Результат интеллектуальной деятельности: Биопрепарат для очистки сточных вод от масложировых загрязнений

Изобретение относится к биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки сточных вод от масложировых загрязнений.

В результате деятельности пищевых предприятий и повышения нагрузки на водоотводящие и очистные сооружения для промышленных и хозяйственно-бытовых стоков стало особенно актуальным решение проблемы очистки сточных вод от масложировых загрязнений. Так, доля производственных сточных вод в общем объеме стоков мясоперерабатывающего предприятия составляет 70-75%. Из них около 50% стоков содержат масложировые загрязнения (Belousova, N.I., Manuilova, T.D. Sposoby I. Sredstva ochistki zhirosoderzhashchikh stochnykh vod // Myasnaya industriya. 2007. №7, p. 57-60). Серьезной проблемой является удаление отложения жиров в канализационных системах пищевых предприятий, и их утилизация в жироуловителях. Для решения этой проблемы в последнее время все чаще используют методы биоремедиации, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов масложировых отходов.

Известен биопрепарат на основе штамма бактерий Aspergillus niger (штамм 288), предназначенный для очистки сточных вод пищевой промышленности. Обработку сточных вод, содержащих масложировые загрязнения, осуществляют биопрепаратом на основе штамма бактерий Aspergillus niger 288 при рН 4.5-5.0 и температуре 28-30°С в течение 48-50 ч (патент RU 2016851 С1, опубл. 30.07.1994).

Недостатком данного биопрепарата является узкий спектр действия, предусматривающий возможность его использования только при рН 4.5-5.0 и температуре 28-30°С. Кроме этого, не представлены сведения о безопасности культуры Aspergillus niger, что необходимо, так как микроорганизмы рода Aspergillus относятся к 4 группе патогенности, при этом патогенный агент вызывает обычно серьезное заболевание у человека или животных и легко распространяется от больного к здоровому или опосредованно.

Известен биопрепарат для очистки сточных вод от жиров на основе штамма бактерий Serratia marcescens ИБ 2-2, проявляющего активность по деструкции твердых жиров животного и растительного происхождения. Для культивирования штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 с целью получения липазы применяют питательную среду следующего состава, г/л: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; K₂НРO₄ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,0. Время выращивания 40 ч. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0⋅10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) /мл, а деструкция кулинарного жира - 100% (патент RU 2310686 С1, опубл. 20.11.2007).

Недостатком данного биопрепарата является узкий спектр действия, предусматривающий возможность его использования только для биодеструкции жиров при рН 7.0 и температуре 28°С.

Наиболее близким к предлагаемому биопрепарату - прототипом, является биопрепарат на основе комплекса бактериальных штаммов Acinetobacter species М-2, Acinetobacter species М-3, Arthrobacter species M-4, Rhodococcus species M-5 с содержанием живых клеток бактерий-декструкторов масел и жиров 10⁸-10¹¹ кл/г сухого препарата. Выращивание штаммов бактерий проводят в аппарате интенсивного массообмена в периодическом и в непрерывном режиме (D=0,2 ч^-1) на минеральной среде (NH₄H₂PO₄ - 10 г/л, K₂НРO₄ - 10 г/л, MgSO₄⋅7H₂O - 0,7 г/л, ZnSO₄⋅7H₂O, FeSO₄⋅7H₂O, MnSO₄⋅7H₂O - по 12,5 мг/л) при рН 7.0, температуре 30°С, в течение 24 ч. После процесса выращивания полученную бактериальную суспензию сепарируют, а затем сгущенную биомассу высушивают на распылительной сушильной установке. Очистку загрязненных стоков от пищевых масел и жиров осуществляют путем засева бактериальной биомассы штаммов Acinetobacter species М-2, Acinetobacter species М-3, Arthrobacter species M-4, Rhodococcus species М-5 с добавлением в стоки минеральных компонентов. Процесс ферментации ведут при рН 7.0 и температурах 15, 30, 45, 50°С до полной деструкции масел и жиров в стоке (патент RU 2161595 С2, опубл. 10.01.2001).

Недостатками данного биопрепарата является узкий спектр действия, предусматривающий возможность его использования только при рН 7.0, а также недостаточная эффективность в отношении биодеструкции жиров животного происхождения, вследствие чего необходимо дополнительно добавлять в стоки «жидкое мыло» либо подвергать жиры обработке ультразвуком.

Задачей изобретения является разработка более эффективного биопрепарата для очистки сточных вод, загрязненных пищевыми маслами и жирами, обладающего липолитической активностью в широком диапазоне значений рН и температур среды, а также в присутствии хлорида натрия.

Технический результат: повышение эффективности и расширение спектра действия биопрепарата.

Поставленная задача достигается предлагаемым биопрепаратом, содержащим комплекс штаммов бактерий Pseudomonas koreensis Са3 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD, взятых в соотношении 1:1 (по массе), с конечной концентрацией колониеобразующих единиц бактерий в сухом биопрепарате не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г.

Действующая основа биопрепарата (условное наименование «Липойл») - штаммы бактерий Pseudomonas koreensis Са3 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD, являются новыми.

Штамм бактерий Pseudomonas koreensis Са3 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИГенетика) под регистрационным номером В-12712, а штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia ZhD депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером В-12702. По показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности микроорганизмы Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 являются непатогенными для теплокровных животных. Согласно методическим рекомендациям «Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза», Москва, 1992 г., микроорганизмы Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 удовлетворяют требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам (Заключение НИЦ ТБП - филиал ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России»).

Характеристика используемых штаммов (компонентов биопрепарата).

Штамм бактерий Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 выделен из образцов жирозагрязненных отходов г. Новосибирска.

Культурально-морфологические признаки.

Прямые или слегка изогнутые, но не спиральные, палочки, размер бактерий 0,5 - 1,0×1,5 - 5,0 мкм. Грамотрицательные, подвижные за счет одного или нескольких полярных жгутиков. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, бежевые, непрозрачные. Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов; в некоторых случаях альтернативным акцептором электронов может служить нитрат, что обеспечивает анаэробный рост. Образует флуоресцирующий пигмент. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Нет потребности в факторах роста или специальных добавках. Способен к росту на средах с маргарином, подсолнечным, оливковым, горчичным, сливочным и льняным маслами, а также со свиным и рыбьим жирами в качестве источников углерода и энергии для роста. Способен к росту в присутствии хлорида натрия в концентрации до 5%. Штамм способен к росту в температурном диапазоне 10-42°С. Микроорганизм способен утилизировать пищевые масла и жиры в диапазоне рН среды 6-9.

Штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 выделен из образцов жирозагрязненных отходов г. Новосибирска.

Культурально-морфологические признаки.

Прямые мелкие палочки, размер бактерий 0,5 - 1,0 ×1,5 - 5,0 мкм. Грамотрицательные, подвижные за счет одного или нескольких полярных жгутиков. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 1-2 мм в диаметре, плоские, гладкие, края ровные, бежевые, непрозрачные. Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Нет потребности в факторах роста или специальных добавках. Способен к росту на средах с маргарином, подсолнечным, оливковым, горчичным, сливочным и льняным маслами, а также со свиным и рыбьим жирами в качестве источников углерода и энергии для роста. Способен к росту в присутствии 5% хлорида натрия. Штамм способен к росту в температурном диапазоне 10-42°С. Микроорганизм способен утилизировать пищевые масла и жиры в диапазоне рН среды 6-9.

Получение биопрепарата реализуется путем раздельного глубинного культивирования каждого из микроорганизмов Pseudomonas koreensis Са3 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD на питательной среде, содержащей кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, глюкозу, набор минеральных солей.

Выращенные бактериальные культуры Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 сепарируют на проточном сепараторе. Полученную концентрированную суспензию каждого микроорганизма по отдельности стерильно смешивают в соотношении 1:1,5 (по массе) с защитной средой на основе 0,05М натрий-калиевого фосфатного буфера, содержащего 20 г/л тиомочевины; 50 г/л сахароза; 0,5 мл/л твин 80; 40 г/л полиглюкина. Далее полученную смесь замораживают при температуре -40°С - -70°С в течение 24 ч и подвергают сублимационной сушке.

Полученные сухие лиофилизованные порошковые формы бактериальных культур Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 смешивают между собой в соотношении 1:1 (по массе) и получают препарат с конечной численностью бактерий не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г сухого биопрепарата.

Полученную сухую форму биопрепарата «Липойл» хранят в сухом темном месте при температуре 2-8°С в течение 6-12 месяцев.

Применение сухого лиофилизированного биопрепарата реализуют путем внесения в промышленные стоки суспензии микроорганизмов, полученной путем его растворения в воде в соотношении 1:1000 (по массе).

Определяющими существенными отличиями биопрепарата, по сравнению с прототипом, являются:

1) в качестве микроорганизмов-деструкторов пищевых масел и жиров используют комплекс штаммов бактерий Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702, взятых в соотношении 1:1 (по массе), с конечной численностью бактерий в сухом биопрепарате не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г, что позволяет повысить эффективность биопрепарата и расширить спектр его действия.

2) в состав биопрепарата «Липойл» входят непатогенные и нетоксичные микроорганизмы, способные утилизировать пищевые масла и жиры в широком диапазоне рН (6-9) и температур среды (10-42°С), а также в присутствии соли (хлорида натрия до 5%).

Предлагаемый биопрепарат способен эффективно очищать сточные воды, загрязненные маслами и жирами, а также удалять отложения жиров в канализационных системах предприятий и утилизировать жиры в жироуловителях.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биопрепарата «Липойл»

Для получения биомассы бактерий Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 проводили глубинное культивирование каждого из микроорганизмов раздельно на питательной среде, содержащей кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, глюкозу, набор минеральных солей.

Культивирование бактерий Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 поводили в ферментерах объемом 250 л, с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментеры оснащены фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, рН, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию. В ферментер вносили 3 л посевного материала (инокулята) в виде микробной суспензии с численностью не менее 1×10¹⁰ КОЕ/мл на 150 л питательной среды, содержащей: кислотный гидролизат казеина - 8 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; глюкоза - 20 г/л; сульфат магния - 0,3 г/л; сульфат марганца - 0,1 г/л; гидрофосфат калия - 2 г/л; сульфат аммония - 5 г/л; пеногаситель - 0,5 мл/л. Конечный объем доводили водопроводной водой до 150 л.

В течение культивирования бактерий показатель рН поддерживали автоматически на уровне 7,0-7,2 путем подачи 15% раствора гидроксида аммония, при непрерывном перемешивании. Технологические параметры процесса культивирования микроорганизмов: температура 28°С; расход воздуха на аэрацию - от 0 до 4 ч - 30 л/мин, от 4 до 20 ч - 60 л/мин; скорость перемешивания - 350 об/мин. Продолжительность культивирования 20 ч.

Выращенные бактериальные культуры Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 сепарировали на проточном сепараторе при скорости вращения ротора 16000 об/мин. Скорость сепарирования подбирали такой, чтобы проба фильтрата на выходе из сепаратора была визуально прозрачной. Скорость подачи культуральной жидкости на сепаратор поддерживали в интервале 30-40 л/ч. Полученную концентрированную суспензию каждого микроорганизма по отдельности стерильно смешивали в соотношении 1:1,5 с защитной средой на основе 0,05 М натрий-калиевого фосфатного буфера, содержащей 20 г/л тиомочевины; 50 г/л сахароза; 0,5 мл/л твин 80; 40 г/л полиглюкина. Далее полученную смесь замораживали при температуре -40°С - -70°С в течение 24 ч. В дальнейшем замороженную биомассу подвергали сублимационной сушке с целью получения лиофильно высушенной биомассы каждого из штаммов, входящих в состав биопрепарата «Липойл».

Полученные сухие формы бактериальных культур Pseudomonas koreensis Са3 В-12712 и Stenotrophomonas maltophilia ZhD В-12702 в виде порошка смешивали между собой в соотношении 1:1 (по массе) так, чтобы конечная численность бактерий составила не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г сухого биопрепарата.

Пример 2. Оценка эффективности деградации растительных и животных жиров биопрепаратом «Липойл» в лабораторных условиях

Эксперимент проведен в 100 мл жидкой минеральной среде Эванса (Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. 1970. The continuous cultivation of microorganisms. Construction of a Chemostat // Methods in Microbiology. Vol. 2. Pp. 277-327) с добавлением смеси пищевых масел и жиров в количестве 2% (об./об. или масс./об.) и с добавлением биопрепарата «Липойл» в количестве 10 мл с концентрацией 1×10⁷ КОЕ/мл, в течение 10 сут, при температуре 24°С. Смесь пищевых масел и жиров состояла из оливкового, льняного, подсолнечного, горчичного, миндального, соевого, кокосового и сливочного масел, а также рыбьего и свиного жира. Указанные масла и жиры были смешаны в равных пропорциях. Количественный химический анализ проводился по ПНД Ф 14.1:2.122-97 «Методика измерений массовой концентрации жиров в поверхностных и сточных водах гравиметрическим методом» (Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовой концентрации жиров в поверхностных и сточных водах гравиметрическим методом. ПНД Ф 14.1:2.122-97. МОСКВА 1997 г. (издание 2011 г.) B.C. Талисманов. С. 14). В течение эксперимента проводилась количественная оценка численности микроорганизмов, входящих в состав ассоциации, путем проведения серийных разведений отобранной суспензии бактерий и последующим высевом на агаризованную среду ЛБ. Эффективность утилизации смеси пищевых масел и жиров составила 95% в течение 10 сут при температуре 24°С.

На фиг. 1 представлена кривая роста численности микроорганизмов, входящих в состав микробной ассоциации, в течение 10 сут. На фиг. 1 видно, что общая численность бактерий данного комплекса (ассоциации) увеличилась почти на 3 порядка.

Пример 3. Оценка эффективности деградации растительных и животных жиров биопрепаратом «Липойл» в промышленных условиях

Проводили очистку канализационной системы предприятия общественного питания от масложировых загрязнений посредством внесения 15 л суспензии биопрепарата «Липойл» в течение 1 месяца. В течение месяца ежедневно вносилось 500 мл суспензии микроорганизмов с численностью 10⁷ КОЕ/мл. Оценка эффективности применения биопрепарата «Липойл» проводилась путем визуального осмотра сливной системы и выявлением запаха. По истечении месяца было выявлено отсутствие характерного канализационного запаха и засора сифона сливной системы канализации.

Таким образом, при использовании заявляемого биопрепарата для очистки масложировых загрязнений сточных вод наблюдалось разжижение масложировых отходов и отсутствие образования пробок из масложировых отходов в канализационной системе, что свидетельствует об эффективности биопрепарата и подтверждается данными прироста численности бактерий микробной ассоциации (увеличение на 3 порядка).

Предлагаемый биопрепарат позволит эффективно очищать сточные воды, загрязненные пищевыми маслами и жирами, а также удалять отложения жиров в канализационных системах предприятий и утилизировать жиры в жироуловителях.