СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ РОДА BETULA L.

Изобретение относится к области лесного хозяйства, в частности к способам идентификации хозяйственно-ценных древесных пород.

Известен способ диагностики узорчатой древесины карельской березы, по которому в однолетних сеянцах потомства карельской березы в фазе глубокого покоя определяют активность пероксидазы лубяной ткани. О наличии признаков узорчатости древесины судят по скорости проявления активности пероксидазы, которая находится в обратно пропорциональной зависимости с признаком узорчатости (патент РФ №2063679, 1996).

Недостатком этого способа является то, что при отборе лубяной ткани для анализа нарушается целостность органов растения, а также то, что этот способ не позволяет отличить березу повислую от березы пушистой. Пероксидаза (ЕС 1.11.1.7) является функционально очень лабильным ферментом, реагирующим на изменения окружающей среды и стрессовые ситуации, что снижает достоверность оценки и создает дополнительные сложности при видовой идентификации березы.

Наиболее близким по совокупности признаков, принятым за прототип, является способ идентификации видов березы, согласно которому в течение годичного цикла развития почек ежемесячно отбирают почки березы, исследуют в них суммарные липиды и их жирнокислотный состав. Березу пушистую отличают по повышенному содержанию суммарных липидов и низкому уровню ненасыщенных жирных кислот в почках по сравнению с березой повислой в течение годичного цикла их развития (Ветчинникова Л.В. Береза: Вопросы изменчивости (морфо-физиологические и биохимические аспекты). М.: Наука, 2004. С. 106; с. 108).

Недостатком известного способа является то, что для идентификации видов березы необходимо проводить анализ липидов в течение длительного срока - годичного цикла развития почек, что повышает трудоемкость способа. Способ имеет недостаточную точность выявления видов, поскольку не включает анализ фракций суммарных липидов. Кроме того, способ не позволяет во все сроки годичного цикла развития почек отличить березу пушистую от березы повислой и не позволяет идентифицировать карельскую березу. Недостатком является также то, что отбор почек осуществляют ежемесячно однократно без учета фазы развития почек. Однако время наступления фаз по месяцам в отдельные годы может сдвигаться в зависимости от климатических и экологических условий. В способе предлагается идентификация по абсолютным значениям липидных компонентов в почках березы, которые могут изменяться в зависимости от климатических и экологических факторов.

Задача: разработка эффективного способа видовой идентификации растений рода Betula L., обеспечивающего расширение диапазона идентификации растений при снижении трудоемкости.

Техническим результатом является повышение точности идентификации березы пушистой, березы повислой, а также идентификация карельской березы в предшествующий активной вегетации период при снижении трудоемкости за счет сокращения времени на видовую идентификацию березы.

Технический результат достигается тем, что в способе идентификации растений рода Betula L., включающем отбор почек растений березы для анализа суммарных липидов и их жирнокислотного состава, согласно изобретению отбор почек проводят в весенний период по четырем фазам их распускания: набухания, разверзания, раскрытия, молодых листьев размером до 10 мм, из жирных кислот определяют содержание линоленовой, пальмитиновой, стеариновой, дополнительно определяют содержание фракций суммарных липидов - нейтральных липидов, гликолипидов, фосфолипидов, определяют массовое соотношение липидных компонентов последовательно по фазам распускания почек, принимая за 1.0 их уровень в фазу набухания, и идентифицируют березу пушистую при массовом соотношении нейтральных липидов - 1.0:0.5:0.6:0.7, гликолипидов - 1.0:1.0:1.4:0.9, фосфолипидов - 1.0:0.9:2.9:0.9, линоленовой кислоты - 1.0:1.2:1.2:1.3, стеариновой кислоты - 1.0:0.9:0.5:1.4, идентифицируют березу повислую при массовом соотношении нейтральных липидов - 1.0:0.8:1.2:0.6, линоленовой кислоты - 1.0:1.0:0.8:0.8, пальмитиновой кислоты - 1.0:1.4:2.3:2.1, стеариновой кислоты - 1.0:0.9:1.9:2.0, идентифицируют карельскую березу при массовом соотношении суммарных липидов - 1.0:1.1:1.1:1.0, нейтральных липидов - 1.0:0.7:0.9:0.7, линоленовой кислоты - 1.0:0.9:1.0:1.1, стеариновой кислоты - 1.0:1.0:1.3:1.0.

Способ осуществляли следующим образом.

Исследовали вегетативные почки 10-летних растений березы пушистой (Betula pubescens Ehrh.), березы повислой (Betula pendula Roth) и карельской березы (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) ), произрастающих на опытных участках агробиологической станции Института леса Карельского научного центра РАН, в черте города Петрозаводска. В 2008 г. почки с трех берез каждого варианта отбирали с боковых побегов средней части кроны, южной экспозиции. Даты отбора устанавливали в соответствии с фазами распускания почек (Юркевич И.Д., Гельтман B.C., Ловчий Н.Ф. Березовые леса Беларуси: типы, ассоциации, сезонное развитие и продуктивность. Минск: Навука i тэхнiка, 1992. 183 с.): I фаза набухания почек - почки заметно увеличились в размерах, 29 апреля, II фаза разверзания почек - в верней части почек появился конус молодых листьев, 07 мая, III фаза раскрытия вегетативных почек - молодые листья сложены в трубочку, 12 мая, IV фаза молодых листьев размером до 10 мм - происходит обособление молодых листьев, поверхность листьев складчатая, видны черешки, 20 мая. Для выявления березы повислой и березы пушистой в предшествующий проведению эксперимента вегетационный период были использованы морфологические показатели - форма и опушение листьев, наличие бородавочек или опушения на ауксибластах (побегах текущего года). Карельскую березу выявляли по форме ствола (наличие характерных вздутий, неровностей, крупных бугорков и бугорчатых выпуклостей). Была выявлена высокая степень узорчатости текстуры древесины (Ермаков В.И. Механизмы адаптации березы к условиям севера. Л.: Наука, 1986. 144 с.), но уже после проведения анализа липидов в почках берез, так как метод основан на нарушении целостности ствола.

Дальнейшую работу с отобранными почками проводили в лабораторных условиях. Экстрагировали суммарные липиды из тканей смесью хлороформ: метанол (2:1 по объему) (Folch J., Lees М., Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. N 1. P. 497-509). Разделение суммарных липидов на фракции выполняли методом колоночной хроматографии, где в качестве неподвижной фазы использовали силикагель Davisil Silica gel (mesh) 100-200, а в качестве подвижной фазы систему последовательных растворителей: хлороформ, ацетон, метанол соответственно для экстракции нейтральных липидов, гликолипидов и фосфолипидов. Стандартным весовым методом определяли массу суммарных липидов и их фракций в % от абсолютно сухой массы почек. Суммарные липиды метилировали (Цыганов Э.П. Метод прямого метилирования липидов после ТСХ без элюирования с силикагеля // Лабораторное дело. 1971. №8. С. 490-493) и жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров методом ГЖХ. Проводили идентификацию жирных кислот суммарных липидов почек (Jamieson G.R., Reid Е.Н. The fatty acid composition of fern lipids // Phytochemistry. 1975. V. 14. P. 2229-2232). Авторами экспериментально установлено, что по уровню ненасыщенной жирной кислоты - линоленовой кислоты С18:3 и насыщенных жирных кислот - пальмитиновой С16:0, стеариновой С18:0 можно проводить видовую идентификацию берез. Указанные жирные кислоты характерны для растений, составляют значительную часть их жирных кислот, что позволяет проводить сравнительный анализ липидного состава у трех представителей рода Betula L. Содержание липидных компонентов в почках в I фазу распускания принимали за 1.0 и считали его исходным, содержание в другие фазы выражали в долях от исходного. Математическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel и методов математической статистики. Стандартная ошибка приведенных для идентификации берез данных составляла 5-7%.

Выявленные видовые различия липидного состава почек берез по фазам их распускания в долях от исходного уровня (в I фазе) представлены на фигурах 1-4. На фигуре 1 показано содержание суммарных липидов почек берез; на фигуре 2 - фракций нейтральных липидов (А), гликолипидов (Б) и фосфолипидов (В); на фигуре 3 - линоленовой кислоты (С18:3); на фигуре 4 - пальмитиновой (С16:0) и стеариновой (С18:0) кислот в суммарных липидах почек берез. Обозначения: 1 - Betula pubescens Ehrh.; 2 - Betula pendula Roth; 3 - Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) . По горизонтали - фаза распускания почек; по вертикали - содержание липидных компонентов в долях от их исходного уровня - в I фазу распускания почек, принятого за 1.0.

Анализ представленных на графиках данных показал наличие характерных для березы каждого варианта отличительных особенностей в массовом соотношении липидных компонентов почек по фазам их распускания относительно уровня в I фазе.

Из представленных графиков 2А, Б, В, 3, 4А, Б следует, что березу пушистую характеризует массовое соотношение липидных компонентов в почках по четырем фазам их распускания от I (исходный уровень, принятый за 1.0) к IV фазе: нейтральных липидов - 1.0:0.5:0.6:0.7, гликолипидов - 1.0:1.0:1.4:0.9, фосфолипидов - 1.0:0.9:2.9:0.9, линоленовой кислоты - 1.0:1.2:1.2:1.3, стеариновой кислоты - 1.0:0.9:0.5:1.4. Из представленных графиков 2А, 3, 4А, Б следует, что березу повислую характеризует массовое соотношение нейтральных липидов - 1.0:0.8:1.2:0.6, линоленовой кислоты - 1.0:1.0:0.8:0.8, пальмитиновой кислоты - 1.0:1.4:2.3:2.1, стеариновой кислоты - 1.0:0.9:1.9:2.0. Из представленных графиков 1, 2А, 3, 4А, Б следует, что карельскую березу характеризует массовое соотношение суммарных липидов - 1.0:1.1:1.1:1.0, нейтральных липидов - 1.0:0.7:0.9:0.7, линоленовой кислоты - 1.0:0.9:1.0:1.1, стеариновой кислоты - 1.0:1.0:1.3:1.0.

Установленные различия в массовом соотношении суммарных липидов, их фракций и жирных кислот в распускающихся почках разных берез отражают особенности липидного обмена у них по фазам в период распускания почек и могут служить в качестве видовых индикаторов березы. Следует отметить особую важность заявляемого способа идентификации карельской березы по липидному составу почек, поскольку карельская береза не всегда индивидуально и в онтогенезе отличается по визуальным морфологическим показателям и выявляется лишь при отборе и анализе ткани ствола, что ведет к повреждению растения.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет по массовому соотношению липидных компонентов почек по фазам их распускания, весной, еще до начала активной вегетации, практически без нанесения повреждений растению: расширить диапазон идентификации растений рода Betula L, поскольку позволяет идентифицировать кроме березы пушистой и березы повислой также карельскую березу; повысить точность идентификации березы пушистой и березы повислой; сократить срок их видовой идентификации.

Заявляемый способ предназначен для видовой идентификации растений рода Betula L. при создании целевых насаждений березы в плантациях, на экспериментальных и испытательных участках. Способ обеспечивает гарантию выращивания определенных видов березы, и что особенно важно - карельской березы. Способ повышает эффективность создания промышленных насаждений карельской березы, сокращая затраты на выращивание единицы целевого продукта.