационного опыта 20 мл этой разведенной клеточной суспензии равномерно распределяли по поверхности вегетационного горшка.

[00152] Испытание в теплице проводилось на дефицитной по питательным веществам полевой почве. После удаления больших камней и обломков полевая почва была тщательно перемешана до обеспечения ее гомогенности. После засыпки почва в каждом вегетационном горшке спрессовывалась на ~2 см для получения плотного посевного слоя. Зерна промышленного сорта пшеницы (яровая твердая красная пшеница; Howe Seeds Inc.) высевалась в горшки размером 1 литр, содержавшие полевой почвенный субстрат (пластиковые горшки с конусовидными диаметрами 10,5 см × 12.5 см). Для грамма зерен яровой пшеницы (приблизительно 70 зерен) равномерно распределяли в каждом горшке и 50 мл полевой почвы насыпали и равномерно выравнивали над слоем зерен. После однообразного появления колеоптилей пшеницы и последующего появления первых листов популяцию растений инокулировали 20 мл суспензии SG1-020-A01 с концентрацией 10⁹ КОЕ/мл. Растения из отрицательного контроля получали только 20 мл буферного раствора для инокуляции. Каждое из условий создавали в 8 отделениях для выращивания, каждое из которых содержало четыре горшка объемом 1 литр (n=4 на отделение). Отделения были в произвольном порядке распределены в четырех экспериментальных блоках. Затем зерна и растения выдерживали в теплице в течение 60 суток при температуре окружающей среды (в диапазоне температур от около 8°C до около 22°C) с ежесуточными световыми циклами приблизительно 11,5 часов солнечного света / 12 часов темноты в продолжение всего испытания. Растениям единообразно обеспечивали нижний полив для получения соответствующего уровня гидратации, зависящего от температуры и стадии роста. Через примерно через 30 суток после высевания, для приблизительно 70 растений в ямках были установлены опоры, и растения свободно связали для предотвращения контаминации и минимизации эффектов, связанных с положением, из-за вариаций попадания растений в разных горшках. По прошествии примерно 60 суток после высевания растениям давали высохнуть для подготовки к сбору урожая. Колосья пшеницы собирали приблизительно через 80 суток после высевания. Каждый колос пшеницы удаляли срезанием ниже колоса. Колосья пшеницы из каждого вегетационного горшка собирали, взвешивали и впоследствии использовали для оценки потенциала урожайности. Вес растения в популяции собирали в один и тот же день, и обработанные растения собирали в случайном порядке для исключения больших отличий во времени между сбором урожая и временем, обработок. В результате растения пшеницы, обработанные изолятом SGI-020-А01 показали 40% возрастание потенциала урожайности по сравнению с контрольными необработанными растениями (2,95 грамм/ямка против 2,10 грамм/ямка). Средине значения и стандартные отклонения документировали среди всех 8 повторностей с применением метода ANOVA (дисперсионный анализ). Эффективность микробного изолята SG1-020-A01 в повышении потенциала урожайности пшеницы была количественно определена путем анализа урожая колосьев пшеницы по их весу для каждого вегетационного горшка. P-значения <0,05 были статистически значимыми.

EXAMPLE 7: Повышение производства биомассы кукурузы

[00153] Влияние бактериальной инокуляции на рост и урожайность растений изучали в экспериментах в теплице с каждым из следующих бактериальных изолятов: SGI-034-C09, SGI-034-E10. SGI-003-H11, SGI-041-B03, SGI-026-G06 и SGI-026-G07. Исследования в теплицах проводились на недостаточной по питательным веществам полевой почве. После удаления больших камней и обломков полевая почва была тщательно переметана с почвой в горшках (70:30) до получения гомогенности. После засыпки почва в каждой вегетационном горшке спрессовывалась на ~2 см для получения плотного посевного слоя. Зерна промышленного сорта кукурузы (Dow AgroSciences) высевалась в горшки размером 1 литр (горшки с конусовидными диаметрами 10,5 см×12,5 см), каждый содержавший полевой почвенный субстрат. Два зерна кукурузы одинаково размещали в каждом горшке в положении эмбрионом вверх с последующей засыпкой 50 мл полевой почвы, которая равномерно распределялась над посевным слоем. После прорастания при необходимости срезали один сеянец в горшке для того, чтобы каждый горшок содержал только одно растение.

[00154) После однообразного появления колеоптилей кукурузы и последующего появления первых листов популяцию растений инокулировали ~20 мл микробных изолятов в концентрации 10⁹ КОЕ/мл, выбираемых из группы изолятов: SGI-034-C09, SGI-034-E10, SGI-003-H11, SGI-041-B03, SGI-026-G06 и SG1-026-G07. Суспензии микробных клеток готовили как описано выше в примере 6. Растения отрицательного контроля получали только 20 мл буфера для инокуляции.

[00155] Каждое из условий создавали в 8 отделениях для выращивания, каждое из которых содержало два горшка объемом 1 литр (n=2 на отделение). Отделения были в произвольном порядке распределены в четырех экспериментальных блоках. Затем зерна и растения выдерживали в теплице в течение 60 суток при температуре окружающей среды (в диапазоне температур от около 8°C до около 22°C) с ежесуточными световыми циклами приблизительно 11,5 часов солнечного света / 12 часов темноты в продолжение всего испытания. Растениям единообразно обеспечивали нижний полив для получения соответствующего уровня гидратации, зависящего от температуры и стадии роста. Биомассу растений кукурузы над уровнем земли собирали примерно через 60 суток после высевания.

[00156] Все растения в популяции собирали в один и тот же день, и обработанные растения собирали в случайном порядке для исключения больших отличий во времени между сбором урожая и временем обработок. Растения кукурузы анализировали на наличие отличий общей биомассы. Как задокументировано в табл.4, растения кукурузы, обработанные каждым из микробных изолятов, показали значительное возрастание обшей биомассы по сравнению с контрольными необработанными растениями. Средние значения и стандартные отклонения документировали среди всех 8 повторностей с применением метода ANOVA (дисперсионный анализ).

[00157]

EXAMPLE 8: Обработка семян покрытием для зерен пшеницы и кукурузы

[00158] Небольшие по масштабу эксперименты по обработке семян проводили согласно следующей процедуре, описанной в публикации Sudisha et al. (Phytoparasitica, 37:161-169, 2009), с незначительными модификациями. Как правило, маточный раствор биополимера получали добавлением 1 грамма порошка гуммиарабика (MP Biomedical) к 9 мл воды и перемешиванием до гомогенности. Мутные культуры активнорастущих микробных клеток или препаратов микробных спор смывали раствором фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и разбавляли до ОП600 ~5.0. Три мл разбавленной клеточной суспензии осаждали центрифугированием в пробирках Falcon на 50 мл. Полученный супернатант декантировали и заменяли 3 мл маточного раствора биополимера и полученную суспензию тщательно перемешивали. Обычно в пробирку Falcon добавляли приблизительно 25 г семян и интенсивно встряхивали или перемешивали до получения однородного распределения гуммиарабика клеточной суспензии. Покрытые зерна распределялись в пластмассовых чашках для взвешивания для высушивания под ламинарным потоком вытяжки до прекращения слипания, в большинстве случаев это занимало 3 часа с периодическим перемешиванием. После чего покрытые зерна хранили при 4°C и периодически проверяли на стабильность. Разные зерна пшеницы и кукурузы покрывали и испытывали описанным выше способом, включая распространенные разновидности твердой красной яровой пшеницы Briggs, Faller, Glenn, Hank, RB07, Samson; разновидности твердой красной озимой пшеницы Jerry, MeGill, Overland и разные зерна кукурузы DKC62-61, а также промышленный сорт кукурузы (Dow AeroSciences).

[00159] Тестирование жизнеспособности микроорганизмов в составах покрытия семян выполнялись с использованием стандартного метода учета колоний на чашках. Как правило, предварительно определенное количество покрытых семян исследовали на присутствие жизнеспособных микроорганизмов, промывая семена аликвотой подходящего буферного раствора и помещая на чашки эквивалентное количество буферного раствора на питательную агаризироваиную среду. Жизнеспособные колониеобразующие единицы подсчитывали через 1-4 суток инкубации при 30°C. Тестирование жизнеспособности показало, что после примерно пяти недель хранения при 4°C присутствовало в пределах 1×10⁴ и 4×10⁷ жизнеспособных колониеобразующих единиц па зерне. Когда семена покрывали микробными спорами, то жизнеспособность большинства исследованных микроорганизмов сохраняли стабильность по меньшей мере четыре месяца, включая многочисленные перевозки между штатами в Соединенных Штатах в и без охлаждаемых контейнеров. При хранении в холодильнике (4°C) микроорганизмы выживали в покрытии зерен с небольшой потерей жизнеспособности в течение периодов испытаний. Результаты испытаний показали, что семена, покрытые композициями, представленными в этом изобретении, могут храниться длительные периоды времени при охлаждении и предположили, что микроорганизмы должны выживать при дистрибуции в условиях высоких температур. Кроме того, исследовалась скорость прорастания покрытых семян, и она оказалась идентичной для скорости прорастания контрольных семян, которые представляли собой или только покрытые гуммиарабиком семена или непокрытые семена.

ПРИМЕР 9: Микробные композиции в составах в твердом состоянии

[00160] Этот раздел описывает примерные рецептуры микробных удобрений в соответствии с данным изобретением, являющиеся инкапсулированными удобрениями или удобрениями в твердой форме. Альгинатные гранулы готовили следующим образом:

[00161] Один миллилитр 30% глицерина добавляли к 1, 1,5 или 2% раствору альгината натрия в зависимости от свойств альгината (соотношение масса/плотность (M/G)) для получения результирующего объема 25 мл. Бактериальные клетки 250 мл культуры, полученной из одного бактериального изолята этого изобретения или из комбинации двух и более изолятов осаждали центрифугированием, после чего промывали солевым раствором (0.85% NaCl, мас./об.), ресуспендировали в 25 мл альгинатной смеси и тщательно перемешивали. Потом эта клеточная суспензия по каплям в охлажденный стерильный 1,5 или 2% (мас./об.) водный раствор CaCl₂ при умеренном перемешивании для получения альгинатных гранул с бактериями. Эти гранулам давали возможность затвердеть в течение 2-4 часов при комнатной температуре. Гранулы отбирали просеиванием через сита, несколько раз промывали стерильной водой и хранили при 4°C. Для хранения состава, свежие влажные гранулы замораживали при -80°C с последующей лиофилизацией при -45°C в течение 15 часов. Лиофилизированные сухие гранулы могли храниться в соответствующих контейнерах, таких как стерильные стеклянные бутылки.

[00162] Для оценки количества жизнеспособных единиц инкапсулированные бактерии высвобождали из гранул ресуспендированием 100 мг гранул в фосфатно-солевом буферном растворе (pH 7.0) в течение 30 минут с последующей гомогенизацией. Общее число высвобожденных бактерий определяли стандартным методом подсчета на чашках после инкубации при 30°C в течение 48 часов. Через интервалы в один месяц содержание клеток в гранулах подсчитывали, используя подобный метод.

ПРИМЕР 10: Сравнение композиции микроорганизмов с промышленными фунгицидами

[00163] Так как при использовании в сельском хозяйстве пестицидов возрастают экологические угрозы, возрастает очевидность неизбежности применения альтернативных биологических средств. Однако новые биологические составы должны обеспечивать выживание микроорганизмов и возможность проявлять их специфическое благоприятное влияние. Химические фунгициды обычно являются токсичными не только в отношении вредных, но также и полезных микроорганизмов. Тем не менее, возможность выживания таких микробных агентов следует повысить при их применении в пониженных дозировках.

[00164] В настоящем исследований, материал-носитель но основе торфа использовался для инокуляции обработанных фунгицидом и необработанных ничем семян. Сопротивляемость бактерий к действию фунгицида обычно оценивают следующим способом: а) инокулированные бактериями чистые семена помещают в подходящую среду для роста бактерий как трипказно-соевый агар (TSA; триптона 15 г/л; сойтона 5 г/л, натрия хлорида 5 г/л и агара 15 г/л) на чашки, b) обработанные фунгицидом и инокулированные бактериями семена помещают на чашки с обычным TSA, и с) обработанные фунгицидом и инокулированные бактериями семена помещают на стерильные ростовые подушки. Обычно в каждом эксперименте используют три концентрации фунгицида: рекомендованную производителем дозу и две меньшие дозы (75% и 50% от рекомендованной дозы). Обработанные фунгицидом и инокулированные бактериями семена после инокуляции сохраняют и используют через разные интервалы времени (2, 4 и 6 часов) для проверки влияния на прорастание семян. 11а чашка Петри проверяют и прорастание и присутствие бактерий. Для исследования па ростовых подушках, используют обработанные фунгицидом семена (рекомендованная доза) и через 7 суток роста ростков измеряют длины корня и гипокотиля.

[00165] Некоторые ризобактериальные изоляты этого изобретения при определении бактериального роста на чашках с TSA, обогащенных фунгицидом, сравнимы с эффективностью с некоторыми обычно используемыми фунгицидами. В общем, чистые и обработанные фунгицидом семена, покрытые инокулированным торфом, не показывают значимых отличий прорастания по сравнению с неинокулированным контролем. Более того, ростостимулирующие эффекты па длину корней и общую длину ростков наблюдали для всех обработанных ризобактериальными препаратами семян по сравнению с неинокулированным контролем.

ПРИМЕР 11: Развитие искусственно полученных сортов и программа сортового разведения

[00166] Эпифитные бактерии настоящего изобретения, применяемые для высокопродуктивных растений, включая зерновые, различных генотипов и географического происхождения, при недостатке таких эпифитных грибов, применяют для создания растение-эндофитных комбинаций с улучшенными агрономическими характеристиками, используя процедуры аналогичные известным в этой сфере техники, включая описанные среди прочих в заявках на патент США №20030195117 A1; №20010032343 A1 и патенте США №7,084,331. Поэтому синтетические растение-эндофитные комбинации могут быть созданы и отобраны в программах разработки сортов/разведения на основании их свойств формировать и поддерживать симбиотические комбинации, которые приводят к получению агрономической выгоды. В таких программах разведения значения также может использоваться оценка агрономических характеристик такой комбинации. Эти характеристики могут включать среди прочих, не ограничиваясь, устойчивость к засухе, накопление биомассы, устойчивость к заражению насекомыми, вкусовую привлекательность для животных (например, травоядных), облегчение репродукции и урожайности семян. Такие комбинации могут отличаться но уровню накопления микробных метаболитов токсичных к вредителям и сорнякам, включая содержание эргоалкалоидов, долина, перамина или лолитреа, в тоже время, демонстрируя желаемые агрономические характеристики для высокопродуктивных растений, включая, среди других свойств, устойчивость к объеданию или заражению насекомыми, устойчивость к абиотическим стрессам, вкусовую привлекательность для животных, накопление биомассы, облегчение репродукции и урожайности семян.

ПРИМЕР 12: Исследование влияния на урожайность

[00167] Зерна кукурузы (Zca mays) покрывали разными микробными препаратами и выращивали па подготовленном поле. Каждую обработку повторяли 5 раз при полностью случайной схеме проведения экспериментов. Единственный повтор, состоящий из четырех площадок длиной 30 футов (рядов), было пророщено 60 семян (на расстоянии 6 дюймов) в каждой площадке. С целью получения наблюдений данные собирали только из средних двух рядов.

[00168] Появление растений отмечали дважды, как показано ниже в табл. 5, как значение процента прорастания растений в повторностях. Десять растений в средних двух рядах каждого участка были отмечены пластиковой лептой для записи показателей статистики, таких как: высота растений, измерение содержания хлорофилла, вес растений и т.д.

[00169] Высоту растений (измеряли до вершины наивысшего/самого длинного листа) записывали на 31 и 56 дни после того, как насаждения показали, что высота растений значительно не отличалась между обработками. На 110 день большинство растений высохло и листья сморщились, поэтому в некоторых вариантах растения выглядели (получали значения измерений) короче, чем при предыдущих измерениях, но, в основном, высота растений не отличалась при проведении измерений. На 5-ю неделю выращивания измеряли содержание хлорофилла (в единицах SPAD) в нижних листьях (прим. на 60 см выше уровня земли) и в верхних листьях (второй на верхушке полностью раскрытый лист) из десяти отмеченных растений каждого участка. Содержание хлорофилла между обработками значительно не отличалось. На 110-й и 111-й день выращивания собирали урожай растений. Десять отмеченных растений из каждого участка срезали па уровне почвы, и наземные части растений взвешивали (масса целого растения или WPtWt), кукурузные початки удаляли и измеряли длину кочерыжки (длина початка с зернами) (область початка заполнялась только пригодными для продажи зернами), потом зерна удаляли с кочерыжки и измерялась их масса по отношению к массе початка (KnlWt/початок).

[00170] Вскоре после завершения ручного сбора урожая 10 растений на участках вводился механический комбайн Gleaner® K2 (Allis-Chalmers Mfrg, Milwaukee, WI). Машина механически убирала оставшиеся растения из двух средних рядов каждого участка, удаляя зерна с кочерыжек, и проводила измерение влажности и массы зерна (10 початков + механически собранный урожай). Запланированный общий урожай при 15.5% содержании влаги (фунтов зерна кукурузы на акр) на основании массы зерна (фунтов) (включая зерно с кочерыжек при машинной уборке + собранные вручную кочерыжки) составил 10368,14 фунтов на акр или 185,15 бушелей на акр для изолята SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans). Что являлось наибольшим урожаем среди всех видов микроорганизмов для обработки и значительно отличалось от обработки изолятом Bacillus amyloliquefaciens SGI-015_F03. Другим изолятом для обработки, обеспечившим высокий прирост был Bacillus thuringiensis SGI-020_A01.

[00171] В заключение, все растения при разных видах обработки появлялись и росли в полевых условиях схожим образом при их обеспечении одинаковым количеством удобрений, обработкой перед всходами гербицидов (позже с ручным удалением сорняков в сезон) и еженедельном орошением при выращивании и в теплом сезоне, а также борьбой с вредителями, особенно, с кукурузной совкой. При всех равных условиях обработка изолятом SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans) обеспечило наибольший урожай но сравнению с контрольной обработкой без микроорганизмов. Таким образом, с изолятом 003_H11 получен урожай примерно на 17% выше чем в контрольной группе. Поэтому, в разных вариантах осуществления заявки на изобретение эффективное количество микроорганизмов любого из способов, описанных и этой заявке, приводит к получению, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 12,5% или, по меньшей мере, на 15% или на около 17% большему урожаю, чем в контрольной группе, который в некоторых вариантах осуществления изобретения определялся в фунтах растительного продукта (например, початков кукурузы) на акр или в бушелях растительного продукта па акр. Микроорганизмы, перечисленные в табл. 5 относятся к изолятам SG1-003-H11 (Pantoea agglomerans); SGI-015-1-03 (Bacillus amyloliquefaciens) и SG1-020-A01 (Bacillus thuringiensis).

[00172] Было описано несколько вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, должно быть понятно, что элементы осуществления, описанные в этой заявке могут быть скомбинированы для создания дополнительных вариантов осуществления и могут быть сделаны различные модификации без отступления от существа и объема настоящего изобретения. Относительно других альтернативных или эквивалентных осуществлений, они находятся в объеме настоящего изобретения как описано и в этой заявке и формуле изобретения.

[00173] Рубрикация этой заявки использована всецело для удобства пользователя и не ограничивает каким-либо способом объем настоящего изобретения или его осуществления.

[00174] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в эту заявку посредством ссылки в той степени, как если бы каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специфической и могла индивидуально указывать па необходимость включения посредством ссылки.