Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения ароматических микробных метаболитов в форме фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови

Изобретение относится к способам анализа биологических материалов, а именно сыворотки крови (СК). Предлагаемый способ может быть использован в клинической лабораторной диагностике для определения продуктов метаболизма бактерий в форме фенилкарбоновых кислот (ФКК): бензойной (БК), фенилпропановой (ФПК), фенилмолочной (ФМК), 4-гидроксибензойной (n-ГБК), 4-гидроксифенилуксусной (n-ГФУК), фенилпропеновой (коричной), 3-метокси-4-гидроксифенилуксусной (гомованилиновой, ГВК), 4-гидроксифенилпропановой (n-ГФПК) и 4-гидроксифенилмолочной (n-ГФМК) кислот в образцах СК здоровых доноров и пациентов.

Уровень техники

В настоящее время одним из самых распространенных способов извлечения ФКК при анализе СК является способ жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ). К числу известных способов анализа СК с использованием ЖЖЭ относится способ лабораторной диагностики сепсиса, который предусматривает оценку уровня содержания метаболитов, т.е. продуктов жизнедеятельности живых микроорганизмов в сыворотке крови, а именно низкомолекулярных химических соединений - ФКК (RU 2423704).

Способ включает количественное определение n-ГФМК, ФМК, n-ГФУК и ГВК кислот в образцах СК с помощью хроматомасс-спектрального анализа (ГХ/МС) после пробоподготовки путем ЖЖЭ. Однако использование указанного способа пробоподготовки предусматривает использование большого объема органических растворителей, что требует специально оборудованного помещения, а также значительных временных затрат, связанных с необходимостью двукратной экстракции и упаривания органического элюата. Известный способ не может быть автоматизирован из-за необходимости использования центрифуги.

Наиболее близким к заявляемому по совокупности существенных признаков является способ определения n-ГФМК, 4-гидроксифенилпировиноградной кислоты и тирозина в плазме крови здоровых людей методом изотопного разбавления с детектированием ГХ/МС, представленный в работе J.C. Deutsch (Deutsh J.C. Determination of p-hydroxyphenylpyruvate, p-hydroxyphenyllactate and tyrosine in normal human plasma by gas chromatography-mass spectrometry isotope-dilution assay. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 1-6). Выбран в качестве прототипа.

При использовании способа-прототипа для извлечения указанных соединений из плазмы крови применяли сорбционное концентрирование на патронах с анионообменным сорбентом (50 мг). При этом необходимый объем анализируемой плазмы крови составляет 500 мкл. Элюирование проводили растворами уксусной и соляной кислот, а в качестве дериватизирующего (силилирующего) агента использовали N-метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамид. Известная методика позволяет проводить определение указанных соединений на уровне 10-200 нг/мл и используется при диагностике заболеваний печени и нарушений метаболизма тирозина.

К числу причин, по которым при использовании способа-прототипа не могут быть достигнуты технические результаты заявляемого способа, относятся следующие.

- Использование плазмы крови вместо сыворотки может привести к потере целевых компонентов.

- Необходимость использования для анализа значительного количества (500 мкл) плазмы.

- Использование патронов с сорбентом массой порядка десятков мг уменьшает степень концентрирования и приводит к увеличению объемов органических элюентов, что, в свою очередь, приводит к увеличению продолжительности пробоподготовки из-за необходимости упаривания элюата перед дериватизацией.

- Автоматизация известного способа более трудоемкая, чем заявляемого.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи определения продуктов метаболизма бактерий в форме ФКК в СК.

Заявляемый способ является экспрессным, полуавтоматическим, чувствительным, воспроизводимым; для его выполнения нужны малые объемы пробы сыворотки (80 мкл) и органических растворителей.

Использование микросорбционного концентрирования (МСК) в шприце, при котором сорбцию проводят многократно через патрон с сорбентом, позволяет увеличить степень концентрирования, а также уменьшить объем органических элюентов и продолжительность пробоподготовки.

Указанные технические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что так же как в известном способе определение ФКК осуществляют путем сорбционного концентрирования образца крови с последующим силилированием и анализом полученных производных методом ГХ/МС.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что извлечение ФКК из подкисленного раствора СК осуществляют путем МСК в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, их элюирования диэтиловым эфиром, упаривания элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и анализа полученных триметилсилильных производных на газовом хроматомасс-спектрометре.

Раскрытие сущности изобретения

Метаболомные исследования с использованием СК являются важным и актуальным направлением, поскольку СК представляет собой сложный набор высоко- и низкомолекулярных компонентов в разных концентрациях, отражающих состояние организма. Для работы с такой сложной матрицей необходимо использование высокотехнологичных методов разделения, концентрирования и детектирования с целью определения содержания определенного набора химических или биологических соединений. Решение указанной проблемы заключается в расширении арсенала аналитических средств.

Для извлечения ряда низкомолекулярных ароматических метаболитов из СК авторами выбран наиболее перспективный полуавтоматический метод пробоподготовки, включающей в себя МСК в шприце, заполненном сорбентом.

Способ заключается в проведении МСК в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, для извлечения 9 ФКК из подкисленного раствора СК, их элюировании диэтиловым эфиром, упаривании элюата досуха, дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) и анализом полученных триметилсилильных производных (ТМС) на газовом хроматомасс-спектрометре.

Далее получают хроматограммы, из которых строят масс-хроматограммы по характеристичным значениям m/z, определяют площади пиков ТМС производных ФКК по их временам удерживания, делят на площадь стандарта 2,3,4,5,6-D5-бензойной кислоты (D5-БK), которую вводят в сыворотку до проведения процедуры пробоподготовки. Полученные относительные сигналы используют для количественного определения ФКК с использованием градуировочных коэффициентов, полученных предварительно по методу добавок ФКК в известных концентрациях в сыворотку здорового добровольца. Продолжительность пробоподготовки составляет 21 мин, продолжительность ГХ/МС анализа - 25 мин. Степени извлечения ароматических кислот из сыворотки здорового добровольца с добавками кислот составили: БК - 50±10%; ФПК - 70±10%; Коричной - 40±10%; ФМК - 60±10%; n-ГБК - 30±5%; n-ГФУК - 40±10%; n-ГФПК - 50±10%; ГВК - 60±10%; n-ГФМК - 40±5%. Для всех ФКК выявлены области линейной зависимости в диапазоне 90-2200 мкг/л, что для большинства ФКК составляет 0.5-18 мкМ.

Применение разработанной методики позволяет сократить продолжительность и соответственно повысить производительность процедуры анализа. Кроме того, использование заявляемого способа в лабораторной практике позволяет снизить объем анализируемого образца крови, а также объем органических растворителей, применяемых на стадии пробоподготовки.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала МСК к 75 мкл размороженной до комнатной температуры СК добавляют водный раствор внутреннего стандарта D₅-БК, подкисляют до pH<2 и разбавляют водой в 2 раза. Патрон с сорбентом (силикагель с привитой фазой С18) предварительно кондиционируют метанолом, водой, 0.1-1% раствором муравьиной кислоты (3×50 мкл, скорость загрузки для каждого растворителя 100-1000 мкл/мин). Затем проводят сорбцию целевых компонентов (10-25 раз по 50 мкл, 100-1000 мкл/мин), высушивание сорбента путем пропускания воздуха (5-20 раз по 50 мкл, 100-1000 мкл/мин), промывание сорбента 0.05-0.1% водным раствором кислоты (2-5 раз по 20 мкл, 100-1000 мкл/мин), десорбцию подходящим органическим растворителем, например диэтиловым или метил-трет-бутиловым эфиром. Полученный элюат высушивают досуха, дериватизируют с добавлением силилирующего реагента, например БСТФА, аликвоту полученного раствора (или разбавленного инертным растворителем) силильных производных анализируют методом ГХ/МС.

Анализ методом ГХ/МС проводят с использованием кварцевой капиллярной колонки типа TR-5ms (95% диметилполисилоксан + 5% фенилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 0.25 мкм, длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм). Условия газохроматографического разделения: температура инжектора 200°C, расход газа-носителя 1.5 мл/мин. Режим программирования температуры термостата колонок: начальная температура 80°C в течение 4 мин; далее нагревание со скоростью 10°C/мин до 250°C, выдержка при этой температуре в течение 4 мин. Условия масс-спектрометрического анализа: электронная ионизация, энергия электронов 70 эВ, температура интерфейса 250°C, температура ионизационной камеры 200°C, диапазон сканирования m/z 50-450 а.е.м., скорость сканирования 3 скана/с.

Площади пиков силильных производных ФКК, зарегистрированные на масс-хроматограммах по фрагментным характеристичным ионам, деленные на площадь пика производного стандарта D5-BK (представлены в табл.1), используют в количественном анализе. Значения m/z характеристичных ионов выбраны исходя из информативности (отражения структуры вещества) и их отсутствия в фоновом масс-спектре. Масс-спектры исследуемых компонентов совпадают с соответствующими масс-спектрами из библиотеки NIST. Степень извлечения ароматических кислот рассчитывают путем деления относительного сигнала каждой кислоты после проведения МСК из СК здорового добровольца с добавкой ароматических кислот на относительный сигнал соответствующей кислоты из модельного раствора без пробоподготовки. Статистическую обработку данных проводят по результатам трех параллельных опытов с применением программы Microsoft Excel 2010.

Примеры выполнения

Проведен анализ образцов СК здорового донора и четырех реанимационных больных разной степени тяжести с наличием инфекции бактериальной этиологии или сепсисом. Приведено сравнение полученных результатов с аттестованной методикой, включающей в себя ЖЖЭ и дающей достоверные данные о концентрациях ФКК в образцах СК. Таким образом, подтверждено, что результаты, получаемые методом МСК, сопоставимы с результатами, получаемыми методом ЖЖЭ, и могут быть использованы в практике.