Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ XC 22-А ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ HELICOVERPA ARMIGERA HBN., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для гусениц хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем томатов, хлопчатника и многих других (порядка 120) важнейших сельскохозяйственных культур.

Применение биологических средств защиты растений является экономически и экологически оправданными. В отличие от химических инсектицидов, вирусы вызывают гибель только гусениц хлопковой совки, не оказывая негативного воздействия на другие виды животных (позвоночных и насекомых). Кроме того, стоимость получения вируса в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается вполне сравнимой со стоимостью используемых в настоящее время химических препаратов.

Известен ряд химических инсектицидов, используемых для борьбы с хлопковой совкой. Например, известны препараты «Децис профи» и «Каратэ Зеон», однако они оказывают негативное влияние не только на вредителей, но и на человека и теплокровных животных. К тому же использование этих инсектицидов приводит к быстрому формированию резистентности у вредителя.

Известен ряд биопрепаратов, используемых для борьбы с хлопковой совкой, например, «Лепидоцид» и «Битоксибациллин», однако, они обладают недостаточной эффективностью (76-81%), применение их лимитируется температурами выше +30°C.

Известен штамм ВЯП ХС-2, на основе которого получают препарат Вирин ХС-2 (ТУ 10.01.41-91). Он вызывает специфически направленную гибель хлопковой совки, безвреден для других животных, нетоксичен.

Однако указанный штамм имеет недостаточную инсектицидную активность, требует двукратных обработок посевов. Эффективность достигает 77%.

Известен также штамм вируса ядерного полиэдроза ХС-17, который депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером VB-06 (патент РФ №2359031, МПК C12N 7/00, опубл. 20.06.2009). Штамм ХС-17 получен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории. Однако штамм ВЯП ХС-17 также обладает недостаточной биологической эффективностью по отношению к хлопковой совке.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм вируса ядерного полиэдроза ХС-18, который депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером VB-607 (патент РФ №2511042, МПК C12N 7/00, A01N 63/00, опубл. 10.04.2014) и используется для получения инсектицидного препарата. Штамм характеризуется высокой инсектицидной активностью по отношению к хлопковой совке.

Технической задачей изобретения является выявление нового штамма вируса ядерного полиэдроза с высокой инсектицидной активностью по отношению к хлопковой совке для получения инсектицидного препарата, позволяющего расширить арсенал средств защиты растений от экономически значимых вредителей.

Указанный технический результат достигается тем, что выделен штамм ХС_М 22-А вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn., депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-710 и используемый для получения инсектицидного препарата.

Происхождение заявляемого штамма ХС_М 22-А. Вирус ядерного полиэдроза хлопковой совки ХС_М 22-А получен в лаборатории химической коммуникации и массового разведения насекомых Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийского научно-исследовательского института биологической защиты растений» (ФГБНУ ВНИИБЗР), г. Краснодар, в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях томатов полевой экспериментальной базы ФГБНУ ВНИИБЗР и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории. Со времени выделения исходного изолята до времени патентования штамм ХС_М 22-А прошел 22 пассажа на гусеницах хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. лабораторной популяции при пероральном заражении.

Идентификацию штамма вируса осуществляли на основе сравнительной оценки формы, размеров и плавучей плотности вирусных телец-включений в инокулируемой суспензии и в полученном урожае после инкубации на гусеницах хозяина.

Морфологическое описание. ДНК - двухспиральная. Вирусные частицы (вирионы) - палочковидные (350×50 ммк). Тельца-включения полиэдры - субсферические, правильной формы многогранники ∅=3-7 мк, располагаются группами в гипертрофированных ядрах зараженных клеток. Оптимальной культурой для размножения штамма являются гусеницы среднего возраста Helicoverpa armigera Hbn.

Штамм обладает высокой репродукционной активностью: выход вируса составляет (2-3)×10¹⁰ полиэдров на гусеницу при его культивировании на гусеницах хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. 3-4 возраста.

Высоко патогенен исключительно для вида Helicoverpa armigera Hbn. (хлопковая совка) и абсолютно безопасен для других видов животных, включая класс Insecta (Насекомые). Биологическая активность: ЛД_90(ср)≈1,7×10⁵ ПЭ, ЛД_50(ср)≈1,7×10³ ПЭ, ЛТ_90(ср)≈8 сут.

Культивирование вируса. Штамм бакуловируса ХС_М 22-А размножают путем инокуляции суспензии из вирусных телец включений в порцию искусственной питательной среды (ИПС) и скармливания гусеницам 3-4 возраста. Зараженных насекомых инкубируют при температуре +26-28°C и влажности 60%. Сбор наработанных личиночных эквивалентов вирусного штамма производят по мере гибели объектов - обычно через 4-5 суток в течение 10-12 дней. Состав ИПС: семена фасоли - маша 200 г, агар-агар 10 г, автолизат пивных дрожжей - 40 г, аскорбиновая кислота - 5 г, метабен (метиловый эфир пара-оксибензойной кислоты) - 2 г, формалин 20% - 2,4 мл, дистиллированная вода до 1 кг. Срок хранения при 4°C - 15 суток (Успенская, Хлистовский, 1970).

Чувствительность к химическим веществам. Белок полиэдров устойчив к действию протеолитических ферментов (изоэлектрическая точка ≈ pH 5,6), но растворяется в щелочах. Вирусные частицы (вирионы) чувствительны к агентам, вызывающим денатурацию белка: анионным детергентам, хлороформу, эфиру, мочевине и гуанидину, перикисям, азотистой кислоте, веществам типа этиловых эфиров этан- и метансульфоновых кислот, β-протиолактону, формальдегиду. Не чувствительны к ацетону.

Белок вирионов расщепляется протеолитическими ферментами, но устойчив к действию нуклеаз.

Вирус инактивируется под действие инсоляции (УФ-лучей) и нагревания до +60-70°C.

Серологические свойства. Белки полиэдров являются хорошими антигенами. При передаче другим насекомым белки полиэдров, образуемых данным вирусом у других насекомых, серологически идентичны.

Условия длительного хранения штамма. Лиофильное высушивание, а также высушивание гусениц на воздухе и дальнейшее хранение при -20°C, при +4°C или при комнатной температуре.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения жидкой суспензии штамма ХС_М 22-А

Технология производства вирусов ядерного полиэдроза in vivo осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и очистка полиэдров.

Отродившихся из яиц гусениц хлопковой совки (Helicoverpa armigera Hbn.) доращивают до третьего возраста и инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм ХС_М 22-А). Для этого искусственную питательную среду (ИПС) в чашках Петри (ЧП) диаметром 90 мм (по 25 мл в одной ЧП) опрыскивают водной суспензией штамма ХС_М 22-А из расчета 1 мл с титром 1,7×10⁴ полиэдров на 60 кв. см поверхности и скармливают зараженную ИПС гусеницам хлопковой совки (ХС) примерно 0,2 г на 1 гусеницу. Инфицированных таким образом гусениц ХС содержат при температуре 26±2°C и влажности 60%. Время инкубирования инфицированных гусениц 10-12 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 90%. Затем личинок собирают с помощью вакуумного насоса с давлением (8,7±0,1)×10⁴ Па в посуду из толстостенного стекла, добавляют раствор диэтилкарбоната натрия до конечной концентрации 0,1% и хранят при температуре +5-+10°C не более года, для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм. Затем из фильтрата осаждают крупные остатки тканей центрифугированием в течение 0,5 мин при 500 об/мин. Из супернатанта осаждают вирус двойным центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин.

Осадок ресуспендируют в малом объеме 50% раствора глицерина. Титр живых вирусов в полученной суспензии составляет не менее 2×10¹⁰ полиэдров/мл.

Для получения сухой формы осадок высушивают на лиофильной установке. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок бежевого цвета. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 2×10¹¹ полиэдров/мл.

Пример 2. Сравнительные данные биологической (инсектицидной) активности заявляемого штамма ХС_М 22-А и штаммов аналогов.

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал известных штаммов ВЯП ХС-2, ХС-17, ХС-18 и заявляемого штамма ХС_М 22-А.

Биологическую активность известных и заявляемого штаммов оценивали путем определения величины ЛД₅₀ - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и ЛВ₅₀ время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10⁵ полиэдров на гусеницу (пэ/гусеницу). Расчет проводили по методу Кербера, гибель насекомых определяли с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с. 82-93). Данные приведены в таблице 1.

Анализ данных таблицы 1 показывает, что заявляемый штамм ХС_М 22-А патогенен для гусениц хлопковой совки, причем его активность превышает активность известных штаммов ВЯП ХС-2, ХС-17, ХС-18.

Пример 3. Исследование токсичности и патогенности вирусного штамма ХС_М 22-А.

Проведена медико-токсикологическая оценка вируса ядерного полиэдроза - штамм ХС_М 22-А. Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с «Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г.» и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева, 1975 г. по испытанию биобезопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности ВЯП-штамм ХС_М 22-А на мышах. Пяти группам мышей (массой 18-20 г) по 10 в каждой, отмытых в физиологическом растворе и прогретых при 70°С в течение 10 мин., вводили суспензию вируса с титром 2×10⁹ в желудок и брюшину из расчета по 1 мкл вирусной суспензии на 1 г веса. Контрольной группе вводили раствор 0,9% NaCl по 0,2 мл.

Установлено, что введение дозы 1 мкл на 1 г или 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок, ни при внутрибрюшинном введении. Термометрия, взвешивание, гематологические исследования живых мышей не выявили существенных отклонений от физиологической нормы. Серологические исследования, проведенные иммуноферментным методом, не выявили специфического бакуловирусного антигена ВЯП ХС в крови и органах животных на 28 день обследования.

Кожно-резорбтивное действие изучалось на мышах, на лишенных шерсти участках кожи, при разовом и многократном нанесении суспензии штамма ХС_М 22-А на неповрежденную и скарифицированную кожу. Контрольным группам наносили 0,9% NaCl.

Было установлено, что во всех случаях однократное нанесение не вызывало заметных местных или общих реакций у животных при воздействии всеми испытуемыми материалами. Также не выявлено отклонений от показателей в опытных группах при термометрии или взвешивании животных в течение 14 дней. Многократное нанесение на скарифицированную кожу сопровождалось местной реакцией раздражения, которое проходило через 2-3 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия вируса на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюктивитов. Выздоровление начиналось через 3-4 дня после последнего воздействия.

В результате проведенных исследований установлено, что вирусный антиген в крови и во внутренних органах теплокровных животных не накапливается и обычно элиминируется из организма к 7-14 дню после введения. Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного штамма ХС_М 22-А показали, что он не токсичен для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 4. Использование заявляемого штамма ХС_М 22-А в инсектицидном препарате.

Исследования по оценке биологической эффективности препарата в регуляции численности хлопковой совки проводили на томатах открытого грунта и кукурузе.

Испытания проводили в условиях экспериментального специализированного семипольного травяно-овощного севооборота и сопредельных коллекционных и производственных посевов томатов на территории ФГБНУ ВНИИ риса - отдел овоще- и картофелеводства (г. Краснодар). Все учеты проводились в соответствии с «Методическими указаниями по регистрационным испытаниям инсектицидов, акарицидов, моллюскоцидов и родентицидов в сельском хозяйстве, Санкт-Петербург, 2009 г., 321 с».

Препарат используется в виде жидкой суспензии, полученной в соответствии с примером 1. Схема применения препарата приведена в таблицах 2 и 3.

Таким образом, штамм ХС_М 22-А вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. является новым, с высокой инсектицидной активностью по отношению к хлопковой совке и пригоден для получения инсектицидного препарата, позволяющего расширить арсенал средств защиты растений от экономически значимых вредителей.