Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения комплекса технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей

Изобретение относится к области фармацевтической химии, в частности к составам и способам получения радиоактивных препаратов медицинского назначения для радионуклидной диагностики нейроэндокринных опухолей.

Известен способ получения комплекса ^99mTc-HYNIC-TOC технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей (Laura T.U.H. Melero, Emiko Muramoto and Elaine Bortoleti de Araujo. Preliminary studies of EDDA-Tricine-Hynic-[Tyr³]octreotide labeled with technetium-99m: radiopharmaceutical development for the diagnostic of neuroendocrine tumours // 2007 International Nuclear Atlantic Conference - INAC 2007 Santos, SP, Brazil, September 30 to October 5, 2007 BRASILEIRA DE ENERGIA NUCLEAR - ABEN ISBN: 978-85-99141-02-1), выбранный в качестве прототипа, включающий введение в реакционный сосуд последовательно 20 мкг октреотида, модифицированного хелатирующим агентом Hynic, производного соматостатина в 10%-ном растворе этанола, 10 мг этилендиамин-n,n'-диуксусной кислоты (EDDA) в 0,1 н. растворе NaOH, 20 мг трицина в 0,2 н. растворе натриевого фосфатного буфера с рН 6,2, 15 мкг SnCl₂⋅2H₂O в 0,1 н. растворе HCl и 1110 МБк TcO₄^- и кипячение полученной смеси на водяной бане. Радиохимическая чистота готового продукта составила 92,12%.

Недостатки этого способа:

- препарат до введения в него радиоизотопа технеция-99м находится в жидкой фазе, что ограничивает его срок годности;

- для модификации октреотида хелатирующим агентом HYNIC используется большое количество вспомогательных веществ;

- кипячение радиоактивного препарата в течение 10 минут в кипящей водяной бане является особо радиационно-опасной работой.

Техническая проблема, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в разработке способа получения комплекса технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей, позволяющего уменьшить количество радиационно-опасных технологических операций.

Предложенный способ получения комплекса технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей так же, как в прототипе, включает использование октреотида, модифицированного хелатирующим агентом, добавление олова(II) дихлорида дигидрата, связывание полученного реагента с технецием-99м.

Согласно изобретению октреотид модифицируют хелатирующим агентом сукцинимид-1-ил-6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом в среде диметилформамида в присутствии триэтиламина при комнатной температуре в течение не менее 24 ч при перемешивании. Полученный раствор очищают полупрепаративно, используя жидкостную хроматографию. Методом лиофилизации проводят отгонку летучих растворителей и высушивание. К октреотиду, модифицированному хелатирующим агентом, добавляют цитрат натрия и олова(II) дихлорида дигидрат, смешивают их, получают жидкий реагент, который стерилизуют фильтрацией и лиофилизируют с предварительной заморозкой до -50°С. Затем добавляют к полученному лиофилизату натрия пертехнетат с концентрацией технеция-99м 1 ГБк/мл и инкубируют в течение не менее 30 мин при комнатной температуре.

Полученный комплекс технеция-99м с DPAH-модифицированным октреотидом имеет следующую формулу:

где DPAH - хелатирующий центр, способный образовывать комплекс с технецием-99м и связанный амидной связью с α-аминогруппой фенилаланина.

Модификация октреотида сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом является по своей сути синтезом амидной связи, протекающим в кинетической области, и скорость ее реакции прямо пропорциональна температуре, концентрации и давлению, поэтому при комнатной температуре с соблюдением стехиометрических концентраций при атмосферном давлении для максимального выхода модифицированного октреотида требуется 24 ч при условии поддержания однородности реакционной смеси.

При использовании хелатирующего агента HYNIC, как и в прототипе, для получения прочной связи в комплексе с технецием-99м, имеющим высокую радиохимическую чистоту, необходимо проводить радиационно-опасную технологическую операцию - кипячение продукта в течение 10 минут. Исключить данную операцию удалось за счет использования сукцинимид-1-ил-6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата, при котором высокая радиохимическая чистота достигается инкубированием при комнатной температуре в течение не менее 30 мин - времени, достаточного для связывания технеция-99м с хелатирующим центром (DPAH). Увеличение температуры способствует также увеличению скорости протекания несколько нежелательных параллельных и последовательных реакций, связанных с разложением хелатирующего агента, в результате, кроме комплекса технеция-99м с октреотидом, получаются побочные продукты. Увеличение времени инкубирования до 40-50 минут неэффективно ввиду малого срока жизни изотопа технеция-99м.

В прототипе при получении комплекса технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей при взаимодействии семивалентного технеция-99м с двухвалентным оловом в водной среде происходит дополнительное образование коллоида типа (-O-TcO-O-SnCl₂-O-ТсО-)_n, где n=2, 3 - число, зависящее от рН раствора. Образование коллоида происходит также вследствие гидролиза избытка вводимого в реакционную смесь SnCl₂ и, как следствие, ведет к увеличению содержания гидролизованного ^99mTcO₂, адсорбированного на коллоиде, что приводит к нецелевому накоплению радиоактивности в печени при радиодиагностических процедурах. Устранение этого эффекта достигнуто путем предложенной лиофилизации реагента при низких температурах, сохраняющей его структурную целостность и биологическую активность, и уже введения радиоизотопа технеция-99м, содержащегося в физиологическом растворе, в лиофилизат, а не в жидкий реагент, как в прототипе.

Предлагаемый способ получения комплекса технеция-99м с октреотидом для диагностики нейроэндокринных опухолей позволяет получать продукт с высокой радиохимической чистотой (более 96%).

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в повышении радиохимической чистоты и выхода комплекса технеция-99м с октреотидом и удобстве приготовления комплекса для практического применения медицинским персоналом в условиях больницы без использования дополнительного оборудования (мешалка, шейкер, вортекс, качалка).

Пример 1. В реакционном сосуде, снабженном мешалкой, 9,8⋅10^-3 ммоль октреотида (производитель АО «Фарм-Синтез») растворили в 2 мл диметилформамида, добавили 0,1 ммоль триэтиламина, 0,049 ммоль сукцинимид-1-ил-6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата и выдержали при комнатной температуре в течение 24 часов при периодическом перемешивании. По окончании синтеза отобрали пробу и провели контроль полученного полупродукта методом ВЭЖХ на хроматографе Ultimate 3000 (время выхода продукта R_f=13,29 мин, колонка С18(2) Luna 5 мкм, 100 , 250×4.6 мм, градиент концентрации: 0 мин 100% А (0% В), 5 мин 80% А (20% В), 10 мин 65% А (35% В), 15 мин 50% А (50% В), 25 мин 20% А (80% В), 30 мин 0% А (100% В), 32 мин 95% А (5% В), где система А - 0,1% TFA и система Б - 0,1% TFA/ацетонитрил, скорость потока 1 мл/мин). Затем провели очистку полученного полупродукта полупрепаративно с использованием системы ВЭЖХ Ultimate 3000 с системой сбора фракций (колонка С18(2) Luna 10 мкм, 100 , 250×10 мм, градиент концентрации 0 мин 100% А (0% В), 5 мин 80% А (20% В), 10 мин 65% А (35% В), 15 мин 50% А (50% В), 25 мин 20% А (80% В), 30 мин 0% А (100% В), 32 мин 95% А (5% В), где система А - 0,1% TFA и система Б - 0,1% TFA/ацетонитрил, скорость потока 12 мл/мин). По окончании очистки фракции, соответствующие целевому продукту, объединили и определили выход DPAH-модифицированного октреотида (молекулярный вес m/z=1314,4), который составил 60,15%. Отгонку летучих растворителей и высушивание DPAH-модифицированного октреотида проводили методом лиофилизации в лиофильной сушке типа FreeZone 2,5L. Лиофилизат DPAH-модифицированного октреотида имеет следующую структуру:

Затем готовили лиофилизат на основе полученного DPAH-модифицированного октреотида технецием-99м. Во флакон вместимостью 10 мл внесли 100 мкл DPAH-модифицированного октреотида с концентрацией 0,2 мг/мл (20 мкг), добавили 80 мкл цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл (8 мг) и 60 мкл свежеприготовленного раствора олова(II) дихлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл (0,42 мг). Полученную смесь стерилизовали через фильтр Steriflip-GP Filter Unit. 0,22 мкм во флакон вместимостью 10 мл. После этого флакон поместили в лиофильную сушку FreeZone 2,5L и провели предварительную заморозку смеси до температуры -50°С, а затем лиофилизировали до полного удаления влаги.

После извлечения флакона из сушки к полученному лиофилизату добавили 2 мл натрия пертехнетата с содержанием технеция-99м 2000 МБк и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

Выход реакции мечения - радиохимическую чистоту полученного продукта - оценивали методом тонкослойной хроматографии в ацетоне и смеси C₂H₅OH:25%NH₄OH:H₂O (2:1:5) с последующим изучением распределения активности технеция-99м по длине радиохроматограмм. Радиохимическую чистоту меченого продукта рассчитывали по разнице общей активности технеция-99м в пробе препарата и суммы концентраций невосстановленных пертехнетат ионов и коллоида гидролизованного технеция-99м (С_ГТ). Расчеты, сделанные по этим радиохроматограммам, показали, что общее содержание примесей невосстановленных пертехнетат ионов и гидролизованного технеция-99м в препарате составляет 3,8%, а его радиохимическая чистота - 96,2%.

Полученный в результате проведенных операций комплекс технеция-99м с DPAH-модифицированным октреотидом имеет следующий состав: технеция-99м - 1,0 ГБк/мл, DPAH-модифицированного октреотида - 10 мг/мл, олова(II) дихлорида дигидрата - 0,21 мг/мл, натрия цитрата - 4,0 мг/мл.

Пример 2. Получение комплекса технеция-99м с октреотидом проводили так же, как и в примере 1, с тем отличием, что лиофилизацию смеси DPAH-модифицированного октреотида, цитрата натрия и олова(II) дихлорида дигидрата осуществляли без предварительного замораживания. Отсутствие стадии предварительной заморозки снизило радиохимическую чистоту до 89,0%, что хуже, чем в примере 1 и прототипе.