Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПЕРЕРАБОТКИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ГЕНТАМИЦИНА СУЛЬФАТА

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам биологической переработки органических отходов, и может быть использовано для утилизации мицелиальных отходов производства аминогликозидных антибиотиков и производства органических удобрений.

Аналогами изобретения являются способы биологической переработки органических отходов производства антибиотиков [1-3].

Известен способ, где обработку мицелиальных отходов с 5-25% органической добавки осуществляют с помощью навозного червя Eisenia foetida [1]. Данный способ утилизации мицелиальных отходов производства антибиотиков заключается в том, что во весь объем смеси мицелиальных отходов с 5-25% органической добавки запускают червя Eisenia foetida (из расчета 50-200 шт. на 1 кг смеси), по истечении 20-30 сут черви мигрируют в верхний слой толщиной до 10 см, который может быть удален и использован для повторного засева следующей партии мицелиальных отходов.

В качестве органической добавки могут быть использованы коровий или свиной навоз, смесь навоза и соломы, опилки, бытовые отходы, листва деревьев и др. Введение в мицелиальные отходы органической добавки обусловлено наличием в отходах остаточного содержания антибиотика, негативно влияющего на популяцию навозных червей.

При использовании меньшего количества органической добавки (менее 5%) в мицелиальных отходах часть навозных червей погибает (и не утилизирует весь антибиотик).

Отходы мицелия, утилизированные червями, не содержат антибиотика. Такие отходы могут быть использованы в качестве удобрения в сельском хозяйстве или направлены на депонирование без ущерба для окружающей среды.

К недостаткам данного способа необходимо отнести предварительное внесение в мицелиальные отходы органической добавки в виде коровьего или свиного навоза, соломы, опилок, бытовых отходов, листвы деревьев и т.д., которые в соответствии с Федеральным классификационным каталогом отходов [4] сами являются отходами и отнесены к 4 и 5 классам опасности. Использование данных органических добавок на территории предприятия, выпускающего лекарственные препараты, будет нарушать санитарно-эпидемиологический режим его работы и противоречить Правилам надлежащей производственной практики (GMP) [5]. Кроме того, при реализации данного способа будет затруднена механизация процесса утилизации отходов по причине использования макроорганизмов - навозных червей.

В европейском патенте ЕР N 0060407 [2] описан способ переработки мицелиальных масс с удалением остаточного антибиотика путем обработки микроорганизмами. В данном способе масса сырого мицелия-пенициллиума, содержащая остаточный пенициллин, подвергается сбраживанию (ферментации) молочной кислотой при использовании устойчивых к пенициллину лактобацилл. В качестве органической добавки в мицелиальные массы используют сельскохозяйственный силос или солому зерновых культур.

Основным недостатком данного способа является внесение в мицелиальные отходы дополнительных органических компонентов, которые в своем составе могут содержать помимо лактобацилл постороннюю микрофлору, негативно влияющую на процесс анаэробной ферментации влажного мицелия. Кроме того, ввоз силоса на территорию предприятия, производящего лекарственные препараты, ведет к нарушению санитарно-эпидемиологического режима.

Наиболее близким к заявляемому является известный способ утилизации мицелиальных отходов производства антибиотиков путем компостирования с использованием замкнутого цикла, где в качестве биологически активной добавки и сорбента избыточной влаги используют компост, образующийся в результате утилизации мицелиальных отходов с носителем компостных микроорганизмов.

В данном изобретении предлагается в качестве биологически активной добавки и сорбента влаги использовать компост, полученный в результате их переработки. Таким образом, исчезает необходимость в использовании на фармацевтическом предприятии большого количества веществ с высокой контаминацией, например навоза и опилок. Кроме того, уменьшается объем перерабатываемой компостной смеси, что особенно важно при промышленном производстве.

Первичный компост, используемый в качестве биологически активной добавки и сорбента влаги, готовят на основе мицелиальных отходов с добавлением носителя компостных микроорганизмов, например навоза, и сорбирующего избыточную влагу материала: торфа, опилок или соломы.

При этом компост в перерабатываемые мицелиальные отходы вводят для поддержания в них влажности не выше 75%. Смесь тщательно перемешивают и переработку отходов до компоста ведут при температуре окружающего воздуха (20-30)°C.

По мере накопления компоста часть его отделяется, и компостирование осуществляется до отсутствия антибиотика в полученном продукте переработки, то есть добавку компоста в мицелиальные отходы или отходов в компост ведут до полного удаления антибиотика из компостируемой смеси. Компостирование осуществляется в течение 3 мес. После окончания процесса продукт вывозят, например, на поля, где используют в качестве органического удобрения. Оставшаяся часть компоста используется для утилизации следующих партий мицелиальных отходов.

К недостаткам данного способа необходимо отнести использование в качестве первичного носителя компостных микроорганизмов навоза и необходимость введения в компостированную смесь сорбентов (торфа, опилок, соломы). Кроме того, неопределенный состав «компостных микроорганизмов» не исключает наличие в навозе патогенной микрофлоры, что в совокупности с длительными пересевами на органический субстрат, содержащий остаточное количество антибиотика, может привести к появлению антибиотикоустойчивых форм патогенной микрофлоры и ее дальнейшему распространению в окружающей среде.

Недостатком данного способа также является значительная продолжительность процесса компостирования - 3 мес.

Общими существенными признаками с заявляемым способом утилизации мицелиальных отходов является использование процесса компостирования мицелия под действием живых микроорганизмов до полного отсутствия антибиотика при влажности мицелиальных отходов не более 75%.

Цель изобретения - разработка ускоренной экологически безопасной технологии утилизации мицелиальных отходов производства гентамицина сульфата методом компостирования с использованием комбинированного экобиопрепарата, содержащего в своем составе культуры Cladosporium resinae 173 и Bacillus subtilis 3/105.

Сущность изобретения заключается в биологической переработке мицелиальных отходов производства гентамицина сульфата, обеспечивающей полную биодеструкцию остаточного антибиотика и органической составляющей мицелия, путем предварительного отжима мицелиальных отходов на сепараторе до влажности не более 75%, термоинактивации отходов при температуре 120°C в течение 30 мин, последующего раздельного внесения в мицелиальные отходы культуры С. resinae 173 в посевной дозе не менее 7⋅10⁶ КОЕ⋅г^-1, через 14 сут, после полного разложения гентамицина, культуры В. subtilis 3/105 в посевной дозе не менее 50⋅10⁶ КОЕ⋅г^-1 и последующего компостирования мицелия в течение 14 сут. Готовый компост через 28 сут подлежит термоинактивации в автоклаве при температуре 130°C в течение 90 мин.

Осуществление предлагаемого способа возможно благодаря тому, что машинный отжим мицелиальных отходов на прессошнековом сепараторе типа FAN PSS 3,2-520 обеспечивает получение отходов с остаточной влажностью не более 75% [6]. После сепарирования отходы обладают рассыпчатой структурой, что позволяет при проведении компостирования создавать бурты высотой до 1 м, обеспечивая тем самым необходимые условия (обеспечение кислородом и водой) для роста и развития в мицелии микроорганизмов-деструкторов.

Термоинактивация мицелиальных отходов при температуре 120°C в течение 30 мин позволяет получать стерильные отходы, не содержащие культуру Micromonospora purpurea var. violacea производственного штамма 7R продуцента антибиотика гентамицина и постороннюю микрофлору, что предотвращает ингибирование роста выбранных микроорганизмов-деструкторов при дальнейшем компостировании. Кроме того, проведение термоинактивации мицелиальных отходов препятствует развитию гнилостной микрофлоры и появлению неприятного запаха при осуществлении процесса компостирования.

Используемые для компостирования микробные культуры С. resinae 173 и В. subtilis 3/105 получают путем раздельного глубинного выращивания в биологических реакторах с использованием стерильных питательных сред. Культивирование данных микроорганизмов ведут при непрерывном механическом перемешивании и аэрации.

К окончанию цикла выращивания культуральные жидкости микроорганизмов-деструкторов содержат не менее 0,2⋅10⁹ КОЕ⋅см^-3 С. resinae 173 и не менее 1⋅10⁹ КОЕ⋅см^-13 В. subtilis 3/105.

Полученные культуральные жидкости подвергают концентрированию и лиофильному обезвоживанию. Готовый комбинированный экобиопрепарат состоит из двух биокомпонентов - сухих биомасс С. resinae 173 и В. subtilis 3/105 с биологическими концентрациями не менее 0,85⋅10⁹ КОЕ⋅г^-1 и 80⋅10⁹ КОЕ⋅г^-1 соответственно.

Оптимальные количества вносимых в мицелиальные отходы сухих биомасс С. resinae 173 и В. subtilis 3/105 определили экспериментально исходя из необходимости достижения посевных концентраций микроорганизмов-деструкторов, обеспечивающих утилизацию мицелиальных отходов в течение 28 сут.

Входящая в состав комбинированного экобиопрепарата культура С. resinae 173, вносимая в мицелиальные отходы на первом этапе, обеспечивает полную утилизацию гентамицина на 14 сут компостирования (таблица 1). При внесении в перерабатываемый отход культуры В. subtilis 3/105 и продолжении компостирования в течение последующих 14 сут происходит биодеструкция органической составляющей мицелия (таблица 2).

Микроорганизмы С. resinae 173 и В. subtilis 3/105, входящие в состав комбинированного экобиопрепарата, не обладают антагонизмом по отношению друг к другу и могут развиваться в компосте одновременно.

Утилизация гентамицина культурой С. resinae 173 происходит за счет ферментативной активности данного микромицета, являющегося природным ксенобиотиком [9-11]. Грибы рода Cladosporium синтезируют комплекс пектилитических и протеолитических ферментов, легко усваивают углерод из углеводородов, поэтому хорошо растут на керосине, креозоте, дизельных топливах и различных смазках, вызывая их разрушение [12-14].

Экспериментальное изучение ферментативных свойств культур В. subtilis выявило наличие у них высокой амилолитической и протеолитической активности [15, 16], способствующей ускорению процесса расщепления органической составляющей мицелиальных отходов (таблица 3).

Выбранный штамм микроорганизмов В. subtilis 3/105 является антагонистом для широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Salmonella, Shigella, энтеропатогенных Е. coli, Proteus, Stathyloccocus, Candida и др.) [17] и в процессе компостирования препятствует развитию посторонней микрофлоры в утилизируемом отходе, в том числе и гнилостной.

Заключительная термообработка в автоклаве готового компоста при температуре 130°C в течение 90 мин обеспечивает полную инактивацию компостной микрофлоры и тем самым препятствует появлению в окружающей среде антибиотико-резистентных видов микроорганизмов.

Предлагаемый способ утилизации мицелиальных отходов производства гентамицина сульфата отличается от аналогов тем, что:

1. Для достижения остаточной влажности не более 75% и с целью исключения внесения дополнительных сорбентов мицелиальные отходы подвергаются машинному отжиму на сепараторе.

2. Для исключения в процессе компостирования антагонизма между микроорганизмами, входящими в состав комбинированного экобиопрепарата, продуцентом антибиотика и посторонней микрофлорой мицелиальные отходы подвергают термоинактивации при температуре 120°C в течение 30 мин.

3. В качестве микроорганизмов-деструкторов используются чистые культуры С. resinae 173 и В. subtilis 3/105, обеспечивающие в процессе ускоренного компостирования мицелиальных отходов (28 сут) полную утилизацию антибиотика и биодеструкцию сложных органических веществ.

4. Заключительная термоинактивация компоста при температуре 130°C в течение 90 мин обеспечивает их полную стерилизацию, что исключает попадание микроорганизмов компостной микрофлоры с приобретенной антибиотико-резистентностью в окружающую среду.

Наличие отличительных признаков в заявляемом изобретении свидетельствует о соответствии его критерию «новизна».

В настоящей заявке выполняется требование единства изобретения, так как все признаки относятся к одному объекту - способам утилизации мицелиальных отходов.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень». Из приведенного выше описания уровня техники следует, что заявителем не выявлены источники информации, содержащие сведения об аналогах, имеющих признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 4.

Возможность осуществления заявленного изобретения и его эффективность при различных вариантах применения подтверждены экспериментально.

Примеры осуществления способа

Пример 1. Выращивание культуры С. resinae 173 проводили в ферментеpax вместимостью 700 дм³ с коэффициентом заполнения 0,7 на среде Бушнелла-Гасса с добавлением 3% глюкозы при температуре (29±1)°C с постоянной подачей воздуха на аэрацию (80±2) дм³ и частотой вращения мешалки 300 об⋅мин^-1 в течение (120±2) ч. Полученную культуральную жидкость захолаживали до температуры (20±5)°C и фильтровали через фильтр с размером пор фильтрующего материала 300 мкм. Концентрирование С. resinae 173 осуществляли на сепараторе при частоте вращения барабана 5000 об⋅мин^-1, скорости подачи культуральной жидкости - (150±5)дм³⋅ч^-1. Лиофильное высушивание концентрированной споровой суспензии С. resinae 173 с добавлением 25% от ее объема лактозо-желатиновой защитной среды, содержащей 10% лактозы, 3% желатина и 1% агара микробиологического, осуществляли с помощью сублимационной сушильной установки, замораживая биоматериал до температуры минус (52±2)°C в течение (75±15) мин с последующим поэтапным повышением температуры от минус 50 до плюс 25°C с шагом 10°C. Продолжительность сушки - 38 ч. Высушенный компонент измельчали в шаровой мельнице при частоте вращения роликов 180 об⋅мин^-1. Продолжительность измельчения составляла 10 мин. Результаты приготовления трех серий сухого биокомпонента на основе С. resinae 173 комбинированного экобиопрепарата приведены в таблице 5.

Культивирование В. subtilis 3/105 проводили в ферментерах вместимостью 700 дм³ с коэффициентом заполнения 0,5 на питательной среде №5 на основе солянокислотного гидролизата соевой муки при температуре (37±1)°C с постоянной подачей стерильного воздуха на аэрацию (75±2) дм³⋅мин^-1 и постоянным перемешиванием при частоте вращения мешалки 400 об⋅мин^-1 в течение (28±3) ч. Затем культуральную жидкость захолаживали до температуры (12±3)°C и передавали на концентрирование на сепараторе при частоте вращения барабана сепаратора 9000 об⋅мин^-1. Скорость подачи культуральной жидкости составляла 150 дм³⋅ч^-1. Лиофильное высушивание концентрированной споровой суспензии В. subtilis 3/105 с добавлением 33% от ее объема сахарозо-желатиновой среды, содержащей 40% сахарозы и 4%, осуществляли с помощью сублимационной сушильной установки, замораживая биомассу до температуры минус (32±2)°C с последующей выдержкой в течение 6 ч. Затем температурный режим сушки регулировали подводом тепла к материалу от минус 30°C до плюс 30°C с шагом 2,5°C⋅ч^-1. Биоматериал досушивали при температуре (30±3)°C в течение 9 ч. Продолжительность процесса сушки составила 59 ч. Измельчение лиофильно высушенной биомассы В. subtilis 3/105 осуществляли в шаровой мельнице при частоте вращения роликов 180 об⋅мин^-1 в течение 10 мин. Результаты приготовления трех серий сухого биокомпонента на основе В. subtilis 3/105 комбинированного экобиопрепарата представлены в таблице 6.

Пример 2. Мицелиальные отходы производства гентамицина сульфата в количестве (740±10) кг отжимали на прессошнековом сепараторе FAN PSS 3,2-520 до достижения влажности не более 75%. Скорость подачи мицелиальных отходов составляла 30 м³⋅ч^-1. Затем проводили термическую обработку мицелиальных отходов в проходном автоклаве при температуре (120±1)°C в течение (30±1)мин. Содержание гентамицина в отходах после термообработки не должно превышать 75,5 мкг⋅г^-1. Наличие посторонней микрофлоры и культуры Micromonospora purpurea var. violacea производственного штамма 7R продуцента гентамицина не допускается. Результаты контроля компоста после термоинактивации приведены в таблице 7.

Пример 3. Процесс утилизации мицелиальных отходов методом компостирования проводили поэтапно. На первом этапе, с целью деструкции гентамицина и создания в отходе концентрации микромицета С. resinae 173 не менее 7⋅10⁶ КОЕ⋅г^-1, в (740±10) кг термически обработанных мицелиальных отходов вносили 6,1 кг сухого, разведенного в 7,0 дм³ водопроводной воды, биокомпонента С. resinae 173. Компостирование осуществляли в буртах высотой 0,4-0,5 м под полиэтиленовой пленкой при температуре (27,5±2,5)°C в течение 14 сут, аэрируя перерабатываемый субстрат технологическим воздухом в течение первых 10 сут, и проводя рыхление верхнего слоя отхода высотой 10-15 см. Расход воздуха на аэрацию составил 6 м³⋅сут^-1. В полученном компосте контролировали влажность и содержание гентамицина. Результаты первого этапа компостирования представлены в таблице 8.

На втором этапе, для утилизации органической составляющей мицелиальных отходов и создания в перерабатываемом отходе концентрации бацилл не менее 5⋅10⁷ КОЕ⋅г^-1, в субстрат вносили 0,5 кг сухого, разведенного в 2,0 дм³ водопроводной воды, биокомпонента на основе В. subtilis 3/105. Процесс компостирования осуществляли в буртах высотой 0,4-0,5 м под полиэтиленовой пленкой при температуре (37,5±2,5)°С в течение 14 сут, аэрируя перерабатываемый субстрат технологическим воздухом в течение первых 10 сут и проводя рыхление верхнего слоя отхода высотой 10-15 см. Расход воздуха на аэрацию составил 6 м³⋅сут^-1. После завершения процесса биокомпостирования проводили термоинактивацию компоста в проходном автоклаве при температуре (130±2)°C в течение (90±1) мин. Затем в компосте определяли содержание общего и аминного азота, водородный показатель, влажность, содержание гентамицина и стерильность. Результаты контроля представлены в таблице 9.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявленный способ обеспечивает полную утилизацию гентамицина в мицелиальных отходах на 14 сут компостирования и биодеструкцию органической составляющей мицелия на 28 сут процесса переработки, позволяет сократить продолжительность компостирования и исключить попадание антибиотика и микроорганизмов компостной микрофлоры с приобретенной антибиотикорезистентностью в окружающую среду.

Способ переработки мицелиальных отходов производства гентамицина сульфата

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Способ утилизации мицелиальных отходов промышленности антибиотиков: патент 2115637 (RU): МПК⁷ С05F 1/00, С05F 11/08, А01K 67/033 / A.M. Голубятников (RU), М.И. Голубятников (RU); заявитель и патентообладатель (RU) Производственно-коммерческое научно-конструкторское товарищество с ограниченной ответственностью «Экология»; заявл. 08.08.1995; опубл. 20.07.1998.

2. Verfahren zur Herstellung von penicillinfreien Myzelmassen aus fermentativ gebildeten Penicillinproduktionskulturen und ihre Verwendung als Tierfutter und : патент ЕР N 0060407: A23K 3/03, С12S 3/00, A23K 3/04, C12R 1/80, С12N 1/14, С12N 1/20, С05F 11/08, C12N 1/00 / Hildegard Ebert, Richard Dr. Kreutzfeldt, заявитель Hoechst Aktiengesellschaft; заявл. 19.02.1982; опубл. 12.12.1984.

3. Способ утилизации мицелиальных отходов: патент 2205164 (RU): МПК⁷ С05F 9/04 / Ю.Н. Орлов (RU), С.А. Полюдов (RU), О.Н. Елисеева (RU), Т.И. Лахно (RU); заявитель и патентообладатель (RU) ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ; заявл. 09.06.2000; опубл. 20.10.2002.

4. Федеральный классификационный каталог отходов / в ред. Приказов Росприроднадзора от 28.04.2015 г. №360, от 20.07.2015 г. №585.

5. Правила надлежащей производственной практики (GMP) / Утв. приказом Минпромторга России от 14 июня 2013 г. №916.

6. Каталог продукции FAN SEPARATOR [Электронный ресурс]. - Режим доступа: www.transfair.ru.

7. Билай В.И. Рост грибов на углеводородах нефти / В.И. Билай, Э.З. Коваль. - Киев: Наукова Думка, 1980. - С. 166-171.

8. Bushnell I.D. The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms / I.D. Bushnell, H.F. Haas. - Biochemistry, 1941. - p. 394-404.

9. Микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений: патент 2313498 (RU): МПК⁷ С02F 3/34, С12N 1/26. / Ф.М. Хабибулина (RU), В.А. Терехова (RU); заявитель и патентообладатель (RU) Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; заявл. 10.08.2005; опубл. 27.12.2007.

10. Willets A.J. Microbial metabolism of alkylbenzenesulphonates [Text] / A.J. Willets. - Journal of microbiology and serology. - 1973.

11. Куликова H.A. Использование базидиальных грибов в технологиях переработки и утилизации техногенных отходов: фундаментальные и прикладные аспекты / Н.А. Куликова, О.И. Кляйн // Прикладная биохимия и биотехнология. - 2011. - том №47. - С. 619-634.

12. Мир растений / под ред. А.Л. Тахтаджан. - М.: Просвещение, 1991. - Т. 2. Грибы. - С. 385-387.

13. Коваль Э.З. Микодеструкторы промышленных материалов / Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко. - Киев: Наукова Думка, 1989. - С. 147-158.

14. Билай В.И. Основы общей микологии / В.И. Билай. - Киев: Выща школа, 1989. - С. 366-370.

15. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. журн. - 1990. - Т. 52, №1. - С. 9-14.

16. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982 - С. 230-244.

17. Гатаулин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков: дисс... канд. биол. наук: 03.00.07 / Гатаулин Айрат Гафуанович. - М., 2005. - 131 с.