КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА ЧЕЛОВЕКА 485 colo can

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно к полученной новой клеточной линии колоректального рака человека 485 colo can, используемой для создания противоопухолевых вакцин, тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, а также тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

В настоящее время колоректальный рак занимает третье место в мире по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний, и предполагается, что к 2035 году при существующей системе подходов к лечению данного злокачественного новообразования можно ожидать более 2,4 миллионов пациентов с этим видом опухоли [., PisoP. Treatment of peritoneal metastases from colorectal cancer // Gastroenterol Rep (Oxf). - 2015. - Nov; 3(4). - P. 298-302. - doi: 10.1093/gastro/gov044]. Основным методом лечения колоректального рака по-прежнему остается хирургическое вмешательство в сочетании с химио- и радиотерапией, однако пятилетняя выживаемость составляет не более 54% [HuangL., LiT.J., ZhangJ.W. et al. Neoadjuvant chemotherapy followed by surgery versus surgery alone for colorectal cancer: meta-analysis of randomized controlled trials // Medicine (Baltimore) - 2014. - Dec; 93(28). - P.e231. - doi:10.1097/ MD.0000000000000231]. Как известно, актуальной задачей современной онкологии является поиск новых возможностей лечения пациентов с диссеминированными формами злокачественных опухолей. Значительный прогресс в области молекулярной биологии, генетики, иммунологии позволил в последние десятилетия разрабатывать новые более эффективные способы терапии, основанные прежде всего на понимании закономерностей функционирования иммунной системы в условиях опухолевого роста, взаимоотношений и взаимовлияния малигнизированных клеток и их микроокружения.

Один из современных подходов в лечении злокачественных новообразований, в том числе колоректального рака, - это иммунотерапия. Создание противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток (ДК) является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний, так как позволяет активировать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию. Опухолевые антигены, полученные из разрушенных клеток опухоли, в большей степени подходят для нагрузки ДК, так как в этом случае в клетку попадает весь набор опухолеассоциированных антигенов (ОАА) и опухолеспецифических антигенов [Балдуева И.А. Иммунотерапия злокачественных новообразований: взгляд в будущее. Аллергология и иммунология. - 2014. - №4. - С. 266-268].

В качестве носителей ОАА используют аутологичные и аллогенные цельные или лизированные опухолевые клетки, причем каждая опухолевая клеточная линия обладает специфическим уникальным набором ОАА, и расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут стать доступны для таких антигенпрезентирующих клеток как ДК в процессе манипуляций invitro при создании противоопухолевых вакцин, что позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет [MonjazebA.M., HsiaoH.H., SckiselG.D., MurphyW.J. The role of antigen-specific and non-specific immunotherapy in the treatment of cancer // J. Immunotoxicol. - 2012. - Jul-Sep; 9(3). - P. 248-58. - doi: 10.3109/1547691Х.2012.685527].

По данным электронного регистра клинических исследований Национального института здоровья США (www.clinicaltrial.gov) в настоящее время в мире проводится более 200 клинических испытаний I-II-III фаз с использованием ДК в лечении различных онкологических заболеваний, в том числе рака толстой кишки. Однако установлено, что эффективность подобных вакцин зависит от способа активации in vitro ДК, поэтому поиск путей наиболее эффективной активации может быть связан с получением новых опухолевых клеточных линий, богатых ОАА [SpeetjensF.M., ZeestratenE.C, KuppenP.J. et al. Colorectal cancer vaccines in clinical trials // Expert Rev Vaccines. - 2011. - Jun; 10(6). - P. 899-921. - doi: 10.1586/erv.11.63].

Кроме того, исследования опухолей человека, адаптированных к росту in vitro, обладают рядом преимуществ, основанных на возможности получать неограниченное количество клеток для любых исследований, в том числе неосуществимых in vivo; изучать специализированные свойства клеток в строго контролируемых условиях окружающей среды вне коррелятивных влияний целостного организма. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток позволяет проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. В настоящее время работы по приготовлению клеточных линий приобрели систематический характер, однако каждая полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генно-инженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни пациентов при лечении колоректального рака. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия 485 colo can из опухолевого образца колоректального рака человека, экспрессирующая специфические антигены. Полученная клеточная линия 485 colo can обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 740Д.

Клеточная линия выделена из метастаза колоректального рака в передней брюшной стенке больного Ш., 57 л., проходившего лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.

Получение клеточной линии 485 colo can осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30-60 сек. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 30 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 485 colo can характеризуются следующим образом.

Культура представлена мелкими эпителиоидными клетками полигональной или округлой формы, растущими в виде кластеров, содержащих от 20 до 100 клеток. К моменту пересева кластеры сливаются с образованием монослоя. На 37 пассаже 98% клеток экспрессируют Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии 485 colo can следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов HLAA/B/C - 95,8%; HLADQ/DP/DR - 98,2%.

Методом проточной цитометрии определена экспрессия раково-тестикулярных антигенов: NY-ESO-1 и семейств MAGE, ВAGE, GAGE.

Методом иммуноцитохимии выявлена экспрессия опухолеассоциированных антигенов CDX2 и СБА.

Культуральные свойства клеточной линии 485 colo can представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. При субкультивировании клетки снимаются 1 раз в 2 недели в соотношении 1:2 с использованием стандартных растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена (1:1).

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%), DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 75%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 485 colo can следующая.

В результате кариологического анализа выявлено три субклона:

85,XXYY,-8,-9.-10,-13,-14,-15,-15,+ mar

92,XXYY,-2,+3,+3,-7,-8,-8,+9,-11,-14,+19,+22,+22, mar №1 (или der9)

87,XXYY,+X,+Y,+1,-3,4,-4,-8,-9,-9+11,-13,-15,-18,-19,-21,+ mar

Использование клеточной линии 485 colo can представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 485 colo can для приготовления клеточного лизата, используемого для активации in vitro дендритных клеток больного колоректальным раком.

1. Клеточная линия 485 colo can культивировалась в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществлялось при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel»(TermoElectronLTDGmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 485 colo can проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 485 colo can в культуры незрелых дендритных клеток пациента с колоректальным раком на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Икубировали в условиях 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel»(TermoElectronLTDGmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 485 colo can для создания модельной системы, позволяющей оценить чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам.

1. Клеточную линию 485 colo can культивировали как описано выше. После пересева клетки собирали, осуществляли подсчет их количества и оценку жизнеспособности и высевали в 24-луночную планшету (BDFalcon, США) в количестве 50 тыс. клеток на лунку.

2. Аспирировали питательную среду, добавляли к клеткам митохондриальный краситель JC-1 в концентрации 10 мкг на 1 мл физиологического раствора. Инкубировали 15 мин., после чего отмывали от красителя, добавляли свежую среду, содержащую 160, 320, 640 μmo 1/мл фторурацила.

3. Помещали 24-луночную планшету в автоматический клеточный анализатор Cell-IQ (Chip-ManTechnologiesLtd, Финляндия). Наблюдение вели в течение 48 часов.

4. Регистрировали результат воздействия фторурацила по изменению диапазона флуоресценции JC-1, накопившегося в митохондриях клеток линии 485 colo can, с красного спектра на зеленый. Производили подсчет клеток, вступивших в раннюю фазу апоптоза.

Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, способствует повышению эффективности лечения и увеличению продолжительность жизни пациентов при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия 485 colo can может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.